專利名稱:濃縮和純化核酸的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離核酸的方法。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及一種利用電泳分離靶核酸的方法。
背景技術(shù)：
由于近來對(duì)人類基因組的解讀，生命過程和基因之間的不同關(guān)系已經(jīng)被分析。因此，醫(yī)學(xué)重點(diǎn)從病理學(xué)轉(zhuǎn)移到病因?qū)W，從醫(yī)學(xué)治療轉(zhuǎn)移到預(yù)防。因此，基因檢測技術(shù)成為了重要基礎(chǔ)。
基因檢測可以被用于在常規(guī)臨床檢查中很難完成的檢測，例如，對(duì)培養(yǎng)困難的病原微生物的鑒定，在用抗生素進(jìn)行治療時(shí)或在感染早期檢測病原微生物，在懷疑存在抗體轉(zhuǎn)移的情況下檢測抗原，調(diào)查病原微生物傳染源，個(gè)人識(shí)別例如血統(tǒng)診斷，白血病和實(shí)體瘤的疾病類型的基因診斷，和遺傳疾病的診斷。需要長時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)菌可以有效地通過基因檢測被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)榛驒z測相對(duì)于培養(yǎng)細(xì)菌的方法而言所耗費(fèi)的時(shí)間更短。此外，因?yàn)镈NA的穩(wěn)定依賴于良好的保藏條件，老樣品，例如冷凍的活組織檢測樣品或骨也能被檢測。
基因檢測吸引了公眾的注意力，因?yàn)樗軘U(kuò)展對(duì)最近增加的性傳播疾病的檢測的幾率。
眾所周知，常規(guī)的核酸純化和濃縮的方法，包括使用苯酚、氯仿或乙醇的純化方法，使用吸附核酸的柱子或過濾器的純化方法，和使用磁性二氧化硅珠的純化方法。
此外，還有眾所周知的從平板狀凝膠電泳中回收核酸的常規(guī)方法，如同在日本實(shí)用新型公開平5-88296中所描述的那樣，其中核酸在備好的凝膠上電泳，一回收裝置被移到含有靶核酸的凝膠部分，然后靶核酸被進(jìn)一步電泳回收。
此外，有如日本特許公開平8-327595中所述那樣的眾所周知的常規(guī)方法，其中核酸在平板狀凝膠中電泳以分離靶核酸，一段回收片(chip)插入到凝膠中靠近靶核酸帶以回收靶核酸。
關(guān)于常規(guī)的核酸純化和濃縮方法，使用苯酚、氯仿或乙醇的純化方法僅可以在有限的環(huán)境下利用，因?yàn)檫@需要要求高級(jí)化學(xué)設(shè)備的有效藥物。進(jìn)一步地，很難使該純化方法自動(dòng)化，因?yàn)檫@需要有難度的操作和高速的離心步驟。也很難獲得高精度。
應(yīng)用柱子或過濾器來吸附核酸的純化方法通過流動(dòng)溶液而進(jìn)行。因此，當(dāng)一個(gè)樣品包括許多雜質(zhì)如垃圾時(shí)，柱子或過濾器往往被堵塞導(dǎo)致純化效率降低。此外，很難使該方法自動(dòng)化，因?yàn)樗箅x心或吸出的步驟。
應(yīng)用磁性二氧化硅珠的回收方法很難得到核酸的高回收，因?yàn)椴荒鼙淮朋w回收或從磁性材料上落下的二氧化硅珠可能會(huì)保留在樣品中。
常規(guī)的從平板狀電泳凝膠回收核酸的方法要求平板狀電泳凝膠和對(duì)包含靶核酸的凝膠部分處理之前核酸在平板狀電泳凝膠中的電泳。
用于電泳的凝膠抗震蕩的能力很弱，且根據(jù)其形成過程可能發(fā)生特征上的改變。因此，一般來說，靶核酸在電泳凝膠中的位置在電泳后通過紫外線進(jìn)行分析，隨后含有高濃度靶核酸的凝膠部分被處理。
因此，應(yīng)用該方法的基因檢測的每一個(gè)檢測都需要花費(fèi)很長的時(shí)間。如果用于電泳的凝膠很大，由于凝膠的不均衡導(dǎo)致的核酸帶印跡增大，因此減少了核酸的回收。此外，該大凝膠需要強(qiáng)的電力用于電泳。
發(fā)明概述作為解決上述問題的各種實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了一種如下方法，即在樣品中添加表面活性劑以吸附存在于樣品中的雜質(zhì)，從而使得雜質(zhì)的移動(dòng)不同于核酸的移動(dòng)，并將雜質(zhì)從核酸分離開。
此外，除了核酸外的雜質(zhì)經(jīng)陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑而帶電，并被置于電場中，其中核酸從含有雜質(zhì)的樣品中分離和純化以被濃縮或很容易被濃縮。
圖1在表面活性劑存在的條件下，利用電泳濃縮核酸的模擬圖。樣品含有核酸1和雜質(zhì)2。表面活性劑被加入到樣品中。非離子型表面活性劑3和陽離子表面活性劑4被用做表面活性劑。與樣品混合的表面活性劑吸附雜質(zhì)2。被陽離子表面活性劑4吸附的雜質(zhì)2帶正電，從而與很少或不被表面活性劑吸附的核酸1分離開。相應(yīng)地，雜質(zhì)2能被容易地從樣品中除去以濃縮核酸1。
下面，將解釋一個(gè)濃縮核酸的方法。在該方法中，進(jìn)行兩次電泳以確保對(duì)核酸的濃縮。樣品中過量的離子在第一次電泳中被除去，樣品中的核酸在第二次電泳中被濃縮。首先，100μL的1％ Triton(注冊商標(biāo))X-100，用為非離子表面活性劑被添加到含有核酸的樣品中并混合，然后在96℃加熱10分鐘。然后，100μL的0.2％DPC，用做陽離子表面活性劑被添加到樣品中。或者，非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑兩者可以在加熱處理前同時(shí)加入。即使核酸存在于大腸菌或類似菌的原核細(xì)胞中，細(xì)胞壁被添加到樣品中用于預(yù)處理的表面活性劑所破壞。相應(yīng)地，大腸菌或類似菌的培養(yǎng)液可以被用做樣品，從而幫助對(duì)樣品預(yù)處理的操作。如前述進(jìn)行預(yù)處理，施加100V的直流電壓進(jìn)行電泳10分鐘，從而從樣品中移走過量的離子。隨后，施加125V-150V的直流電壓進(jìn)行電泳120分鐘從而在正極回收到核酸。
以下將解釋用于樣品電泳的電泳槽的結(jié)構(gòu)。對(duì)于第一次電泳，圖2表示用于第一次電泳的電泳槽5的結(jié)構(gòu)。電泳槽5中有一樣品槽6和將電泳槽5區(qū)分為正極側(cè)部分和負(fù)極側(cè)部分的隔壁9。樣品槽6貫穿隔壁9，且其一側(cè)向正極凸出，一側(cè)向負(fù)極凸出。樣品槽6兩端開口，且開口部分用凝膠8封閉。在樣品槽6中產(chǎn)生了電位差以對(duì)核酸和被表面活性劑吸附的雜質(zhì)進(jìn)行電泳。非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑兩者都被添加到樣品中，并加熱樣品。然后，樣品被注入到樣品槽6中。在電極間使用100V的電壓以進(jìn)行電泳10分鐘。相應(yīng)地，過量的離子從樣品中除去。除去過量的離子后，核酸通過第二次電泳而濃縮。
第二次電泳說明含有在第一次電泳過程中被注入的樣品的樣品槽6被連接到一個(gè)回收槽并被放置于一電泳槽中進(jìn)行第二次電泳。圖3表示用于第二次電泳的電泳槽5的結(jié)構(gòu)。電泳槽5中有樣品槽6，回收槽7和將電泳槽5區(qū)分為正極側(cè)部分和負(fù)極側(cè)部分的隔壁9。樣品槽6貫穿隔壁9，且向負(fù)極側(cè)凸出?；厥詹?插入隔壁9并向正極側(cè)凸出。樣品槽6和回收槽7在隔壁9處穿過凝膠8而相互連接起來。樣品槽6兩端開口，且開口部分分別由凝膠8封閉?；厥詹?兩端開口。位于負(fù)極側(cè)的回收槽7的一端由凝膠8封閉，位于正極側(cè)的回收槽7的一端用超濾膜11封閉。在如上述所構(gòu)成的電泳槽，用120V的電壓穿過電極進(jìn)行電泳120分鐘。
