啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬藥物及天然產(chǎn)物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]啤酒花為大麻科潷草屬多年生蔓性草本植物，雌雄異株，主要用于啤酒釀造工業(yè)，但其藥用價(jià)值也不容忽略。其主要活性成分有以潷草酮類和蛇麻酮類為主的樹(shù)脂類成分和其衍生物，黃腐酚、異黃腐酚為代表的多酚類化合物以及以萜烯類和萜烯類氧化物為主的揮發(fā)性風(fēng)味成分。最近研究表明，啤酒花水提取物富含豐富的黃酮苷。
[0003]黃酮苷是一大類天然化學(xué)產(chǎn)物，在植物界分布廣泛。據(jù)研究報(bào)道，它不僅能作為防治心腦血管疾病的藥物，而且有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗衰老、清除自由基，降血脂、降低膽固醇、降血糖，抗癌防癌、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，是一種在人類的營(yíng)養(yǎng)、健康和防治疾病方面有著廣闊應(yīng)用前景的藥物，也是應(yīng)用廣泛的天然抗氧劑和防腐劑，可用于保健食品和化妝品，因此具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。
[0004]具有抗過(guò)敏活性的黃酮苷類物質(zhì)可以用于例如過(guò)敏性皮炎、支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、血管性浮腫、特應(yīng)性疾病、過(guò)敏性接觸性皮炎、花粉病、蕁麻疹等各種過(guò)敏性的預(yù)防或癥狀的緩解?？梢宰鳛槭称诽砑游飺饺氲教囟ū＝∮檬称?、特殊營(yíng)養(yǎng)食物、營(yíng)養(yǎng)輔助食品、健康食品、功能性食品和病人用食品等飲食品中，可以作為化妝品添加物添加到皮膚護(hù)理制品、粉底和彩妝制品等化妝品中。
[0005]具有抗氧化活性的黃酮苷類物質(zhì)可以用于提高機(jī)體抗氧化能力、抵消或吸收自由基、修復(fù)機(jī)體氧化損傷、防治各種老化疾病，例如常見(jiàn)的癌癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、白內(nèi)障、心血管病、老年癡呆、關(guān)節(jié)炎等?？梢杂糜诳寡趸称贰⒖寡趸瘖y品等。
[0006]啤酒花中含有大量的黃酮苷類化合物，但目前國(guó)內(nèi)未見(jiàn)有對(duì)啤酒花中黃酮苷(蘆丁、異槲皮苷)的制備方法及抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)方面的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種從啤酒花中提取蘆丁、異槲皮苷的制備方法及對(duì)其抗過(guò)敏活性、抗氧化性進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)方案。具有工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、收率及純度高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)具有很好的抗過(guò)敏和抗氧化活性的蘆丁、異槲皮苷亦可作為藥物前體進(jìn)行研究，具有很好的藥用價(jià)值與發(fā)展前景。
[0008]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法，包括以下步驟:
(1)原料提取:將啤酒花粉碎成粗粉，按照質(zhì)量體積比(kg/L)加入5倍量的冷水，浸泡12小時(shí)，
期間超聲提取2次，每次30min，過(guò)濾得提取液。共提取2次，合并提取液，濃縮；
(2)初步除雜:將濃縮后得到的提取液依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，其中石油醚萃取一次，乙酸乙酯萃取三次。依次除去葉綠素等脂溶性成分、大極性黃酮苷元、小極性的黃酮苷。再用正丁醇對(duì)提取液進(jìn)行萃取，得正丁醇萃取液，減壓濃縮，得正丁醇稠膏；
(3)大孔樹(shù)脂分離富集:得到的正丁醇稠膏用水溶解，通過(guò)XAD-4大孔樹(shù)脂柱色譜分離富集，依次用蒸餾水和30%、50%、70%、100%乙醇進(jìn)行梯度洗脫。收集50%乙醇部分的洗脫液，減壓濃縮，得到洗脫濃縮液；
(4)反相柱色譜分離純化:將上述得到的流分通過(guò)半制備高效液相色譜儀，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液進(jìn)行洗脫，分別得到蘆丁、異槲皮苷單體。
[0009]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的抗過(guò)敏活性、抗氧化性檢測(cè)，包括以下步驟: 采用透明質(zhì)酸酶體外抑制法對(duì)蘆丁、異槲皮苷進(jìn)行抗過(guò)敏活性檢測(cè)，分析其抗過(guò)敏活性；采用DPPH法對(duì)蘆丁、異槲皮苷進(jìn)行抗氧化性檢測(cè)，分析其抗氧化性。
[0010]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)，其特征在于步驟(I)中，冷水溫度為5?15°C最佳。浸泡階段，4小時(shí)后超聲提取I次，8小時(shí)后超聲提取I次，12小時(shí)后過(guò)濾得提取液。按此方法提取2次，效果最佳。
[0011]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)，其特征在于步驟(2)中，可用水飽和的正丁醇對(duì)提取液進(jìn)行萃取。減壓濃縮階段，當(dāng)正丁醇很難蒸出時(shí)，可以加適量水，以形成共沸。
[0012]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)，其特征在于步驟(3)中，按柱體積的5% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))上樣，每個(gè)梯度洗脫體積為1.5個(gè)柱體積。
[0013]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)，其特征在于步驟(5)中，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(45:55)進(jìn)行洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，流速為 1.0mT,/miη。
[0014]所述的啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法及其抗過(guò)敏、抗氧化活性檢測(cè)，其特征在于步驟(5)中，透明質(zhì)酸酶溶液濃度為1250 uint/mL, DPPH乙醇溶液濃度為400 μ Μ?？惯^(guò)敏實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，測(cè)吸光度時(shí)，波長(zhǎng)設(shè)定為530nm ;抗氧化實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)，測(cè)吸光度時(shí)，波長(zhǎng)設(shè)定為517nm。
[0015]上述啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備方法，具有如下有益效果:啤酒花原料來(lái)源豐富、且廉價(jià)易得，整個(gè)工藝流程簡(jiǎn)單，加工制備的成本低、收率和純度高。同時(shí)具有很好的抗過(guò)敏活性和抗氧化性的蘆丁、異槲皮苷亦可作為藥物前體進(jìn)行研究，具有很好的藥用價(jià)值與發(fā)展前景。
【具體實(shí)施方式】
[0016]現(xiàn)結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和相關(guān)試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017]啤酒花中蘆丁、異槲皮苷的制備
(1)原料提取:取Ikg啤酒花粉碎成粗粉，加入5L冷水浸泡，4小時(shí)后超聲提取I次，超聲時(shí)間為30min ；8小時(shí)后超聲提取I次，超聲時(shí)間為30min，12小時(shí)后過(guò)濾得提取液。按此方法提取2次，合并提取液，過(guò)濾得到澄清提取液，減壓濃縮；
(2)初步除雜:將濃縮后得到的提取液依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，其中石油醚萃取一次，乙酸乙酯萃取三次。依次除去葉綠素等脂溶性成分、大極性黃酮苷元、小極性的黃酮苷。再用正丁醇對(duì)提取液進(jìn)行萃取，得正丁醇萃取液，45°C下減壓濃縮，得正丁醇稠膏； (3)大孔樹(shù)脂分離富集:得到的正丁醇稠膏用水溶解，過(guò)濾后得到總黃酮苷水溶液。取適量XAD-4大孔樹(shù)脂，用95%乙醇浸泡24h，濕法裝柱。用3倍柱體積的95%乙醇洗至流出液與水1:5混合不渾濁，再用水洗至無(wú)醇味。5%HC1通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2?4h，水洗至中性；2%NaOH通過(guò)樹(shù)脂柱，浸泡2?4h ;水洗至中性，備用。將黃酮苷水溶液濃縮，XAD-4大孔樹(shù)脂柱色譜分離富集，依次用蒸餾水和30%、50%、70%、100%乙醇進(jìn)行梯度洗脫。收集50%乙醇部分的洗脫液，減壓濃縮，得到洗脫濃縮液；
(4)反相柱色譜分離純化:將上述得到的洗脫濃縮液通過(guò)半制備高效液相色譜儀，以甲醇-0.1%冰醋酸水溶液(45:55)進(jìn)行洗脫，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm，流速控制在1.0mL/min,得到蘆丁、異槲皮苷單體。
[0018]抗過(guò)敏性實(shí)驗(yàn)
該發(fā)明采用透明質(zhì)酸酶體外抑制法測(cè)定蘆丁、異槲皮苷的抗過(guò)敏功效。
[0019](I)配置蘆丁樣品液:稱取蘆丁 2.5mg，溶于20.492mL DMSO得200 μ M的蘆丁樣品液；取1mL 200 μ M的蘆丁樣品液，用DMSO稀釋至20mL得100 μ M的蘆丁樣品液；取1mL100 μ M的蘆丁樣品液，用DMSO稀釋至20mL得50 μ M的蘆丁樣品液。
[0020](2)配置異槲皮苷樣品液:稱取異槲皮苷1.9mg，溶于20.457mL DMSO得200 μ M的異槲皮苷樣品