專利名稱:一種利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域：
。
技術(shù)背景
膽固醇含量升高是引起高血脂的主要原因，而人體膽固醇主要來自自身的合成。 在膽固醇合成過程中，羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶使HMG-CoA轉(zhuǎn)變成甲基二羥戊酸，這是膽固醇生物合成中的限速步驟，在HMG-CoA還原酶抑制劑存在條件下，HMG-CoA 還原酶受到抑制，無法正常發(fā)揮作用，膽固醇的生成過程受到干擾，從而達(dá)到降低血脂的目的。他汀類藥物屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物。
無錫他汀由洛伐他汀經(jīng)擬無枝酸菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，是一種新型高效HMG-CoA還原酶抑制劑，抑制作用為洛伐他汀的4倍。中國發(fā)明專利公報(bào)2010年12月8日公開了一種提高無錫他汀產(chǎn)量的方法，專利申請?zhí)?01010225950. 6，專利公開號101906446A，該方法利用游離擬無枝酸菌分段發(fā)酵，通過兩階段PH控制，提高無錫他汀的產(chǎn)量。其缺點(diǎn)是游離擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性較差，并且對發(fā)酵過程中的剪切力等條件較為敏感，這將大大影響分段發(fā)酵無錫他汀的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法，通過固定化提高擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性以及對發(fā)酵條件的敏感度， 并進(jìn)一步提高無錫他汀產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為
將擬無枝酸菌(Amycolatopsis sp.，保藏編號為CGMCC NO. 1149，在專利號為 200410044893. 6的專利申請中進(jìn)行了保藏)進(jìn)行固定化處理，利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀，提高擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性，提高無錫他汀的產(chǎn)量，具有較好的操作穩(wěn)定性，可重復(fù)利用。
所述擬無枝酸菌固定化方法為將培養(yǎng)好的種子菌懸液與海藻酸鈉溶液按照 2 10的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入CaCl2溶液中，固定lh，濾出小珠，用蒸餾水洗凈，得到固定化細(xì)胞。
所述兩階段發(fā)酵控制條件為發(fā)酵第一階段，固定化細(xì)胞經(jīng)過4 增殖培養(yǎng)后，按 1. 0-3. Og/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C發(fā)酵4 生成產(chǎn)物I，發(fā)酵pH為7. 5 ；發(fā)酵第二階段，將第一階段發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞洗凈，加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，按照0. 1-0. 3g/L的的濃度加入產(chǎn)物I溶液，30°C發(fā)酵IOh生成無錫他汀，發(fā)酵pH為5. 5。
所述擬無枝酸菌可用于多次發(fā)酵，用無菌去離子水將上一批發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞沖洗三次，加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，進(jìn)行下一批發(fā)酵，最適發(fā)酵批次為5批。
產(chǎn)物I的制備pH 7. 5的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中加入底物洛伐他汀發(fā)酵48h，中間產(chǎn)物I大量生成，離心濃縮，以大孔吸附樹脂HP 20為柱填料，甲醇為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集 60% 70%甲醇梯度富集的中間產(chǎn)物I的洗脫液，濃縮后微孔膜過濾除菌備用。
洛伐他汀、產(chǎn)物I以及無錫他汀含量的檢測方法將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液離心，微膜過濾后利用HPLC檢測。
HPLC 條件色譜柱 Kromasi 1 C18 (5 μ m，250 X 4. 6mm)；流動相甲醇-0.5% 乙酸 (80 20)；流速 0. 8mL/min ；柱溫:25°C ；進(jìn)樣量 20 μ L ；檢測波長 237nm。
本發(fā)明提出利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法，通過對擬無枝酸菌進(jìn)行固定化處理，并進(jìn)行多批次分段發(fā)酵，將擬無枝酸菌對洛伐他汀的耐受濃度從lg/L 提升到3g/L ；將發(fā)酵液中產(chǎn)物I的濃度從0. 55g/L提高到1. 92g/L ；使無錫他汀的產(chǎn)量從 0. 165g/L提高到0. 225g/L，固定化細(xì)胞具有較好的操作穩(wěn)定性，可重復(fù)利用。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、固定化細(xì)胞制備
將擬無枝酸菌斜面接到種子培養(yǎng)基，28°C靜止培養(yǎng)48h。種子液通過兩層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集的濾液為孢子種子液。將獲得的種子液與20g/L海藻酸鈉溶液按照ImL菌懸液/5mL凝膠的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入10g/L的CaCl2溶液中， 注射高度為10cm，固定lh，濾出小珠，用蒸餾水洗凈，得到粒徑為3mm左右的固定化細(xì)胞。
種子培養(yǎng)基組成為(g/L)=KNO3 1，無水 K2HPO4 0. 5，MgSO4 · 7H20 0. 5，NaCl 0. 5， FeSO4 · 7H20 0. 01，可溶性淀粉 20，pH 7. 2-7. 4。
2、發(fā)酵生產(chǎn)無錫他汀
以4mL固定化細(xì)胞/IOmL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的接種量接入pH 7. 5的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床llOr/min，30°C培養(yǎng)4 后，按1. Og/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C發(fā)酵4 生成產(chǎn)物I，發(fā)酵PH為7. 5;發(fā)酵第二階段，將第一階段發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞洗凈，加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，按照0. lg/L的的濃度加入產(chǎn)物I溶液，30°C發(fā)酵IOh生成無錫他汀，發(fā)酵pH為 5 · 5 ο
轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為(g/L)可溶性淀粉15，Hycase SF 2，玉米漿5。
產(chǎn)物I含量檢測方法將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液離心，微膜過濾后利用HPLC檢測樣品， 將產(chǎn)物I峰的峰面積代入已有公式(利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得)
計(jì)算公式
產(chǎn)物I含量=峰面積*樣品稀釋倍數(shù)*10_6/30. 234 (g/L)
無錫他汀含量檢測方法將發(fā)酵結(jié)束的發(fā)酵液離心，微膜過濾后利用HPLC檢測樣品，將無錫他汀峰的峰面積代入已有公式(利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算而得)
計(jì)算公式
無錫他汀含量=峰面積*樣品稀釋倍數(shù)*10_734606 (g/L)
發(fā)酵結(jié)束后，測定產(chǎn)物I含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 76%。
發(fā)酵結(jié)束后，測定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 9%。
實(shí)施例2
細(xì)胞固定化同實(shí)施例1。[0031]發(fā)酵生產(chǎn)無錫他汀的方法
將4mL固定化細(xì)胞接入IOmL的pH7. 5的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床llOr/min， 30°C培養(yǎng)48h，按2. Og/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C發(fā)酵48h，生成產(chǎn)物I ；按0. 2g/L的濃度加入產(chǎn)物I溶液，30°C發(fā)酵10h。
發(fā)酵結(jié)束后，測定產(chǎn)物I含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 210%。
發(fā)酵結(jié)束后，測定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 25%。
實(shí)施例3
細(xì)胞固定化同實(shí)施例1。
發(fā)酵生產(chǎn)無錫他汀的方法
將4mL固定化細(xì)胞接入IOmL的pH 7. 5的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，回轉(zhuǎn)式搖床llOr/min， 30°C培養(yǎng)48h，按3. Og/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C發(fā)酵48h，生成產(chǎn)物I ；按0. 3g/L的濃度加入產(chǎn)物I溶液，30°C發(fā)酵10h。
發(fā)酵結(jié)束后，測定產(chǎn)物I含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 250%。
發(fā)酵結(jié)束后，測定無錫他汀含量，其產(chǎn)量比對比技術(shù)方法提高了 36%。
實(shí)施例4
用無菌去離子水將上一批次發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞沖洗三次，加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，進(jìn)行下一批次發(fā)酵。每批次發(fā)酵結(jié)束后，測定產(chǎn)物I和無錫他汀含量。經(jīng)過固定化處理的擬無枝酸菌，連續(xù)發(fā)酵5批后，分段發(fā)酵的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率仍然能維持較高的水平，固定化小珠伴有少量的破碎，至第6批發(fā)酵結(jié)束后，固定化細(xì)胞基本上潰散，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率急劇下降， 具體數(shù)據(jù)見表1。
表1不同發(fā)酵批次產(chǎn)物I和無錫他汀含量以及固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度變化
權(quán)利要求
1.一種利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法，其特征在于將擬無枝酸菌細(xì)胞進(jìn)行固定化處理后，采用PH以及發(fā)酵時(shí)間兩階段發(fā)酵控制生產(chǎn)無錫他汀。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所述擬無枝酸菌固定化方法為將培養(yǎng)好的種子菌懸液與海藻酸鈉溶液按照1 5的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入CaCl2溶液中，固定lh，濾出小珠，用蒸餾水洗凈，得到固定化細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所述擬無枝酸菌固定化方法為將培養(yǎng)好的種子菌懸液與20g/L海藻酸鈉溶液按照ImL菌懸液/5mL凝膠的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入10g/L的CaCl2溶液中，注射高度為10cm，固定lh，濾出小珠，用蒸餾水洗凈， 得到粒徑為3mm左右的固定化細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述兩階段發(fā)酵控制條件為發(fā)酵第一階段，固定化細(xì)胞經(jīng)過增殖培養(yǎng)后，按1. 0-3. Og/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30°C發(fā)酵4 生成產(chǎn)物I，發(fā)酵pH為7. 5 ；發(fā)酵第二階段，將第一階段發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞洗凈， 加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，按照0. 1-0. 3g/L的的濃度加入產(chǎn)物I溶液，30°C發(fā)酵IOh生成無錫他汀，發(fā)酵pH*5.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1-3任一所述的方法，其特征在于所述擬無枝酸菌可用于多次發(fā)酵， 用無菌去離子水將上一批發(fā)酵結(jié)束的固定化細(xì)胞沖洗三次，加入新鮮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，進(jìn)行下一批發(fā)酵。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于所述擬無枝酸菌最適發(fā)酵批次為5批。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1-3所述的方法，其特征在于所述擬無枝酸菌為孢子種子液。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種利用固定化擬無枝酸菌分段發(fā)酵無錫他汀的方法，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及擬無枝酸菌細(xì)胞的固定化處理以及固定化細(xì)胞多批次分段發(fā)酵，結(jié)果表明擬無枝酸菌經(jīng)過固定化處理后，大幅度提高了對底物洛伐他汀的耐受性，提高了無錫他汀的產(chǎn)量，具有較好的操作穩(wěn)定性，可重復(fù)利用。
文檔編號C12P17/06GKCN102373249SQ201110316323
公開日2012年3月14日 申請日期2011年10月18日
發(fā)明者方慧英, 曹艷輝, 諸葛健, 諸葛斌 申請人:無錫天沁生物技術(shù)有限公司, 江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan