專利名稱：從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法。
背景技術(shù)：
荷葉為睡蓮植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)的干燥葉，又名蓮葉、藕葉，在我國大部分地區(qū)多有種植，廣泛應(yīng)用于食物及藥物，為衛(wèi)生部規(guī)定的第二批“既是食品又是藥品”的品種。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，荷葉味苦，平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血之功效，據(jù)《本草綱目》記載“荷葉服之，令人瘦劣”、“生發(fā)元氣，裨助脾胃，澀精濁，散瘀血，消腫痛，發(fā)痘瘡”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，荷葉中含有大量的黃酮類化合物，具有降血脂、治療動脈粥樣硬化、抗有絲分裂、抑菌等功效。目前，荷葉中黃酮含量的測定已有報道，多采用紫外分光廣度法測定總黃酮或者高效液相色譜法測定槲皮素、蘆丁等黃酮類化合物含量。荷葉中具一定含量的異槲皮苷，但由于異槲皮苷與蘆丁、槲皮素等黃酮類化合物結(jié)構(gòu)相似，常規(guī)方法很難有效分離。CN100367976 (2008_2_13)提供了一種貫葉連翹提取物及制備方法，其中涉及異槲皮苷的峰面積和貫葉連翹提取物的指紋圖譜檢測方法，然而該方法對于從荷葉中分離并不適用?！端幬锓治鲭s質(zhì)》2010，30袁麗春，劉斌，石任兵公開了一種“HPLC法測定不同市售荷葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷的含量”，然而該方法為常規(guī)分析提純方法，分離效率不高，并且難以分別將槲皮素、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷分離出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離效率高的一種從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的一種從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，包括采用柱層析方法拆分荷葉粉末中的組分，而柱層析用的固定相為C18，流動相A為pH值3. 5-4. 5的磷酸鹽緩沖液，流動相B為乙腈，在柱溫28-32°C、pH值3. 5-4. 5的條件下按O. 6-0. 8ml/min的流速梯度洗脫65_75min ;所述梯度洗脫條件為在0-45min，所述流動相A與流動相B的體積比為(90-95) / (5-10);在46-55min，所述流動相A與流動相B的體積比為(80-85)/ (15-20);在56_65min，所述流動相A與流動相B的體積比為(68-72) / (28-32);在66_75min，所述流動相A與流動相B的體積比為(90-95)/ (5-10);分別回收含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑后獲得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素分別相差一個葡糖基，固定比例洗脫很難分離，特別是蘆丁和異槲皮苷，保留時間非常接近，容易造成混合，通過本發(fā)明的上述梯度分離方法，最終實現(xiàn)了有效分離，并且蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的分離效率分別達(dá)到98. 5%以上，分離效率較高。
作為優(yōu)選，所述磷酸鹽緩沖液為O. 15-0. 25%的磷酸溶液與8-12%的氫氧化鈉溶液混合至pH值3. 5-4. 5制備而成。 更優(yōu)選地，所述磷酸鹽緩沖液的配制方法為將O. 2%的磷酸溶液滴定至10%的氫氧化鈉溶液，在滴定同時通過攪拌加入空氣，混合至pH值4. O制備而成。作為優(yōu)選，磷酸鹽緩沖液的pH值為4. O。 作為優(yōu)選，在0-45min，所述流動相A與流動相B的體積比為92/8。作為優(yōu)選，在46-55min，所述流動相A與流動相B的體積比為82/18。作為優(yōu)選，在56-65min，所述流動相A與流動相B的體積比為70/30。作為優(yōu)選，在66-75min，所述流動相A與流動相B的體積比為92/8。作為優(yōu)選，所述荷葉粉末先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75-85%的甲醇溶液溶解并超聲28-35min，然后再加75-85%的甲醇溶液溶解后過濾，取濾液作為所述柱層析的待分離液。更優(yōu)選地，所述荷葉粉末先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液溶解并超聲30min，然后再加80%的甲醇溶液溶解后過濾，取濾液作為所述柱層析的待分離液。


圖I是本發(fā)明實施例一的色譜 圖2是蘆丁對照品的色譜 圖3是金絲桃苷對照品的色譜 圖4是異槲皮苷對照品的色譜 圖5是槲皮素對照品的色譜 圖中，I -蘆?。?II-金絲桃苷；III-異槲皮苷；IV-槲皮素。
具體實施例方式實施例一
I儀器與試藥
Agilent 1100型高效液相色譜儀；異槲皮苷對照品(批號為10391，純度為93. 0%，德國HWI ANALYTIK公司);槲皮素對照品(批號為100081-200406，中國藥品生物制品檢定所)；蘆丁對照品(批號為100080-200707，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜純，德國Merck公司);水為超純水；荷葉原粉(自制，南太湖邊采摘、晾干、粉碎、過5號篩);其余試劑為分析純。2 方法與結(jié)果
2.I色譜條件
色譜柱Agilent C18 柱(250_X 4. 6mm, 5 μ m)柱溫 30°C。流動相 A :ρΗ4· O 磷酸鹽緩沖液(O. 2%磷酸溶液，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4. O);流動相B 乙腈；梯度洗脫詳見表I。紫外檢測器檢測，檢測波長356nm。進(jìn)樣量5μ1。理論塔板數(shù)以異槲皮苷計不低于2500。磷酸鹽緩沖液的配制方法為將O. 2%的磷酸溶液滴定至10%的氫氧化鈉溶液，在滴定同時通過攪拌加入空氣，混合至pH值4. O制備而成。在柱溫28-32 °C、pH值3. 5-4. 5的條件下按O. 6-0. 8ml/min的流速梯度洗脫65-75min;流出的組分按照時間先后依次為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素，分別回收含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑后獲得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素。蘆丁收率為96. 8%，純度達(dá)90% ;金絲桃苷收率為97. 6%，純度達(dá)88% ;異槲皮苷收率為99. 1%，純度達(dá)92% ;槲皮素收率為98. 1%，純度達(dá)91%。表I實施例一梯度洗脫表
權(quán)利要求
1.從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，包括采用柱層析方法拆分荷葉粉末中的組分，其特征在于所述柱層析用的固定相為C18，流動相A為pH值3.5-4. 5的磷酸鹽緩沖液，流動相B為乙腈，在柱溫28-32°C、pH值3. 5-4. 5的條件下按O.6-0. 8ml/min的流速梯度洗脫65_75min ;所述梯度洗脫條件為在0_45min，所述流動相A與流動相B的體積比為(90-95) / (5-10);在46_55min，所述流動相A與流動相B的體積比為(80-85)/ (15-20);在56-6511^11，所述流動相A與流動相B的體積比為(68-72)/(28-32);在66-75min，所述流動相A與流動相B的體積比為(90-95) / (5-10);分別回收含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑后獲得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液為O. 15-0. 25%的磷酸溶液與8-12%的氫氧化鈉溶液混合至pH值3. 5-4. 5制備而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液的配制方法為將O. 2%的磷酸溶液滴定至10%的氫氧化鈉溶液，在滴定同時通過攪拌加入空氣，混合至pH值4. O制備而成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于所述磷酸鹽緩沖液的PH值為4. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于在0-45min，所述流動相A與流動相B的體積比為92/8。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于在46-55min，所述流動相A與流動相B的體積比為82/18。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于在56-65min，所述流動相A與流動相B的體積比為70/30。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于在66-75min，所述流動相A與流動相B的體積比為92/8。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于所述荷葉粉末先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75-85%的甲醇溶液溶解并超聲28-35min，然后再加75_85wt%的甲醇溶液溶解后過濾，取濾液作為所述柱層析的待分離液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，其特征在于所述荷葉粉末先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液溶解并超聲30min，然后再加80wt%的甲醇溶液溶解后過濾，取濾液作為所述柱層析的待分離液。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法。一種從荷葉中分離蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素的方法，包括采用柱層析方法拆分荷葉粉末中的組分，而柱層析用的固定相為C18，流動相A為pH值3.5-4.5的磷酸鹽緩沖液，流動相B為乙腈，在柱溫28-32℃、pH值3.5-4.5的條件下按0.6-0.8ml/min的流速梯度洗脫65-75min；流出的組分按照時間先后依次為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素，分別回收含蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的洗脫液，最后減壓蒸餾脫除溶劑后獲得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素。本發(fā)明不僅能將蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素都分離出來，而且分離效率高。
文檔編號C07D311/40GK102827220SQ20121030308
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月24日
發(fā)明者王新財, 陳曉平 申請人:湖州市食品藥品檢驗所