專利名稱：一種新的化合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的化合物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
萬古霉素是由1956年印度尼西亞土壤中分離的東方擬無枝酸菌 (Amycolatopsis orientalis)發(fā)酵得到的，是臨床治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)感染的首選藥物。但隨著萬古霉 素的不斷使用，金黃色葡萄球菌對萬古霉素的敏感性有所下降，這將對臨床抗感染治療產(chǎn) 生嚴(yán)重威脅，因此，尋找能夠?qū)δ退幘旮纳苹盍Φ牡诙请念惪股仄仍诿冀?，同時， 制備可發(fā)酵生產(chǎn)對耐藥菌株改善活力的第二代糖肽類抗生素的重組菌株也成為一個重要 的研究課題，也具有同樣的緊迫性。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人通過對萬古霉素產(chǎn)生菌A. orientalis HCCB10007中糖基轉(zhuǎn)移酶 基因進(jìn)行的異源置換操作，獲得了一株新的東方擬無枝酸菌菌株，并在該株東方擬無枝酸 菌的發(fā)酵液中，提取到了一種新的化合物。因此，本發(fā)明的第一個目的，提供一種新的化合物。本發(fā)明的第二個目的，提供所述化合物的制備方法。本發(fā)明的第三個目的，提供所述化合物的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的，提供一種所述化合物的產(chǎn)生菌。本發(fā)明的提供的化合物，具有以下式⑴所示的結(jié)構(gòu)
其中肽骨架六位氨基酸的芐羥基上糖基的四位羥基(-0H，如結(jié)構(gòu)式中1所示)
為直立鍵。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，所述式(I)所示的化合物通過發(fā)酵菌株CGMCCNo. 3053獲得。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施例，所述式(I)所示的化合物的制備方法還包括對發(fā) 酵液進(jìn)行分離純化的步驟，具體地，所述分離純化步驟如下以大孔弱極性樹脂對濾液進(jìn)行動態(tài)吸附，以含0. 01%鹽酸的乙醇_水溶液進(jìn)行梯 度洗脫，并收集乙醇水為8 2的洗脫液，然后以活性炭脫色、濃縮后進(jìn)行中壓液相色譜 層析，再以含有0. 2 % NH4H2P04緩沖鹽的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集主要洗脫液濃縮，最 后將中壓液相色譜制備得到的洗脫濃縮液用大孔弱極性樹脂吸附，用含0. 001%鹽酸的甲 醇-水溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽。根據(jù)本發(fā)明，對發(fā)酵液進(jìn)行分離純化前還包括對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理的步驟，具體 地，所述預(yù)處理步驟如下發(fā)酵液用HC1調(diào)pH3 4，過濾除去菌絲體。本發(fā)明提供的式(I)所示的化合物具有良好的抗菌活性，因而可用于制備抗菌藥 物。本發(fā)明提供的式(I)所示的化合物的產(chǎn)生菌，其保藏號為CGMCC No. 3053。本發(fā)明提供了一種新的化合物及其產(chǎn)生菌，鑒于該化合物具有良好的抗菌活性， 因此對于新的抗菌藥物的開發(fā)具有非常重要的意義。


圖 1 是 LYV07ww01 的 MS 圖譜。圖2是LYV07ww01的屮核磁共振波譜圖。圖3是LYV07ww01的13C核磁共振波譜圖。
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圖4是LYV07ww01的Cosy核磁共振波譜圖。圖5是LYV07ww01的Noesy核磁共振波譜圖。圖6是LYV07ww01的Tocsy核磁共振波譜圖。圖7是LYV07ww01的Hsqc核磁共振波譜圖。圖8是LYV07ww01的Hmbc核磁共振波譜圖。圖9是LYV07ww01的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。本發(fā)明所獲得的工程菌已于2009年5月6日提交位于北京的中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3053。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、菌株制備發(fā)明人通過對萬古霉素產(chǎn)生菌A.orientalis HCCB10007中糖基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行 的異源置換操作，即從Amycolatopsis balhimyceticus NRRL B-24207中釣取其糖基轉(zhuǎn)移 酶基因并通過接合轉(zhuǎn)移的方法置換了萬古霉素的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，從而獲得了一株新菌 株。該菌株已于2009年5月6日提交位于北京的中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC No. 3053。實(shí)施例2、發(fā)酵培養(yǎng)將CGMCC NO. 3053接入種子培養(yǎng)基中，于28°C，220rpm培養(yǎng)40-48h。然后，在 無菌條件下，將培養(yǎng)好的種子液以8%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵搖瓶中，于28°C，220rpm培養(yǎng) 115-120h，收獲發(fā)酵液。實(shí)施例3、發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化3. 1、發(fā)酵液預(yù)處理將實(shí)施例2中獲得的發(fā)酵液用HC1調(diào)pH至3 4，過濾除去菌絲體，收集濾液。3. 2、分離純化參考專利US5843437中提供的分離純化方法，分離純化發(fā)酵液，具體分離純化過 程如下以大孔弱極性樹脂HP-20對步驟3. 1中獲得的濾液進(jìn)行動態(tài)吸附，以含0.01% 鹽酸的乙醇-水溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集乙醇-水溶液(8 2)洗脫液，然后以活性炭脫 色、濃縮后進(jìn)行中壓液相色譜層析，再以含有0. 2% NH4H2P04緩沖鹽的甲醇-水溶液梯度洗 脫，收集主要洗脫液濃縮，最后將中壓液相色譜制備得到的洗脫濃縮液用HP-20吸附，用含 0.001%鹽酸的的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽，干燥。將獲得的產(chǎn)物命名為LYV07ww01。實(shí)施例4、LYV07ww01結(jié)構(gòu)確定將LYV07ww01進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果如圖1所示，根據(jù)圖1所示的MS圖譜，LYV07ww01 的分子量為1590。通過對LYV07ww01 —維核磁共振波譜(圖2 3)和二維核磁共振波譜(圖4 8)進(jìn)行解析，確定各碳原子和氫原子信號的化學(xué)歸屬，證實(shí)其結(jié)構(gòu)與Chloroeremomycin相 似，僅在四位外側(cè)糖基及六位糖基構(gòu)型上略有差異。上述兩個糖殘基上四位氫原子的化學(xué) 位移分別為3. 29,3. 30ppm,皆表現(xiàn)為單峰，偶合常數(shù)小于4Hz，因相鄰五位氫原子為直立 鍵，則四位氫原子只能是平伏鍵，四位羥基是直立鍵。亦即LYV07w01的四位外側(cè)糖基及六 位糖基皆為萬古糖胺基，而Chloroeremomycin的兩個糖基皆為表萬古糖胺基。根據(jù)解析結(jié)果，獲得LYV07ww01的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，具體如圖9所示，其中，LYV07ww01 的肽骨架六位氨基酸的芐羥基上糖基的四位羥基(-0H，如結(jié)構(gòu)式中1所示)為直立鍵。經(jīng)檢索，在現(xiàn)有技術(shù)中未見有該化合物的報道，即LYV07ww01為一種新的化合物。實(shí)施例5、LYV07ww01抗菌活性測定參考《中華人民共和國藥典》(2005年版)中提供的方法，檢測LYV07ww01的抗菌 活性，其中，使用的菌株及LYV07w01對所述菌株的抗菌劑量如表1所示。表1、檢測用菌株及LYV07ww01的抗菌活性
#測試用菌株性質(zhì)LYV07ww01 (MIC 值)1耐萬古霉素腸球菌128μ g/ml2耐萬古霉素腸球菌32 μ g/ml3腸球菌0. 5 μ g/ml4MRSA0. 5 μ g/ml5MRSA0.5 μ g/ml6MRSA0. 5 μ g/ml7MRSA1 μ g/ml8MRSA0. 5 μ g/ml9MRSA0.5 μ g/ml10MRSA0. 5 μ g/ml11MRSA0.5 μ g/ml12MRSA0. 5 μ g/ml13MRSA0.5 μ g/ml
6 根據(jù)表1的結(jié)果，本發(fā)明的提供的化合物L(fēng)YV07w01對于多種臨床致病菌都具有 良好的抗菌活性。綜上所述，本發(fā)明提供的新的化合物L(fēng)YV07w01對于多種臨床致病菌都具有良好 的抗菌活性，因此可用于制備抗菌藥物，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
一種化合物，其特征在于，所述化合物的結(jié)構(gòu)如式(I)所示其中所述化合物的肽骨架六位氨基酸的芐羥基上糖基的四位羥基為直立鍵。F2009100539069C0000011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，其特征在于，所述化合物通過CGMCC No. 3053發(fā)酵獲得。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述方法還包括對發(fā)酵液進(jìn)行分離純 化的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述分離純化步驟如下以大孔弱極性樹脂對濾液進(jìn)行動態(tài)吸附，以含0. 01%鹽酸的乙醇-水溶液進(jìn)行梯度洗 脫，并收集乙醇水為8 2的洗脫液，然后以活性炭脫色、濃縮后進(jìn)行中壓液相色譜層析， 再以含有0. 2 % NH4H2PO4緩沖鹽的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集主要洗脫液濃縮，最后將中 壓液相色譜制備得到的洗脫濃縮液用大孔弱極性樹脂吸附，用含0. 001%鹽酸的甲醇-7K 溶液梯度洗脫，收集甲醇水為8 2的洗脫液，脫鹽。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述大孔弱極性樹脂為HP-20。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述脫鹽步驟后還包括干燥步驟。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在對發(fā)酵液進(jìn)行分離純化前還包括對 發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述預(yù)處理步驟如下發(fā)酵液用HCl調(diào)pH3 4，過濾除去菌絲體。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物用于制備抗菌藥物的應(yīng)用。
10.一種權(quán)利要求1所述的結(jié)構(gòu)式(I)的化合物的產(chǎn)生菌，其特征在于所述菌株的保 藏號為 CGMCC No. 3053。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的化合物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的化合物，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示。該化合物的肽骨架六位氨基酸的芐羥基上糖基的四位羥基為直立鍵，該化合物通過CGMCC No.3053發(fā)酵獲得。本發(fā)明提供的化合物具有良好的抗菌活性，因此對于新的抗菌藥物的開發(fā)具有非常重要的意義。
文檔編號C07K7/06GK101928331SQ20091005390
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者夏興, 姜衛(wèi)紅, 戈梅, 朱麗, 李秋爽, 楊天, 楊志鈞, 楊晟, 殷瑜, 王天嬌, 羅敏玉, 金文翔, 阮林高, 陳代杰, 魏維, 黃鶴 申請人:上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司;浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠;中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院