通過在電泳槽中進(jìn)行的第二次電泳，除去過量離子后的樣品除核酸以外的部分被電泳，其中核酸可以被有效地回收到回收槽7中。在回收槽7的正極側(cè)所提供的超濾膜11阻止核酸從回收槽7漏出。相應(yīng)地，核酸的回收效率能提高。如果樣品的狀態(tài)適當(dāng)，可以只進(jìn)行第二次電泳而不進(jìn)行第一次電泳。預(yù)處理過的樣品被注入到連接在回收槽7上的樣品槽6中進(jìn)行電泳，其中核酸可以被很容易地濃縮。存在于樣品中的過量離子能通過超濾膜，從而不影響核酸的回收。
也就是說，根據(jù)本發(fā)明，一種利用電泳來濃縮和純化核酸的方法的特征在于樣品被放置于一電場中以在調(diào)節(jié)了存在于含有核酸的樣品中的雜質(zhì)的荷電量后濃縮和純化核酸。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明，一種利用電泳來濃縮和純化核酸的方法的特征在于在含有核酸的樣品中添加了陽離子表面活性劑來調(diào)節(jié)樣品中的雜質(zhì)的荷電量，然后該樣品被置于一電場中以利用電泳來濃縮和純化核酸。陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑被添加到含有核酸的樣品中以調(diào)節(jié)存在于樣品中的雜質(zhì)的荷電量，然后，該樣品被置于一電場中以利用電泳濃縮和純化核酸。樣品中除核酸外的其它物質(zhì)的電荷通過其吸附到陽離子表面活性劑上進(jìn)行調(diào)節(jié)，且這些物質(zhì)對(duì)陽離子表面活性劑的吸附通過調(diào)節(jié)添加的非離子表面活性劑的量來調(diào)節(jié)。
根據(jù)本發(fā)明，用于濃縮和純化核酸的裝置含有添加到樣品中的陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑，其中的樣品被電泳以在正極側(cè)濃縮和純化核酸。進(jìn)一步地，該裝置含有一容器，其側(cè)壁由絕緣體形成。在容器中含有一用于阻止擴(kuò)散的導(dǎo)電分離體，從而將容器內(nèi)部劃分為樣品注入室和核酸回收室。該容器的每端通過緩沖槽分別連接到電極上。
或者，也可以使用以下的方法。含有核酸的樣品與由一種材料形成的分離介質(zhì)接觸，在該材料中，具有不同分子量的物質(zhì)表現(xiàn)出不同遷移率，加上電壓以將核酸與其他物質(zhì)分離。然后，通過分離介質(zhì)的核酸被一過濾器回收。該過濾器具有通過核酸的小孔，該小孔比靶核酸要小。
例如，用于電泳的分離介質(zhì)的一端配有用緩沖液填充的樣品供給部分，在另一端配有用緩沖液填充的取樣部分。通過對(duì)樣品供給部分和取樣部分施加電壓，樣品在分離介質(zhì)中電泳遷移。由于各核酸的不同分子量，樣品中的核酸在分離介質(zhì)中以不同的速度遷移，從而導(dǎo)致具有不同分子量的核酸需要不同的時(shí)間來通過分離介質(zhì)并被洗脫到取樣部分中?？紤]到這樣的情形，在靶核酸被洗脫到取樣部分結(jié)束后立刻停止電泳，以減少靶核酸以外的組分。取樣部分的緩沖液可以根據(jù)靶核酸洗脫進(jìn)取樣部分的時(shí)間進(jìn)行更換，以從取樣部分僅取樣靶核酸。靶核酸的濃度依賴于取樣部分中的緩沖液的量。
這樣，上述操作可以很容易的自動(dòng)化操作，因?yàn)樗灰箅x心或抽吸操作。核酸可以立刻從樣品中大量分離出來。通過減少含有靶核酸的洗脫溶液，溶液被濃縮以增加靶核酸在樣品中的濃度。進(jìn)一步地，被純化以易于加工的這樣的核酸在電泳后被立即取樣，從而由當(dāng)前步驟平穩(wěn)地過渡到下一步驟。
相比較于其它方法而言，本發(fā)明方法可以獲得更高的回收率和更高精度的靶，且不需要昂貴的試劑或昂貴的裝置，從而降低了運(yùn)行成本和操作成本。在這一點(diǎn)上，根據(jù)本發(fā)明的利用電泳來濃縮和純化核酸的方法，含有核酸的樣品中存在的雜質(zhì)與一種分離介質(zhì)接觸，在該介質(zhì)中具有不同分子量的被電泳的核酸根據(jù)分子量的差異以不同的遷移率遷移，然后，小于靶核酸的核酸穿過具有在遷移方向上減小的截面積的過濾器，而靶核酸由過濾器回收，從而從樣品中分離出靶核酸。該方法可以在不進(jìn)行離心和抽吸操作的情形下進(jìn)行，并可以使用一個(gè)簡單的裝置來分離和濃縮核酸。進(jìn)一步地，這樣的簡單結(jié)構(gòu)可以很容易地實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。進(jìn)一步地，可以立刻得到大量樣品?？梢詼p少含有靶核酸的洗脫溶液以濃縮和增加樣品中靶核酸的濃度。分離和濃縮的運(yùn)行成本以及操作時(shí)間都被降低了。此外，用于鑒定最初不存在的外源基因的檢測可以很容易地進(jìn)行。
圖1是在表面活性劑存在的條件下，利用電泳濃縮核酸的模式圖。
圖2是用于第一次電泳的電泳槽的圖示。
圖3是用于第二次電泳的電泳槽的圖示。
圖4是第一電泳槽的圖示。
圖5是第二電泳槽的圖示。
圖6是取樣單元的透視圖。
圖7是取樣單元的平面圖。
圖8是取樣單元的側(cè)面圖。
圖9是取樣單元的側(cè)面截面圖。
圖10是連接部的透視圖。
圖11是連接部的側(cè)面截面圖。
圖12是過濾部的側(cè)面截面圖。
圖13是分離單元的裝配側(cè)面圖。
圖14圖解的是被回收溶液的紫外線光譜。
圖15是核酸濃縮單元一部分剖面透視圖。
圖16是核酸濃縮單元的平面圖。
圖17是核酸濃縮單元的側(cè)面圖。
圖18圖解的是靶核酸的濃縮過程。
圖19是濃縮單元的開封過程的圖示。
圖20是濃縮單元的側(cè)面截面圖。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下給出對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的說明。首先，將描述用于電泳的電泳槽。圖4圖解的是一個(gè)第一電泳槽21。電泳槽21被隔壁24和25分為陰極側(cè)槽22和正極側(cè)槽23。隔壁24和25位于電泳槽21的中央，取樣單元26附著于隔壁24和25上。取樣單元26的一端凸出到負(fù)極側(cè)槽中，另一端凸出到正極側(cè)槽23中。取樣單元26的正極側(cè)及負(fù)極側(cè)部分填充有凝膠，其側(cè)表面有一注入孔，通過該孔樣品被注入到樣品單元中。電泳時(shí)，用一個(gè)塞子注入將孔關(guān)閉。負(fù)極插入到負(fù)極側(cè)槽22中，正極插入到正極側(cè)槽23中，以對(duì)電泳槽21施加電壓。
以下描述了另一電泳槽。圖5圖解了一個(gè)第二電泳槽21。第二電泳槽21被隔壁24和25分為陰極側(cè)槽22和正極側(cè)槽23。隔壁24和25位于電泳槽21的中央，分離單元32附著于隔壁24和25上。分離單位32的一端凸出到負(fù)極側(cè)槽22中，其另一端凸出到正極側(cè)槽23中。負(fù)極插入到負(fù)極側(cè)槽22中，正極插入到正極側(cè)槽23中，以對(duì)電泳槽21施加電壓。分離單元包括3個(gè)單元，即取樣單元26、連接部33和過濾部34，它們相互連接在一起。O型環(huán)位于取樣單元26與連接部33之間以及連接部33與過濾部34之間，以確保它們的連接并防止緩沖液流出來。取樣單元26的負(fù)極一側(cè)部分填充凝膠，連接部33的正極一側(cè)部分也填充凝膠。一超濾膜附著于過濾部34。
核酸在這樣的電泳槽中被濃縮。首先，對(duì)于第一次電泳，一種溶解樣品通過注入孔被注入，然后將該孔關(guān)閉。然后，取樣單元26被安置在電泳槽21中使得取樣單元26的上表面稍從溶液上凸出。隨后，施加100V的直流電壓進(jìn)行20分鐘的電泳，從而從樣品中除去過量的離子。緩沖液由1xTAE溶液、40mM Tris、40mM冰醋酸和1mM EDTA來制備，其pH被調(diào)節(jié)到8.0。
從第一電泳槽21除去過量的離子后，連接部33和過濾部34被連接到取樣單元26。O型環(huán)位于每一連接處以防止溶液流出來。以6∶4比例混合100％乙醇和1xTAE所制備的溶液被添加到連接部33中，TE-1(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0)被添加到取樣單元26中。
接下來描述取樣單元26、連接部33和過濾部34的結(jié)構(gòu)。首先描述取樣單元26的結(jié)構(gòu)。圖6是取樣單元的透視圖，圖7是取樣單元的平面圖，圖8是取樣單元的側(cè)面圖，圖9是取樣單元的側(cè)面截面圖。取樣單元包括一個(gè)用于容納凝膠的容器。該容器是用Microcon(注冊商標(biāo))YM-3離心容器單元(Millipore)加工的，這樣超濾膜被從其上移走，并在其中開有一5mm直徑的孔?；蛘撸魏螁卧伎梢杂米鋈訂卧?6，只要它具有相同的功能。
取樣單元26包括一圓柱體41和一臺(tái)座43。圓柱體41連接到臺(tái)座43上，其中有一注入孔42用于注入樣品。臺(tái)座43被做成梯狀柱體，且一垂直的孔44穿透臺(tái)座43。凝膠48被置于圓柱體41中。凝膠48有幾個(gè)毫米的厚度從而填充圓柱體41的開口。相應(yīng)地，樣品通過注入孔42被提供到凝膠48內(nèi)。
以下將解釋連接部33。圖10是連接部的透視圖，圖11是連接部的側(cè)面截面視圖。與取樣單元26相似，Millipore的離心過濾單元被加工使得超過濾膜被移走，且單元中開有5mm直徑的孔，從而構(gòu)成了連接部33。連接部33包含一圓柱體41和一臺(tái)座43。圓柱體41連接于臺(tái)座43。臺(tái)座43被做成梯狀柱體，一垂直的孔44穿透臺(tái)座43。具有幾個(gè)毫米的厚度的凝膠48被置于圓柱體41中。在圓柱體41中，凝膠48被置于臺(tái)座43的上表面內(nèi)以防止液體從取樣單元26中流出或流向過濾部34。
以下解釋過濾部34。圖12是過濾部的側(cè)面截面圖。過濾部34也通過加工Millipore的離心過濾單元構(gòu)成。過濾部34包括一圓柱體41和一臺(tái)座43。圓柱體41被連接到臺(tái)座43上。該圓柱體41較取樣單元26的圓柱體和連接部33的圓柱體41短約5mm。臺(tái)座43被做成梯狀柱體，一垂直孔44穿透臺(tái)座43。在圓柱體41中，超濾膜49被置于臺(tái)座43的上表面內(nèi)以防止核酸流出，從而確保核酸的濃縮。
接下來，解釋核酸濃縮操作的實(shí)施方式。樣品是大腸菌培養(yǎng)液，進(jìn)行第一次和第二次電泳以濃縮核酸?；厥盏暮怂岬臐舛韧ㄟ^吸光率測量法測定。100μL的大腸菌(Escherichia coli DH5α)的培養(yǎng)液被用做樣品。100μL的1％Triton(注冊商標(biāo))X-100被添加到樣品中，且在96℃條件下加熱10分鐘。隨后，100μL的0.2％DPC被添加到其中，從而制備用于電泳的樣品。0.5xTAE用做電泳緩沖液。瓊脂糖溶解在1xTAE中。此外，該1xTAE溶液從40mM Tris，40mM冰醋酸和1mM EDTA制備，其pH被調(diào)節(jié)到8.0.
連接部33被豎起來以使圓柱體41的開口翻轉(zhuǎn)向上，1％瓊脂糖凝膠(SeaKem Gold agarose購自TaKaRa)通過該開口被添加到圓柱體41中使凝膠有幾個(gè)毫米的厚度，然后使凝膠變硬。與連接部33相似，取樣單元26被豎起來以使圓柱體41的開口向上，1％瓊脂糖凝膠(SeaKem Gold agarose購自TaKaRa)通過該開口被添加到圓柱體41中使得凝膠具有幾個(gè)毫米的厚度。凝膠變硬后，取樣單元26被倒置且凝膠從注入孔42被添加到圓柱體41的開口中。HU-6(AR BROWN制造)用做電泳槽，MPSU-200(AR BROWN制造)用做電源。
制備用于電泳的樣品通過注入孔42加入到取樣單元26中，然后將孔關(guān)閉。電泳槽被封固(putty)分為負(fù)極側(cè)部分和正極側(cè)部分，0.5xTAE被加入到槽的兩側(cè)部分。取樣單元26被放置于封固處以使取樣單元26的上表面比緩沖液高。隨后，施加100V的直流電壓并進(jìn)行第一次電泳20分鐘。
第一次電泳完成后，連接部33和過濾部34被連接到取樣單元26上，以構(gòu)建分離單元，并進(jìn)行第二次電泳。
以下將給出對(duì)第二次電泳的操作的具體實(shí)施方式
。以6∶4的比例混合100％乙醇和1xTAE所得溶液被加入連接部33中。TE-1(10mMTris-HCl，0.1mM EDTA，pH 8.0)被添加入取樣單元26中。
接下來，連接部33和過濾部34連接到取樣單元26上以裝配分離單元。圖13是分離單元裝配結(jié)構(gòu)側(cè)面圖。分離單元從朝向同一方向的取樣單元26、連接部33和過濾部34裝配而來。O型環(huán)51被置于連接部33和過濾部34之間，以及連接部33和過濾部34之間，以防止溶液從分離單元中流出。
電泳槽被封固分為負(fù)極側(cè)部分和正極側(cè)部分，0.5xTAE被加入到槽的兩側(cè)。放入裝配的分離單元以使得取樣單元26被置于封固的負(fù)極側(cè)，過濾部34被置于封固的正極側(cè)。隨后，施加100V的直流電壓并進(jìn)行第二次電泳240分鐘。
接下來，核酸溶液在過濾部34回收，其吸光率通過紫外線光譜測定以計(jì)算出回收核酸的濃度。圖14圖解的是回收溶液的紫外線光譜。計(jì)算出的核酸濃度為32.3ng/μL(6.7×106個(gè)拷貝/μL)。核酸的濃度如此計(jì)算，在260nm(A260)處的吸光率乘以核酸固有的系數(shù)，乘以比色皿的光程長度(mm)，再除以10。
回收的核酸的純度通過紫外線光譜計(jì)算。計(jì)算出來的回收核酸的純度為1.91。純度用260nm(A260)處的吸光率除以280nm(A280)處的吸光率來計(jì)算。當(dāng)樣品是純度為100％的DNA時(shí)，計(jì)算值約為1.8。當(dāng)樣品是純度為100％的RNA時(shí)，計(jì)算值約為2.0?；旌显谑軠y材料中的蛋白質(zhì)和苯酚的量用A280的值來反應(yīng)。當(dāng)吸光率低于1.5時(shí)，可能混入了低分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的利用電泳來濃縮和純化核酸的方法，含有核酸的樣品中的雜質(zhì)的荷電量被調(diào)節(jié)，然后樣品被置于電場中進(jìn)行電泳以濃縮和純化核酸。作為該方法的一個(gè)結(jié)果，電泳時(shí)核酸的遷移不同于雜質(zhì)的遷移，這樣可以有效地分離出核酸。雜質(zhì)和核酸間的遷移差異可以通過荷電量的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)，從而可以很容易的控制遷移。無需使用離心分離機(jī)或類似裝置，從而用于濃縮核酸的裝置可以很緊湊。
根據(jù)利用電泳來濃縮和純化核酸的方法，陽離子表面活性劑被加入到含有核酸的樣品中，以調(diào)節(jié)存在于樣品中的雜質(zhì)的荷電量，然后，該樣品被放置于電場中進(jìn)行電泳以濃縮和純化核酸。歸因于陽離子表面活性劑，該方法的操作很容易，且操作的安全性可以很容易地得到保證。通過增加對(duì)雜質(zhì)的吸附，雜質(zhì)和核酸間的遷移差異變大以有效地分離到核酸。雜質(zhì)與核酸呈相反的方向遷移以防雜質(zhì)降低核酸的純度，從而可以容易地純化核酸。
根據(jù)本發(fā)明的利用電泳來濃縮和純化核酸的方法，陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑被添加到含有核酸的樣品中，以調(diào)節(jié)存在于樣品中的雜質(zhì)的荷電量，然后該樣品被放置于電場中進(jìn)行電泳以濃縮和純化核酸。相應(yīng)地，陽離子表面活性劑的吸附可以通過調(diào)節(jié)陽離子表面活性劑與非離子型表面活性劑兩者間的比例來進(jìn)行，從而可以容易地調(diào)節(jié)被電泳的雜質(zhì)的遷移。非離子型表面活性劑吸附核酸從而防止陽離子表面活性劑吸附核酸。
核酸以外的其它物質(zhì)的荷電量通過其吸附到陽離子表面活性劑來進(jìn)行調(diào)節(jié)，這種吸附則通過添加的非離子型表面活性劑的量來進(jìn)行調(diào)節(jié)。相應(yīng)地，雜質(zhì)吸附到陽離子表面活性劑上的比例及非離子型表面活性劑可以容易地被控制。此外，雜質(zhì)的荷電量可以通過簡單的操作進(jìn)行調(diào)節(jié)。非離子型表面活性劑吸附到核酸上以防止陽離子表面活性劑吸附核酸。
在裝置中，陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑被添加到樣品中，然后該樣品被電泳以在正極側(cè)濃縮和純化核酸。相應(yīng)地，該裝置可以被簡化來純化樣品中的核酸并調(diào)控核酸的遷移，從而在保證安全性的同時(shí)自身很緊湊。
利用電泳濃縮和純化核酸的裝置包括一容器，該容器的側(cè)壁由絕緣體形成。該容器被用于防止擴(kuò)散的導(dǎo)電性分離介質(zhì)分為樣品注入室和核酸回收室。該容器的兩端通過緩沖液槽被分別連接到兩個(gè)電極。因此，用于濃縮和純化的裝置可以簡便地構(gòu)成從而降低其生產(chǎn)成本。此外，該裝置容易控制并具有高度的安全性。
接下來，以下將參照附圖描述本發(fā)明的第二實(shí)施方案。
圖15是核酸濃縮單元一部分剖面透視圖，圖16是該單元的平面圖，圖17是該單元的側(cè)面圖。以下將描述圖15-17所示的核酸濃縮單元。
位于t-DNA檢測器中的濃縮單元101分離并濃縮靶核酸。濃縮單元101包括注入室102，由分離介質(zhì)形成的分離室108，和取樣室103。含有靶核酸的樣品通過注口109注入到注入室，對(duì)注入室102和取樣室103施加電壓以使核酸遷移進(jìn)入取樣室103中。已經(jīng)通過分離室108的靶核酸流入到取樣室103中，并通過注口110從取樣室103中取樣。生物樣品，例如血液、尿、痰液或類似物，飲料或食物可以用做樣品被注入到注入室102中。另外，基因組或質(zhì)粒也能被注入。
以下將詳述濃縮單元101中的每一部分的結(jié)構(gòu)。注入室102被連接到分離室108的一端，取樣室103被連接到分離室108的另一端。電極105被置于注入室中，且電極106和107被置于取樣室103中。注入室102和取樣室103裝滿緩沖液用于電泳。取樣室103中的電極106被置于面對(duì)注入室102中的電極，取樣室103中的電極107被置于取樣室103的底部。過濾器104被置于取樣室103中以將取樣室103分為分離室108和包括電極106的室。過濾器104允許小于靶核酸的物質(zhì)通過，阻止不小于靶核酸的物質(zhì)通過。過濾器104上有很多濾孔，它們具有例如阻止與靶核酸互相作用和阻止靶核酸通過這樣的特性。
過濾器104被制成具有一底部開口和一側(cè)面開口的四角錐形。錐體的底部開口朝向分離室108。錐體的側(cè)面開口是一向上開口的水平面。相應(yīng)地，過濾器104朝向分離室108的部分中的靶核酸可以通過注口110取樣。隨著靶核酸利用電泳向電極106遷移，靶核酸在過濾器104朝向電極106的部分中濃縮。
接下來，將根據(jù)圖18解釋通過濃縮單元對(duì)靶核酸的濃縮過程。圖18是靶核酸的濃縮過程的示意圖。首先，圖18(a)表示樣品被注入到注入室102中的狀態(tài)。為在此更清楚地進(jìn)行說明，我們假設(shè)樣品含有靶核酸112，大于靶核酸112(體積大或在分子量量上大)的核酸111，小于靶核酸的核酸113。
圖18(a)表示大核酸111、靶核酸112和小核酸113被混合的狀態(tài)。當(dāng)電壓施加在電極105和106上時(shí)，大核酸111，靶核酸112和小核酸113被引入到分離室108中，且在分離室108中以不同的速度遷移，如圖18(b)所示。對(duì)于圖18所示的結(jié)構(gòu)，瓊脂糖凝膠被用做分離介質(zhì)填充分離室108，以使得小核酸113位于其它核酸之前。
在前的小核酸113通過分離室108到達(dá)取樣室103。然后，小核酸113穿過過濾器104并遷移到取樣室103中的電極106。隨后，靶核酸112通過分離室108到達(dá)取樣室103。因此，如圖18(c)所示，過濾器104阻止靶核酸112進(jìn)一步向電極106遷移。因?yàn)檫^濾器104被作成錐形，其底部開口朝向分離室108，其側(cè)面開口向上，靶核酸112在過濾器104對(duì)著電極106的部分被濃縮。
在這種狀態(tài)下，停止通過電極105和106施加電壓，電壓通過電極107和106施加，如圖18(d)所示。結(jié)果，電極106仍然捕獲比靶核酸小的雜質(zhì)。當(dāng)通過兩電極施加的電壓被停止時(shí)，核酸從過濾器上被釋放下來。這樣，在靶核酸112從過濾器釋放下來的過程中，防止了小的雜質(zhì)和小核酸113的擴(kuò)散，從而高精度濃縮靶核酸112。
然后，靶核酸112通過分離室108的時(shí)間被計(jì)算出來以確定從樣品注入到注入室102、從通過電極105和106到通過電極107和106的電壓的改變的設(shè)定時(shí)間，從而自動(dòng)地進(jìn)行靶核酸的分離和濃縮。
任何用于電泳的凝膠，例如瓊脂糖凝膠，可以被用做分離室108。也可以使用用作柱填充物的分離介質(zhì)。例如，用于凝膠過濾的載體，如可使用Sephadex(注冊商標(biāo))(Pharmacia)。還值得考慮的是用于電泳的凝膠與柱填充物在分離部108被結(jié)合起來并對(duì)之進(jìn)行調(diào)節(jié)以使得靶核酸最先流出來。
下面，將對(duì)根據(jù)圖19和圖20的濃縮單元的另一結(jié)構(gòu)進(jìn)行解釋。圖19是濃縮單元的開封過程的示意圖，圖20是濃縮單元的側(cè)面截面圖。濃縮單元被插入到一檢測裝置中以分離和濃縮靶核酸。
濃縮單元116的上表面貼著膜117a和117b，電極105和106在濃縮單元116的側(cè)面露出。電極107在其底面露出。電極105被連接到注入室，且電極106和107被連接到取樣室。濃縮單元116中有分離室108，注入室和取樣室填充有電泳緩沖液。取樣室被過濾器分開。
在這種狀態(tài)下，濃縮單元116被密封且電壓可以從外部施加于其上。相應(yīng)地，濃縮單元可以容易的進(jìn)行操作。當(dāng)樣品被注入到濃縮單元116中以對(duì)靶核酸取樣時(shí)，膜117a和117b如圖19所示被撕破，且樣品被注入以對(duì)靶核酸取樣。因?yàn)槟?17a和117b被粘貼在濃縮單元的上表面上，在撕破膜117時(shí)沒有對(duì)分離室108施加任何大的沖擊，從而可以穩(wěn)定地進(jìn)行濃縮和分離。
工業(yè)實(shí)用性如上述，本發(fā)明的方法簡化了對(duì)核酸進(jìn)行濃縮和純化的操作，且根據(jù)本發(fā)明的用于核酸的濃縮和純化的裝置在結(jié)構(gòu)上很簡單，因此可用于自動(dòng)檢測裝置以濃縮和檢測核酸。
權(quán)利要求
1.一種利用電泳對(duì)核酸進(jìn)行濃縮和純化的方法，其特征在于對(duì)含有核酸的樣品中的雜質(zhì)進(jìn)行電泳以使得核酸與一分離介質(zhì)相接觸，該分離介質(zhì)由這樣的材料形成，在該材料中具有不同分子量的核酸根據(jù)分子量的差異以不同的遷移率遷移，然后用過濾器回收靶核酸，比靶核酸小的核酸能通過該過濾器，該過濾器的橫截面積在遷移方向上減小。
專利摘要
在利用電泳對(duì)核酸進(jìn)行濃縮和純化的方法中，陽離子表面活性劑被添加到含有核酸的樣品中以調(diào)節(jié)樣品中的雜質(zhì)的荷電量，然后樣品被置于電場中進(jìn)行電泳以濃縮和純化核酸。陽離子表面活性劑(4)吸附除核酸外的物質(zhì)來調(diào)節(jié)該物質(zhì)的荷電量，陽離子表面活性劑的吸附通過添加非離子型表面活性劑的量進(jìn)行調(diào)節(jié)?；蛘?，核酸與分離介質(zhì)(108)接觸，然后通過過濾器(104)進(jìn)行回收，該過濾器的橫截面積在遷移方向上減少。
文檔編號(hào)G01N27/447GK1990497SQ200610141538
公開日2007年7月4日 申請日期2003年11月27日
發(fā)明者平井光春, 村上淳, 橋口智史, 豬瀨健 申請人:愛科來株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan