專利名稱:檢測在生物分子純化中使用的聚合物的殘余量的方法
檢測在生物分子純化中使用的聚合物的殘余量的方法
優(yōu)先權
本申請要求2010年6月8日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/397，186的優(yōu)先權，其全部內(nèi)容以其整體通過引用并入本文。
發(fā)明領域
本發(fā)明涉及檢測在純化生物分子的方法中使用的聚合物的殘余量的方法，所述生物分子例如蛋白質(zhì)、多肽、抗體、疫苗等。
背景技術：
生物分子(例如包括抗體在內(nèi)的治療性蛋白質(zhì))的高效和經(jīng)濟的大規(guī)模純化對于生物技術和醫(yī)藥工業(yè)是日益重要的問題。一般而言，純化方法相當復雜和昂貴并包括許多 不同的步驟。例如，典型地以蛋白質(zhì)為例，蛋白質(zhì)使用細胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生，例如使用工程化的哺乳動物或細菌細胞系通過插入含有編碼該蛋白質(zhì)的基因的質(zhì)粒來產(chǎn)生目標蛋白。一般而言，在靶蛋白表達后，將其與一或多種不期望的組分(如宿主細胞蛋白、培養(yǎng)基副產(chǎn)物和DNA)分開是一個巨大的挑戰(zhàn)。當治療性蛋白質(zhì)旨在用于人而必須獲得食品和藥物管理局(FDA)的批準時，這樣的分開尤其重要。
一般而言，目前用于蛋白質(zhì)分離和/或純化的方法包括至少以下步驟裂解細胞以回收胞內(nèi)蛋白或如果是分泌蛋白則從培養(yǎng)基回收蛋白；使用差異離心或過濾去除細胞和細胞碎片以獲得含有目標蛋白的凈化的樣品；和在多步驟方法中使用多種層析介質(zhì)將目標蛋白與樣品中的多種雜質(zhì)分開。
已經(jīng)證明某些聚合物在生物分子從樣品中的一或多種雜質(zhì)的純化中特別有用。例如，已經(jīng)很好地確立了聚電解質(zhì)聚合物在絮凝中純化蛋白質(zhì)的用途(見例如國際PCT專利申請?zhí)朩02008/091740)。這可以用廣范圍的聚合物實現(xiàn)，僅僅所需的一般特性為所述聚合物必須和目標物質(zhì)(例如靶分子或雜質(zhì))具有某些水平的相互作用。此外，美國專利公開號 20080255027、20090036651、20090232737 和 20110020327 (其各自以其整體援引加入本文)討論了稱作智能聚合物的某些聚合物的使用，其在特定的處理條件下(如pH、溫度和/或鹽濃度)可溶于水基溶劑，而在一或多種這樣的條件改變時變得不可溶并且隨后沉淀出來。
在智能聚合物的例子中，已發(fā)現(xiàn)這些聚合物可以結合一或多種可溶和/或不可溶雜質(zhì)或者它們可以結合目標生物分子(如待分離的靶蛋白)。一般而言，如援引加入本文的 20080255027、20090036651、20090232737 和 20110020327 中的一或多個所述，這樣的聚合物在暴露至刺激(如pH、溫度、鹽等)后能夠從溶液中沉淀出來。
盡管所述聚合物能夠從溶液中沉淀出來，但是該沉淀步驟并不總是去除樣品中或含生物材料的流(stream)中存在的全部聚合物，由此造成在含有目標生物分子的樣品中存在殘余量的聚合物。當目標生物分子是治療性蛋白質(zhì)時，例如當所述蛋白旨在用于人類并需要獲得食品和藥物管理局(FDA)的批準時，檢測殘余量的聚合物尤其重要。[0009]發(fā)明概述
本發(fā)明提供了新的、相對于現(xiàn)有技術方法更靈敏的檢測聚合物殘余量的方法，所述聚合物用于富集樣品中的目標生物分子。此外，本發(fā)明的方法不需要樣品加工，并且可以使用實驗室常見的設備進行，例如在本文描述的基于寡核苷酸標簽的方法中使用聚合酶鏈反應(PCR)熱循環(huán)儀。
在本發(fā)明的一個方面，提供了檢測包含目標生物分子的樣品中的聚合物殘余量的方法，其中所述聚合物用于將所述目標生物分子與一或多種雜質(zhì)分開。所述聚合物可以與一或多種雜質(zhì)結合或其可以結合所述目標生物分子，由此將所述目標生物分子與一或多種雜質(zhì)分開。在一些實施方案中，所述聚合物可以結合所述目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，其中所述目標生物分子隨后被選擇性洗脫，而所述一或多種雜質(zhì)保持與所述聚合物結合。
在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的用于檢測聚合物殘余量的方法包括以下步驟(I)使含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的樣品與聚合物接觸，其中所述聚合物與標簽相連；和(2)檢測所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表在包含所述目標生物分子的樣品中 的殘余聚合物的量。
在一些實施方案中，所述標簽是寡核苷酸分子。在其它一些實施方案中，所述標簽是非寡核苷酸分子，例如半抗原分子、熒光分子或放射性分子。如果分子是可檢測部分，則術語“標簽”和“分子”在本文可互換使用。
標簽可以與待檢測的聚合物連接，或者其可以與寡核苷酸分子連接，所述寡核苷酸分子接著與待檢測的聚合物連接?；蛘撸鰳撕灴梢耘c探針連接，所述探針與連接至待檢測聚合物的寡核苷酸分子雜交。
在寡核苷酸分子的情況下，所述分子可以使用擴增手段(如PCR)或非擴增手段(如，使用與所述寡核苷酸分子雜交的探針，或使用與所述寡核苷酸分子連接或與雜交至所述寡核苷酸分子的探針連接的熒光分子、半抗原分子或放射性分子)檢測。
在一些實施方案中，聚合物是刺激響應聚合物。在一些實施方案中，所述聚合物用于凈化(即與含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的樣品中的一或多種雜質(zhì)結合)。在其它實施方案中，所述聚合物用于捕獲(即與所述目標生物分子結合)。在另一些實施方案中，聚合物結合所述目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，其中隨后從所述聚合物選擇性洗脫所述目標生物分子，而所述一或多種雜質(zhì)保持與所述聚合物結合。
因此，在一些實施方案中，提供了用于檢測刺激響應聚合物殘余量的方法，其中所述方法包括步驟(I)使含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的溶液與刺激響應聚合物接觸，其中所述聚合物與標簽相連，由此形成聚合物和一或多種雜質(zhì)的復合物；(2)向所述溶液施加刺激，由此沉淀所述復合物；(3)從溶液中去除沉淀物；和(4)檢測所述含有目標生物分子的溶液中的所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表所述包含目標生物分子的溶液中的殘余聚合物的量。
在另外一些實施方案中，用于檢測刺激響應聚合物的殘余量的方法包括步驟(I)使含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的溶液與刺激響應聚合物接觸，其中所述聚合物與標簽相連并且其中所述聚合物和所述目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)在第一組條件下形成復合物；(2)向所述溶液加入刺激，由此沉淀所述復合物；(3)使沉淀物處于第二組條件由此從所述復合物選擇性洗脫所述目標生物分子；(4)檢測含有所述目標生物分子的洗脫液中的所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表所述洗脫液中殘余聚合物的量。
在一些實施方案中，在步驟(2)和(3)之間存在洗滌步驟。
在一些實施方案中，所述刺激響應聚合物對鹽刺激或pH刺激響應。在一具體實施方案中，所述聚合物對多價陰離子刺激響應。
示例性的刺激響應聚合物包括但不限于聚乙烯胺、聚烯丙胺、聚乙烯吡啶和用疏水基團修飾的聚合物。
在多個實施方案中，所述標簽(如寡核苷酸分子或非寡核苷酸分子如半抗原分子、熒光分子或放射性分子)共價地與所述聚合物相連，或所述標簽(如半抗原分子、熒光分子或放射性分子)共價地與所述寡核苷酸相連，而所述寡核苷酸接著與所述聚合物相連。在一些實施方案中，所述標簽與探針相連，所述探針與連接至所述聚合物的寡核苷酸雜交。
在一些所使用的標簽是寡核苷酸分子的實施方案中，所述檢測步驟包括擴增反應。在一些實施方案中，所述擴增反應包括使用雜交至所述寡核苷酸分子的5'和3'末端的引物套。在一具體的實施方案中，所述擴增反應包括使用聚合酶鏈反應(PCR)。
在一些所使用的標簽是寡核苷酸分子的實施方案中，所述檢測步驟包括非擴增反應。在一示例性實施方案中，所述非擴增反應包括使用標記的探針，其與所述寡核苷酸分子雜交。在一具體的實施方案中，所述標記的探針包含可檢測的染料。在另一個示例性實施方案中，所述非擴增反應包括使用半抗原標簽，其與寡核苷酸分子相連。在仍另一個示例性實施方案中，所述非擴增反應包括使用放射性標簽或熒光標簽，其與所述寡核苷酸分子相連。在仍一其它實施方案中，半抗原標簽、熒光標簽或放射性標簽與探針相連，所述探針與連接于待檢測的聚合物的寡核苷酸分子雜交。
在一些實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的寡核苷酸分子包括60個核苷酸或更 短的長度。在一些實施方案中，所述寡核苷酸標簽的長度選自10個核苷酸、15個核苷酸、20個核苷酸、25個核苷酸、30個核苷酸、35個核苷酸、40個核苷酸、45個核苷酸、50個核苷酸、55個核苷酸和60個核苷酸。
在一些實施方案中，所述寡核苷酸分子包含在所述標簽3'末端的反應性基團。所述反應性基團可以選自羥基、氨基、鹵素基團、環(huán)氧基、羧基和巰基。在一些實施方案中，所述反應性基團可以進一步修飾以例如產(chǎn)生與所述聚合物上的反應性基團相互作用的另外的反應性基團。
在一些實施方案中，所述聚合物包含反應性基團。所述反應性基團可以選自醛基、環(huán)氧基、羧酸基團、羥基、氨基(伯、仲或叔，包括吡啶)、巰基和芳香基。
在仍另一實施方案中，所述寡核苷酸分子包含第一反應性基團而所述聚合物包含第二反應性基團，其中所述第一和第二反應性基團彼此共價地相連。所述反應性基團可以選自上面描述的基團并且可以直接或經(jīng)由接頭偶聯(lián)。在一具體的實施方案中，含有反應性氨基的寡核苷酸分子與用1，P -羰二咪唑活化的碘乙酰胺反應，然后與聚合物聚(4-乙烯吡啶)的吡啶反應性基團綴合。
在一些實施方案中，通過純化去除未與所述聚合物相連的標簽(寡核苷酸或非寡核苷酸)。示例性的純化方法包括但不限于沉淀、通過陰離子交換膜的過濾、超濾、透析和凝膠滲透層析。[0030]在一些實施方案中，所述目標生物分子選自蛋白質(zhì)(如重組蛋白)、抗體和疫苗。在一些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
在一具體實施方案中，本發(fā)明的方法使用包括SEQ ID NO: I所不序列的寡核苷酸分子。
在一些實施方案中，所述寡核苷酸分子包括預測為無二級結構的核苷酸序列。
在一些實施方案中，所述寡核苷酸分子包括不含長度為4個或更多堿基的同聚物的核苷酸序列。
在一些實施方案中，所述聚合物是聚(4-乙烯吡啶)。在其它實施方案中，所述聚合物是聚乙烯胺。在其它實施方案中，所述聚合物是聚烯丙胺。在仍進一步的實施方案中，所述聚合物是用疏水基團修飾的聚烯丙胺或聚乙烯胺聚合物。在一具體實施方案中，所述聚烯丙胺具有150kDa的分子量，其中其胺基的30%通過與氯苯的反應來共價修飾。
在一些實施方案中，所述聚合物響應于多價陰離子的添加，例如磷酸根離子或檸檬酸根離子。
在一些實施方案中，用于檢測的標簽是熒光標簽或熒光團，其可以與聚合物相連或與結合所述聚合物的寡核苷酸分子相連?；蛘?，其可以與探針相連，所述探針與所述寡核苷酸分子雜交。
示例性的熒光標簽包括但不限于N-(4，4- 二氟-1，3，5，7_四甲基-4-硼_3a，4a- 二雜氮-s_茚烯_2_基)碘乙酰胺(別名BOD1PY 507/545IA(INVITR0GEN))和7-羥基香豆素_3_羧酸琥珀酰亞胺酯(INVITR0GEN)。
在一些實施方案中，帶有共價連接的熒光分子或熒光團的所述聚合物通過熒光分光光度法檢測和定量。
在一些實施方案中，用于檢測的標簽是放射性分子，其可以與聚合物相連或與結合所述聚合物的寡核苷酸分子相連?；蛘?，其可以與探針相連，所述探針與所述寡核苷酸分子雜交。
示例性的放射性標簽包括但不限于甲基碘[3H]和甲基碘[14C](MPBIOMEDICALS)。
在一些實施方案中，所述帶有共價連接的放射性基團的聚合物使用閃爍計數(shù)器檢測和定量。
在一些實施方案中，用于檢測的標簽是半抗原分子，其可以與聚合物相連或與結合所述聚合物的寡核苷酸分子相連?；蛘?，其可以與探針相連，所述探針與所述寡核苷酸分子雜交。示例性的半抗原標簽包括但不限于熒光素、生物素和二硝基酚。包括反應性基團的實例半抗原標簽包括DNP-X，SE, 6-(2, 4- 二硝基苯)六氨基己酸琥珀酰亞胺酯(INVITROGEN)、DSB-X 生物素C2-碘乙酰胺(脫硫生物素-X C2-碘乙酰胺)(INVITR0GEN)、和5 (6)-熒光素異硫氰酸酯混合異構體(THERMO SCIENTIFIC)。
在一些實施方案中，含有連接的半抗原的聚合物使用免疫測定如ELISA檢測和定量。示例性的ELISA實例是生物素ELISA試劑盒(ALPC0DIAGN0STICS)。
在一些實施方案中，含有共價連接的半抗原的聚合物使用本領域已知的親和素/鏈霉親和素檢測方法檢測和定量，或使用酶報道物和擴增技術(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶)、酪胺信號擴增或熒光探針檢測和定量。[0045]在本發(fā)明的方法的一些實施方案中，所述一或多種雜質(zhì)選自全細胞、細胞片段、月旨質(zhì)、DNA、RNA、宿主細胞蛋白、內(nèi)毒素和病毒。

附圖簡述
圖I示出可應用于pH依賴型聚合物的純化方法示意圖，所述聚合物例如聚(4-乙烯吡啶)，其對期望的目標生物分子具有結合親和力。
圖2示出用于純化單克隆抗體的工業(yè)標準模板。
圖3示出未綴合的寡核苷酸標簽的定量PCR校準曲線。圈出的點為 10拷貝的標簽輸入，其從懸浮于已知體積的未知重量寡核苷酸的儲液稀釋物確定。
圖4示出在寡核苷酸綴合的聚合物中寡核苷酸標簽與聚合物的摩爾比的鑒定?？招牧庑物@示用未綴合的寡核苷酸標簽獲得的讀數(shù)，實心菱形顯示用寡核苷酸標簽綴合的聚合物標準品(stanard workup)獲得的讀數(shù),而實心三角形顯示用寡核苷酸標簽綴合的聚合 物獲得的讀數(shù)，所述聚合物通過在二甲基甲酰胺中使用乙酸乙酯沉淀而從反應混合物中純化，隨后重懸于甲醇并用O. IM氫氧化鈉再沉淀。基于對綴合的和未綴合的寡核苷酸標簽的靈敏度是相似的假設，對綴合的寡核苷酸標記的聚合物的靈敏度為約萬億分之一百二十五或低于實驗測定的I分子標簽每500分子聚合物的綴合比例。
圖5是示出使用寡核苷酸標簽綴合的聚合物進行下游工藝檢測的示意圖。顯示了工藝流程，其中所述寡核苷酸標簽綴合的聚合物用于同時凈化和純化，其中所述聚合物結合目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，其中所述目標生物分子隨后被選擇性洗脫，而所述一或多種雜質(zhì)保持與所述聚合物結合。
圖6示出使用來自寡核苷酸標簽示蹤劑的讀數(shù)分析來自圖5的流程的不同級分的殘余聚合物。隨著級分自純化工藝中移動，曲線開始平坦，所有稀釋物具有約48的交叉閾值(Ct)，類似于無標簽對照。
圖7示出用于定量未知濃度的BODIPY 507/545標記聚合物的標準曲線，其用已知量的BODIPY 507/545標記的疏水修飾的聚烯丙胺刺激響應聚合物產(chǎn)生。聚合物的濃度以百萬分比(ppm)示于X軸而在545nm的強度示于y軸。
圖8示出在細胞培養(yǎng)基的絮凝和凈化作用后剩下的BODIPY 507/545標記的疏水修飾的聚烯丙胺刺激響應聚合物的定量。添加的絮凝劑劑量％(聚合物重量/細胞培養(yǎng)液體積)示于X軸，而濾液中檢測出的殘余聚合物以百萬分比示于I軸。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供檢測樣品中聚合物殘余量的方法，其中所述聚合物用于將目標生物分子與一或多種雜質(zhì)分開。在一些實施方案中，此類聚合物是“刺激響應聚合物”或“智能聚合物”。在一些實施方案中，所述智能聚合物結合目標生物分子。在其它實施方案中，所述智能聚合物結合一或多種雜質(zhì)。在另一些實施方案中，所述智能聚合物結合所述目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，其中所述目標生物分子隨后被從所述聚合物選擇性洗脫，而所述一或多種雜質(zhì)保持與所述聚合物結合。
為了使本公開能夠更容易被理解，首先定義一些術語。其它定義在詳述中各處說明。
I.定義
如本文所用，術語“目標生物分子”或“期望的目標生物分子”是指待使用聚合物(如刺激響應聚合物)與一或多種雜質(zhì)分開的生物學材料(如，靶生物分子或目標產(chǎn)物)。示例性的目標生物分子包括，例如，蛋白質(zhì)(如重組蛋白)、抗體和疫苗。在一個具體實施方案中，目標生物分子是單克隆抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法檢測聚合物的殘余量，所述聚合物可能在結合并沉淀(不一定按此順序)目標生物分子從而將其與一或多種雜質(zhì)分開后剩下。在其它實施方案中，本發(fā)明的方法檢測聚合物的殘余量，所述聚合物可能在結合并沉淀(不一定按此順序)一或多種雜質(zhì)從而將目標生物分子與一或多種雜質(zhì)分開后保留在樣品中。
如本文所用，術語“一或多種雜質(zhì)”指的是任何外來的或不期望的分子，包括全細胞、細胞片段或生物學大分子如DNA、RNA、一或多種宿主細胞蛋白、外毒素、脂質(zhì)和一或多種添加劑，其可能存在于含有待與此類外來的或不期望的分子分開的目標生物分子的樣品中。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用聚合物將一或多種雜質(zhì)從含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的樣品中去除。本發(fā)明的方法使得能夠檢測聚合物的殘余量，所述聚合物可以用于將一或多種雜質(zhì)與目標生物分子分開。如本文所用，術語“聚合物”指的是通過兩個或更多個單體單元共價連接形成的分子。這些單體單元可以是合成的或天然存在。由重復單元形成的所述聚合物可以是線性的或是分支的。聚合物的實例包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯、聚丙烯胺、聚乙烯醇、聚苯乙烯和共聚物(如聚苯乙烯-共-聚吡啶、聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸酯、普流羅尼類(pluronics)、PF68等)。在本發(fā)明的一些實施方案中，聚合物包括聚電解質(zhì)主鏈。本文還描述了共聚物，其可以在本發(fā)明的方法中使用，其中所述共聚物對刺激響應。一般而言，理解在聚合物中單體單元屬于相同類型，而共聚物將通常具有不同類型的單體單元。
如本文所用，術語“刺激響應聚合物”是在添加刺激后顯示物理和/或化學特性改變的聚合物或共聚物。典型的刺激響應是聚合物可溶性的改變。
在一些實施方案中，刺激響應聚合物在某些組的處理條件(如pH、鹽濃度或溫度)下是可溶的，而在條件(溫度、鹽濃度或pH)改變時變得不可溶并從溶液沉淀出，例如，作為對一或多種條件改變的應答。例如，聚合物聚(N-異丙基丙烯酰胺)在低于約35°C的溫度是水溶性的，但是在約35°C的溫度變成在水中不可溶。智能聚合物可以用于結合一或多種雜質(zhì)或它們可以用于結合樣品中的目標生物分子，所述樣品含有所述目標生物分子和一或多種雜質(zhì)。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以用于檢測智能聚合物的殘余量，所述智能聚合物可能在用所述智能聚合物結合和/或沉淀目標生物分子后剩下。在一些實施方案中，智能聚合物的殘余量檢測在將所述目標生物分子從聚合物上洗脫后進行。在其它實施方案中，智能聚合物的殘余量檢測在用所述智能聚合物結合和/或沉淀一或多種雜質(zhì)后進行。
術語“刺激(stimulus) ”或“刺激(stimuli) ”在本文可互換使用，旨在指環(huán)境中的物理或化學改變，其造成本發(fā)明的刺激響應聚合物的響應。因此，本發(fā)明提供了檢測聚合物殘余量的方法，所述聚合物響應于造成所述聚合物可溶性改變的刺激。聚合物可以響應的刺激的實例包括但不限于，例如，溫度的改變、電導率的改變、電場和/或磁場的改變和/或pH的改變。在一些實施方案中，刺激包括向樣品添加絡合劑或復合物形成鹽。在多個實施方案中，一般在向樣品添加聚合物后添加刺激。不過，所述刺激也可以在向樣品添加聚合物期間或之前添加所述刺激。[0065]在一個具體實施方案中，刺激是鹽。示例性的鹽包括但不限于，多價離子如檸檬酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽和EDTA，和離子締合鹽如高氯酸鹽、十二烷基硫酸鈉鹽、十二烷基苯硫酸鹽、Fe (II) -4-氯-2-硝基酚陰離子、四苯硼酸鈉鹽和六硝基苯酚胺(見例如ANALYTICAL SCIENCES, DECEMBER1987, VOL. 3，p. 479)。一般而言，本領域技術人員會熟悉本領域公知并可用作本文描述聚合物的刺激物的多種鹽。
在本文描述的多個實施方案中，在添加結合目標生物分子和/或一或多種雜質(zhì)的聚合物后，向含有所述目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的樣品添加刺激，例如鹽。刺激(如鹽)的添加導致游離聚合物以及所述聚合物與所述目標生物分子和/或一或多種雜質(zhì)的可溶和不可溶復合物的沉淀。
誘導所述可溶或不可溶復合物沉淀所需的鹽的量取決于例如以下因素，例如，pH、聚合物濃度和所述聚合物結合的目標生物分子或一或多種雜質(zhì)的濃度。例如，一些聚電解質(zhì)如聚烯丙胺具有隨pH(胺質(zhì)子化水平)變化的電荷密度。隨著pH升高，電荷密度水平降 低，因此誘導沉淀所需的刺激程度將不同于在較低PH或較高電荷密度狀態(tài)下的刺激程度。
如本文所用，術語“富集”、“分開”、“分離”和“純化”是指用聚合物從樣品或含生物學材料的流中純化一或多種期望的生物分子的過程。在多個實施方案中，富集、分開、分離或純化目標生物分子包括去除存在于含有所述目標生物分子的樣品中的一或多種雜質(zhì)?？梢酝ㄟ^使用結合一或多種雜質(zhì)的聚合物或通過使用結合目標生物分子的聚合物將所述目標生物分子和一或多種雜質(zhì)分開。在一些實施方案中，聚合物結合目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，其中隨后從所述聚合物選擇性洗脫所述目標生物分子，而所述一或多種雜質(zhì)保持結合。
如本文所用，術語“殘余量”或“殘余量”指的是用于純化生物學材料的聚合物如刺激響應聚合物或用于絮凝的聚合物的量，該量等于或少于在所述聚合物結合和沉淀一或多種雜質(zhì)或結合和沉淀所期望的目標生物分子后保持溶解和/或分散于樣品或含生物材料的流中的量。所述殘余量還指的是聚合物如刺激響應聚合物的量，該量等于或少于在施加刺激使得所述聚合物結合和沉淀或沉淀和結合一或多種雜質(zhì)或期望的目標生物分子后保持溶解和/或分散于樣品或含生物材料的流中的量。
如本文所用，術語“組合物”、“溶液”或“樣品”指的是含生物學材料的流。一般地所述含有生物學材料的流指的是待純化的目標生物分子或期望的產(chǎn)物與一或多種不期望的實體或雜質(zhì)的混合物。在一些實施方案中，所述樣品包含目標生物分子(如治療性蛋白質(zhì)或抗體)以及一或多種雜質(zhì)(例如宿主細胞蛋白、DNA、RNA、脂質(zhì)、細胞培養(yǎng)添加劑、細胞和細胞碎片)。通常而言，所述含生物學材料的流可以進行如圖I所示的純化方案。在一些實施方案中，所述樣品包括原料或細胞培養(yǎng)基，目標生物分子或期望的產(chǎn)物被分泌入其中。在一些實施方案中，待用本文所述的一或多種刺激響應聚合物純化的生物分子所來自的樣品在所述樣品與刺激響應聚合物接觸前是“部分純化的”。部分純化可以通過例如使所述樣品進行一或多個純化步驟來完成，所述純化步驟例如圖2所示的一或多個非親和層析步驟?？梢酝ㄟ^沉淀一或多種雜質(zhì)或通過沉淀目標分子將所述生物分子與一或多種不期望的實體或雜質(zhì)分開。
在一些實施方案中，刺激響應聚合物在第一組條件下選擇性地和可逆地結合目標生物分子并在第二組條件下(如在向樣品加入刺激時)沉淀所述目標生物分子。在其它實施方案中，刺激響應聚合物在第一組條件下選擇性地結合一或多種雜質(zhì)并在第二組條件下沉淀所述一或多種雜質(zhì)。在一些實施方案中，刺激響應聚合物在加入刺激時選擇性地結合和沉淀宿主細胞蛋白、DNA、全細胞、細胞碎片、病毒和/或細胞培養(yǎng)添加劑中的一或多種。在仍另外的實施方案中，刺激響應聚合物在第一組條件下結合目標生物分子以及一或多種雜質(zhì)，并且在第二組條件下所述目標生物分子從所述聚合物選擇性地洗脫，而所述一或多種雜質(zhì)保持結合。本文所用術語“沉淀(precipitate)”、“沉淀(precipitating) ” 或“沉淀(precipitation)”指的是結合的或(如，與目標生物分子或一或多種雜質(zhì)在復合物中)未結合的聚合物從水性和/或可溶狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉撬院?或不可溶狀態(tài)。
如本文所用，術語“標簽”指的是能夠結合本文所用的聚合物并且能夠使用合適的手段檢測的任何分子。在一個實施方案中，在本發(fā)明的檢測方法中使用的標簽是寡核苷酸分子，其能夠使用擴增手段或非擴增手段檢測。在另一實施方案中，本發(fā)明的檢測方法使用的標簽是半抗原分子、熒光分子或放射性分子，其直接與所述聚合物相連并能夠使用本領域公知的或本文描述的合適的手段容易地檢測。此外，在某些實施方案中，半抗原分子(如生物素)、放射性分子或熒光分子不是直接與聚合物相連，它們與寡核苷酸分子相連，而所述寡核苷酸分子接著連接至聚合物。在另外的實施方案中，半抗原分子、熒光分子或放射性分子與探針相連并且隨后能被檢測，其中所述探針與連接于聚合物的寡核苷酸分子雜交。
如本文所用，術語“寡核苷酸標簽”或“寡核苷酸分子”指的是能夠結合聚合物并且用于檢測該聚合物的核酸分子。在一具體實施方案中，本發(fā)明的方法使用的寡核苷酸分子包括SEQ ID NO: I所示序列。期望本發(fā)明的方法所使用的寡核苷酸標簽或分子的序列并不另外在所述含生物材料的流的多種組分中出現(xiàn)。本領域技術人員能夠容易地驗證所述寡核苷酸標簽序列的存在或不存在，例如，使用本領域公知的計算方法(如，針對宿主細胞DNA序列進行BLAST)或?qū)嶒灧椒?如雜交技術)。在一些實施方案中，所述聚合物和所述寡核苷酸分子之間的關聯(lián)包括共價連接。在一些實施方案中，所述寡核苷酸分子使用擴增反應檢測。在其它的實施方案中，所述寡核苷酸分子使用非擴增反應檢測，例如在所述寡核苷酸分子本身用可檢測部分(如半抗原分子(如生物素)、熒光分子或放射性分子)標記的情況下。此外，使用如探針的雜交方法可以用于檢測所述寡核苷酸分子。在一些實施方案中，探針用半抗原分子、熒光分子或放射性分子標記。
如本文所用，術語“引物”指的是單鏈核酸分子，其能夠與寡核苷酸分子或其反向互補鏈雜交并能夠在合適的條件下參與擴增反應(如聚合酶鏈反應)。在一些實施方案中，寡核苷酸分子使用一套5'和3'引物檢測，所述引物能與寡核苷酸分子雜交并能用于檢測所述寡核苷酸分子。檢測的所述寡核苷酸分子的量代表了樣品中殘余聚合物的量。
如本文所用，術語“探針”指的是單鏈核酸分子，其能在例如嚴格性雜交條件下與寡核苷酸分子雜交。在一些實施方案中，所述探針是標記的探針，其中具有與所述探針連接的可檢測信號。在一些實施方案中，所述可檢測信號是標記，如染料。在一些實施方案中，檢測的所述探針的量代表了樣品中殘余聚合物的量。在一些實施方案中，所述探針包括可以被檢測的半抗原分子、放射性分子或熒光分子。
如本文所用，術語“能夠雜交”指在反平行核酸鏈之間能形成沃森-克里克-類型氫鍵，其支持所述核酸鏈的在給定條件如嚴格性雜交條件下的雙鏈體狀態(tài)。[0078]如本文所用，術語“檢測所述標簽”指的是允許測量和定量本文所用的標簽的方法。在一些所述標簽是寡核苷酸分子的實施方案中，檢測包括使用擴增反應(如使用聚合酶鏈反應)。在其它所述標簽是寡核苷酸分子的實施方案中，檢測包括使用非擴增反應(如使用標記的探針或使用與所述寡核苷酸分子或所述探針相連的可檢測的部分例如，半抗原分子、熒光分子或放射性分子)。在仍其它實施方案中，標簽與聚合物而不是寡核苷酸相連，其隨后能被檢測。因此，包括但不限于如半抗原分子、熒光分子或放射性分子的可檢測部分可以與聚合物相連。
如本文所用，術語“擴增反應”指的是分子初始數(shù)目被增加至較大的分子數(shù)目的方法。在一些實施方案中，擴增反應采用聚合酶鏈反應。
如本文所用，術語“反應性基團”指的是分子中的一組原子，其在給定的一組條件下比所述分子其余原子更優(yōu)選地與另外的分子反應。
如本文所用，本文所用的寡核苷酸分子的“二級結構”指的是通過單個核酸分子內(nèi)·的堿基配對相互作用產(chǎn)生的三維形式。一般而言，在核酸分子的例子中，所述二級結構由含氮堿基之間的氫鍵產(chǎn)生。在本發(fā)明的多個實施方案中，期望本發(fā)明的方法中使用的寡核苷酸分子沒有二級結構。使用本領域技術人員熟知的和本文描述的一或多種軟件工具能夠容易地預測核酸分子中的二級結構。
11·使用聚合物純化目標生物分子的示例性方法
一般而言，目標生物分子，例如蛋白質(zhì)(如重組蛋白或抗體)可以使用這樣的方法純化，所述方法采用在宿主細胞中表達所述蛋白質(zhì)(如通過使用包括編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子的宿主細胞)，隨后純化所述蛋白質(zhì)。
在一些例子中，使期望的宿主細胞系在生物反應器中生長來以期望的水平表達所述蛋白質(zhì)。示例性的宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤(NSO)細胞、細菌(如大腸桿菌)細胞和昆蟲細胞。一旦蛋白質(zhì)以期望的水平表達，從所述宿主細胞去除并收獲所述蛋白質(zhì)。通常通過過濾或離心從所述含蛋白液體去除懸浮顆粒，例如細胞、細胞片段、脂質(zhì)和其它不可溶物質(zhì)，獲得含有溶液中的目標蛋白以及其它可溶雜質(zhì)的凈化的液體。
第二步一般包括純化所收獲的蛋白質(zhì)以去除該方法固有的一或多種雜質(zhì)。此類雜質(zhì)的實例包括例如宿主細胞蛋白(HCP，其是除期望的蛋白或靶蛋白之外的蛋白質(zhì))、核酸、外毒素、病毒和蛋白質(zhì)聚集體。該純化方法一般包括若干層析步驟，其可包括在固體基質(zhì)(如多孔瓊脂糖、聚合物或玻璃)上的親和層析、離子交換疏水相互作用層析等。示例性的純化方法示于圖2。
近年來已經(jīng)研究了其它用于純化蛋白質(zhì)的可選的方法。一種這樣的方法包括絮凝技術(見如W02008/091740)。在該技術中，將可溶的聚電解質(zhì)加入凈化的或未凈化的細胞培養(yǎng)肉湯中以捕獲雜質(zhì)由此形成絮凝物，其可以沉降并且隨后可以從所述蛋白質(zhì)溶液中去除。
在共同未決的美國專利公開號20090036651 (以其整體通過引用并入本文)中，使用在某些條件(如溫度或pH)下可溶的聚合物在其可溶狀態(tài)選擇性結合一或多種雜質(zhì)，然后在條件(pH或溫度等)改變時沉淀出來，去除伴隨其的一或多種雜質(zhì)。所述目標生物分子可以進一步進行傳統(tǒng)層析或膜吸收等。
圖I示出可應用于pH依賴型聚合物的非限制性純化方法示意圖，所述聚合物例如聚(4-乙烯吡啶)，其能夠結合一或多種雜質(zhì)。在第一步，調(diào)整混合物至正確的參數(shù)以維持所選的聚合物在溶液中。或者，如果混合物的條件已經(jīng)使得所述聚合物在混合物中可溶，可以無需進一步的調(diào)整。并且，所述聚合物可以作為固體添加至未調(diào)整的混合物，然后將所述混合物(含有所述固體聚合物)調(diào)整至正確參數(shù)以將所述聚合物溶解于所述混合物中。在第二步，將所述聚合物添加至混合物中并使其進入溶液從而與混合物中的不同成分接觸。預期所述第二步可以在生物反應器中發(fā)生，例如，如期望的如果所述生物反應器是一次性產(chǎn)品或位于獨立的支持槽中。在第三步中，改變所述混合物條件以導致所述聚合物從溶液沉淀出同時保留所述混合物的一或多種實體在混合物中。然后在第四步中使所述混合物和所述沉淀的聚合物相互分離。所述沉淀物和剩下的混合物可以通過離心或過濾分離。
在一些實施方案中，一旦細胞培養(yǎng)液被凈化，所述目標生物分子可以進行一或多種已知的額外的處理步驟例如層析步驟，包括但不限于，離子交換、具有或不具有帶電UF膜的疏水相互作用或親和性能正切流動過濾、病毒去除/滅活步驟、最終過濾步驟等。
從含生物學材料的流中純化目標生物分子中使用聚合物的一個不期望的后果是有可能不確定量的聚合物保留在所述流中。如果需要，可以進行一或多個額外的步驟來確 保全部聚合物已經(jīng)從所述混合物中去除，其通過使所述混合物進行含有會從所述混合物去除任何殘余聚合物的材料的步驟，所述材料例如離子交換樹脂、活化碳、鋁、硅藻土等。然而，需要有靈敏的測定來定量殘余聚合物量并追蹤上面描述的在去除任何殘余聚合物中的步驟的效率。本發(fā)明的方法提供了改進的和靈敏的測定來檢測和定量聚合物的殘余量。
不希望受理論限制，理解本發(fā)明的所述檢測方法可以與任何的采用聚合物來沉淀目標生物分子和/或一或多種雜質(zhì)的純化方法聯(lián)合使用，其中如本文所述，可以將可檢測的寡核苷酸或非寡核苷酸標簽與所述聚合物連接。
III.用于純化目標牛物分子的方法中的示例件聚合物
包括描述于美國專利公開號20080255027、20090036651、20090232737 和20110020327以及美國專利申請?zhí)?3/108576 (其各自以其整體通過弓I用并入本文)中的那些的聚合物可以用于本文描述的方法中。
示例性的聚合物包括但不限于聚(N-異丙基丙烯酰胺)、瓊脂糖、葡聚糖、聚氧化乙烯、羥烷基纖維素、陽離子聚電解質(zhì)(選自包括殼聚糖、聚乙烯吡唳、乙烯吡啶共聚物、含伯胺聚合物、含仲胺聚合物、含叔胺聚合物的組)和陰離子聚電解質(zhì)(選自包括丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物以及甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯共聚物的組)。
一或多種聚合物，例如聚(N-乙烯基己內(nèi)酰胺)、聚(N-丙烯酰哌啶)、聚(N-乙烯基異丁酰胺)、聚(N-取代的丙烯酰胺)(如聚(N-異丙基丙烯酰胺))、聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)和聚(N-丙烯酰I-N-烷基哌嗪))、羥烷基纖維素、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2-乙烯吡啶或4-乙烯吡啶的聚合物或共聚物和殼聚糖，其具有或不具有與所述聚合物連接的配體或官能團，可以在本文描述的方法中使用以選擇性和可逆地結合目標生物分子或一或多種雜質(zhì)，由此使樣品(如含生物學材料的流)中的一或多種雜質(zhì)與所述目標生物分子分開。
在一具體實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的聚合物是聚乙烯胺聚合物。在另一實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的聚合物是聚烯丙胺聚合物。在仍另一實施方案中，本發(fā)明的方法中使用的聚合物是用疏水基團修飾的聚烯丙胺聚合物，如2011年5月16日提交的美國專利申請?zhí)?3/108576中所述描述，其全部內(nèi)容以其整體通過引用并入本文。
IV.鑒定用于與聚合物連接的寡核苷酸分子的方法
在本文描述的一些檢測殘余聚合物的方法中，可以采用寡核苷酸分子。可以計算機模擬(in silico,如使用軟件程序)產(chǎn)生40個核苷酸長的可能的寡核苷酸分子文庫，其具有幾乎相等的核苷酸堿基分布(即A:C:G:ri:l:l:l)并且避免4個或更多個連續(xù)的C或G堿基。一旦鑒定可能的寡核苷酸序列，期望所述序列不在所述含生物學材料的流中出現(xiàn)。因此，使用計算機技術(如，通過針對宿主細胞DNA的基因組序列運行BLAST搜索)和/或?qū)嶒灱夹g(如通過與所述含生物學材料的流雜交)能夠驗證所述序列的存在與否。
V.使用寡核苷酸分子標記聚合物的方法
可以合成具有內(nèi)部或末端反應性基團(例如鹵素、環(huán)氧基、羥基、氨基、羧酸或巰基)的寡核苷酸，其隨后連接至聚合物。此外，具有內(nèi)部或末端反應性基團的寡核苷酸可 以進一步用多種化學(例如溴化氰、N-羥基琥珀酰亞胺酯、1，I'-羰基二咪唑、碳二亞胺EDC、縮水甘油基、有機磺酰氯、二氫惡唑酮、三聚氯氰和馬來酰亞胺)活化以促進與聚合物的連接° 見，如 Immobilized affinity ligand techniques. Hermanson, Mallia and Smith1992。
在一些實施方案中,對于含有3'末端氨基的寡核苷酸,可以使用用1，I'-羰基二咪唑活化的碘乙酰胺來連接上末端碘基團，其隨后與聚乙烯吡啶中的吡啶反應，產(chǎn)生所述寡核苷酸與所述聚合物的共價連接。也可以使用表氯環(huán)氧丙烷來將末端縮水甘油基連接至含3'末端氨基的寡核苷酸，其隨后與聚乙烯吡啶中的吡啶反應，產(chǎn)生所述寡核苷酸與所述聚合物的共價連接。此處描述的具體實施方案并不旨在受到任何限制。
VI.使用非寡核苷酸分子標記聚合物的方法
在一些實施方案中，聚合物用非寡核苷酸分子，例如半抗原分子、熒光分子或放射性分子標記。在一些實施方案中，所述分子具有末端或內(nèi)部反應性基團，所述基團能直接與所述聚合物反應產(chǎn)生共價綴合。在一些實施方案中，所述分子的末端或內(nèi)部基團可以用已知的蛋白質(zhì)化學方法(如形成N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS-酯)、酸性氟化物、四氟苯基酯(TFP-酯)或STP-酯)活化使得其與所述聚合物的氨基或吡啶官能反應形成酰胺(見如 Immobilized affinity ligand techniques. Hermanson, Mallia and Smith 1992)。所述偶聯(lián)反應可以在有機溶液(如甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基亞砜(DMSO))或pH為pH5-pH12的水性溶液中進行。在一個實施方案中，所述偶聯(lián)反應可以在室溫(約20°C至約60 0C )進行。
在本文所述的方法中可以使用的熒光分子的實例包括但不限于4-乙酰氨基-4'-異硫氰酸二苯乙烯_2，2' -二磺酸；吖啶和衍生物吖啶、吖啶異硫氰酸酯；5-(2/ -氨乙基)氨基萘-I-磺酸(EDANS) ;4_氨基酸-N-[3-乙烯基磺?；?苯基]萘酰亞胺-3，5 二磺酸酯；N-(4-苯胺基-I-萘基)馬來酰亞胺；鄰氨基苯甲酰胺；B0DIPY ；alexa ；突光素；綴合的多染料(multi-dyes);燦爛黃(BrilliantYellow);香豆素和衍生物香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC, Coumarinl20)、7_氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran151);花青染料；焰紅染料；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI) ;5' 5"-二溴鄰苯三酚-磺酞(溴代鄰苯三酚紅)；7_二乙氨基-3-(4'-異硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二亞乙基三胺五乙酸酯；4，4'可用作標簽的放射性分子的實例是含同位素的分子，包括但不限于14C、3H、45Ca、 51Cr、57Co、36Cl、125I、32P、33P 和 35S0
可用作標簽的半抗原分子包括DNP-X，SE, 6_(2，4_ 二硝基苯)六氨基己酸琥珀酰亞胺酯(INVITR0GEN)、DSB-X 生物素C2-碘乙酰胺(脫硫生物素-X C2-碘乙酰胺)(INVITR0GEN)和5 (6)-熒光素異硫氰酸酯混合異構體(THERMO SCIENTIFIC)。
VII.去除未連接的標簽的方法
在用標簽標記聚合物后，需要從樣品去除任何未連接的標簽。例如，在用DMF和水溶液(50:50體積比)預平衡后，通過陰離子交換膜(如Chromasorb (MILLIPORE, Billerica, Mass.))過濾，可以純化DNA標記的PVP溶液以去除未綴合的DNA標簽。
可以通過沉淀實現(xiàn)從溶液去除未綴合的標簽(寡核苷酸或非寡核苷酸)。例如，以特定比例將溶劑與含標記的聚合物的溶液混合，由此將未綴合標簽保留在上清液中而所述標記的聚合物沉淀。或者，可以選擇合適的條件，其有利于保留標記的聚合物而沉淀未綴合的標簽。本領域技術人員基于本領域的知識結合常規(guī)實驗能否容易地鑒定用于沉淀的合適的條件。
可以基于標稱分子量截留值(“NMWC0”)選擇超濾/滲濾膜以將目標產(chǎn)物保留在滲余物，同時允許低分子量材料如未連接的標簽通入濾出液?；谀繕水a(chǎn)物的大小和性質(zhì)并結合常規(guī)實驗，本領域技術人員將能夠選擇這樣的膜。在一具體的實施方案中，其中所述標簽是10-60個堿基大小的寡核苷酸，而所述聚合物是大小為200000Da的聚(4-乙烯吡唳)，可以使用NMWCO為30的Millipore Centricon Plus-70 單元進行超濾/滲濾。可以基于排阻分子量選擇凝膠過濾層析柱，使得大分子量材料如聚合物在固定相的孔結構中花較少的時間并且比較小分子量材料更快地被洗脫，所述較小分子量材料例如未連接的寡核苷酸，其在所述孔結構中花更多時間并且在較后的時間洗脫。基于目標材料的大小和性質(zhì)并結合常規(guī)實驗，本領域技術人員將能夠容易地選擇這樣的柱。
在一具體的實施方案中，其中所述標簽是10-60個堿基大小的寡核苷酸，而所述聚合物是大小為200000Da的聚(4-乙烯吡啶)，可以使用具有400000Da的排阻分子量的SHOffA DENKO K. K GPC KF-804L柱進行凝膠滲濾層析。
VIII.檢測與聚合物相連的寡核苷酸分子的方法
如本文所述，在將寡核苷酸分子連接至聚合物上并隨后去除任何未連接的分子之后，所述已連接的分子可以使用擴增反應或非擴增反應檢測。在擴增反應的情況中，選擇與所述分子5'和3'部分雜交的引物。例如，可以選擇引物使得游離或聚合物綴合形式的所述分子序列可以使用擴增反應如聚合酶鏈反應(PCR)擴增和檢測。在一些實施方案中，通過直接測量基于所述分子的熒光來顯示擴增產(chǎn)物以獲得交叉閾值(Ct)。所測得的Ct值可以用來確定樣品中存在的分子的濃度，其使用從已知濃度的分子產(chǎn)生的校準曲線。
在非擴增反應的情況中，可以使用標記的探針來檢測所述寡核苷酸分子。或者，所述寡核苷酸分子本身可以用可檢測部分標記，所述可檢測部分例如半抗原標簽、熒光標簽或放射性標簽。在一些實施方案中，用可檢測部分標記與所述寡核苷酸分子雜交的探針。
VIII.檢測與聚合物相連的非寡核苷酸分子的方法
在將非寡核苷酸分子(如熒光標簽、放射性標簽或半抗原標簽)連接至聚合物并隨后去除任何未連接的分子后，可以使用多種技術中的任一種(取決于用作標簽的該分子)來檢測已連接的分子。示例性檢測方法包括放射性檢測、光吸收檢測(如紫外-可見光吸收檢測)、光發(fā)射檢測(如熒光或化學發(fā)光)、免疫測定(如ELISA)以及親和素/鏈霉親和素檢測方法。能夠傳感來自單分子的熒光的裝置包括掃描隧道顯微鏡(SiM)以及原子力顯微鏡(AFM)。對于放射性信號,可以使用磷屏顯像儀(phosphorimager)。其它顯像設備供應商包括 General Scanning Inc. (Watertown, Mass) >Genix Technologies (Waterloo,Ontario, Canada)和 Applied Precision Inc。
本發(fā)明通過下面的實施例進一步闡述，所述實施例并不旨在限制本發(fā)明。本申請全文引用的所有參考文獻、專利和專利公開的內(nèi)容以及其附圖，均通過引用并入本文。
實施例
實施例I選擇用于綴合至聚合物的寡核苷酸序列
計算機模擬(in silico,如使用軟件程序)產(chǎn)生50個或更多個長度為40個核苷酸的潛在的寡核苷酸分子的文庫，其具有幾乎相等的核苷酸堿基分布(即A:C:Gri:l:l:l)并且避免4個或更多個連續(xù)的C或G堿基。
使用M-fold 程序(Zuker M. 2003. Mfold web server for nucleic acidfoldingand hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31:3406)針對二級結構對所述寡核苷酸標簽文庫成員進行篩選，選擇對線性DNA在37°C，ImM MgCl2和50mM NaCl下的預測，并以所預測的結構的解鏈溫度區(qū)分優(yōu)先次序，較低的較好，如下表I所示。
隨后化學合成選定的寡核苷酸標簽序列，其具有多個內(nèi)部或末端反應性基團用于綴合至聚合物。
表I
權利要求
1.檢測包含目標生物分子的樣品中的聚合物殘余量的方法，其中所述聚合物用于將所 述目標生物分子與一或多種雜質(zhì)分開，所述方法包括以下步驟(1)使所述樣品與所述聚 合物接觸，其中所述聚合物與標簽相連；和(2)檢測所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表所述包含目標生物分子的溶液中的殘余聚合物的量。
2.權利要求
1的方法，其中所述聚合物與寡核苷酸標簽相連。
3.權利要求
2的方法，其中使用擴增反應檢測所述寡核苷酸標簽。
4.權利要求
3的方法，其中所述擴增反應包括添加能夠與所述寡核苷酸標簽5'和3' 末端雜交的一套引物。
5.權利要求
2的方法，其中所述寡核苷酸標簽與半抗原分子、熒光分子或放射性分子 相連。
6.權利要求
2的方法，其中所述檢測步驟包括非擴增反應。
7.權利要求
6的方法，其中所述非擴增反應包括使用標記的探針。
8.權利要求
7的方法，其中所述標記的探針包含可檢測染料。
9.權利要求
1的方法，其中所述聚合物使用共價連接與所述寡核苷酸標簽相連。
10.權利要求
3的方法，其中所述擴增反應包括聚合酶鏈反應。
11.權利要求
2的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含選自10個核苷酸、15個核苷酸、20 個核苷酸、25個核苷酸、30個核苷酸、35個核苷酸、40個核苷酸、45個核苷酸、50個核苷酸、 55個核苷酸和60個核苷酸的長度。
12.權利要求
2的方法,其中所述寡核苷酸標簽包含60個核苷酸或少于60個核苷酸的 長度。
13.權利要求
11的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含位于所述標簽3'末端的反應性基團。
14.權利要求
12的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含位于所述標簽3'末端的反應性基團。
15.權利要求
13的方法，其中所述反應性基團選自鹵素基團、環(huán)氧基、羥基、氨基、巰基 和羧基。
16.權利要求
14的方法，其中所述反應性基團選自鹵素基團、環(huán)氧基、羥基、氨基、巰基 和羧基。
17.權利要求
15的方法，其中所述反應性基團被進一步修飾。
18.權利要求
16的方法，其中所述反應性基團被進一步修飾。
19.權利要求
1的方法，其中所述聚合物包含反應性基團。
20.權利要求
1的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含第一反應性基團而所述聚合物包 含第二反應性基團，且其中所述第一和第二反應性基團彼此共價地相連。
21.權利要求
1的方法，其中通過純化去除不與所述聚合物相連的寡核苷酸標簽。
22.權利要求
1的方法，其中所述生物分子選自蛋白質(zhì)、抗體和疫苗。
23.權利要求
22的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
24.權利要求
1的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含SEQID NO: 1所示的序列。
25.權利要求
1的方法，其中所述寡核苷酸標簽包含預測為無二級結構的核苷酸序列。
26.權利要求
1的方法，其中所述寡核苷酸標簽包括不含長度為4個或更多堿基的同聚物的核苷酸序列。
27.權利要求
1的方法，其中所述聚合物是聚(4-乙烯吡啶)。
28.權利要求
1的方法，其中所述聚合物是聚烯丙胺。
29.權利要求
1的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺。
30.權利要求
1的方法，其中所述聚合物是刺激響應聚合物。
31.權利要求
30的方法，其中所述刺激響應聚合物對鹽刺激響應。
32.權利要求
30的方法，其中所述刺激響應聚合物對pH刺激響應。
33.權利要求
1的方法，其中所述聚合物含有伯胺和疏水部分。
34.權利要求
1的方法，其中所述聚合物是聚乙烯胺，其1%_80%的胺用芳香基共價修飾。
35.權利要求
30的方法，其中所述聚合物對多價陰離子刺激響應。
36.權利要求
1的方法，其中所述檢測步驟包括免疫測定或ELISA。
37.權利要求
1的方法，其中通過結合和沉淀在包含目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的 樣品中的一或多種雜質(zhì)，所述聚合物將所述目標生物分子和一或多種雜質(zhì)分開。
38.權利要求
1的方法，其中通過結合和沉淀在包含目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的 樣品中的目標生物分子，所述聚合物將所述目標生物分子和一或多種雜質(zhì)分開。
39.權利要求
1的方法，其中所述寡核苷酸標簽與熒光標簽或放射性標簽或半抗原標 簽相連。
40.檢測刺激響應聚合物殘余量的方法，所述刺激響應聚合物用于將目標生物分子與 一或多種雜質(zhì)分開，所述方法包括以下步驟(1)使含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的溶液和刺激響應聚合物接觸，其中所述聚 合物與標簽相連，由此形成聚合物和一或多種雜質(zhì)的復合物；(2)向所述溶液施加刺激，由此沉淀所述復合物；(3)從所述溶液去除沉淀物；和(4)檢測含有所述目標生物分子的溶液中的所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表所 述含有目標生物分子的溶液中的殘余聚合物的量。
41.權利要求
40的方法，其中所述刺激響應聚合物含有伯胺和疏水部分。
42.權利要求
40的方法，其中所述刺激響應聚合物與熒光標簽或放射性標簽或半抗原 標簽相連。
43.權利要求
40的方法，其中所述刺激響應聚合物對多價陰離子刺激響應。
44.權利要求
42的方法，其中所述半抗原標簽包括生物素。
45.權利要求
40的方法，其中所述檢測步驟包括使用ELISA測定。
46.檢測刺激響應聚合物殘余量的方法，所述刺激響應聚合物用于將溶液中的目標生 物分子與一或多種雜質(zhì)分開，所述方法包括以下步驟(1)使含有目標生物分子和一或多種雜質(zhì)的溶液和刺激響應聚合物接觸，其中所述聚 合物與標簽相連，并且所述聚合物和所述目標生物分子以及所述一或多種雜質(zhì)在第一組條 件下形成復合物；(2)向所述溶液添加刺激，由此沉淀所述復合物；(3)使沉淀物置于第二組條件，由此選擇性地從所述復合物洗脫所述目標生物分子；(4)檢測含有所述目標生物分子的洗脫液中的所述標簽，其中所檢測的標簽的量代表洗脫液中殘余聚合物的量。
47.權利要求
46的方法，其中所述方法在步驟(2)和(3)之間還包括洗滌步驟。
專利摘要
本發(fā)明涉及檢測在純化生物分子的方法中使用的聚合物(包括刺激響應聚合物)殘余量的方法，所述生物分子例如蛋白質(zhì)、多肽、抗體、疫苗等。
文檔編號C12Q1/68GKCN102933722SQ201180028107
公開日2013年2月13日 申請日期2011年6月8日
發(fā)明者M·齊爾曼, J·賈比爾, J·哈姆日克 申請人:Emd密理博公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan