專(zhuān)利名稱(chēng):一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重pcr快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)品中致病菌的檢測(cè)，尤其涉及一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
隨著經(jīng)濟(jì)全球化進(jìn)程的加快，食品安全也成為當(dāng)今世界性公共衛(wèi)生熱點(diǎn)，而食源性致病菌是引起食源性疾病的首要因素，對(duì)人類(lèi)健康造成極大危害，是食品安全的重大隱患。食源性致病菌是指以食物為載體，導(dǎo)致人類(lèi)發(fā)生疾病的一大類(lèi)細(xì)菌，如沙門(mén)氏菌是一種引起食物中毒的重要病原菌之一，在世界上每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)上億美元；如近年來(lái)受到社會(huì)廣泛重視和關(guān)注的副溶血性弧菌也是引起食物中毒的食源性致病菌之一，尤其在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常由于食用含食源性致病菌的食品而引起暴發(fā)性食物中毒。而我國(guó)是一個(gè)水產(chǎn)品大國(guó)，水產(chǎn)品中含有大量的食源性致病菌，是引起食源性疾病的食品之一。由于海產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)豐富、極易受到各種微生物的污染，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，水產(chǎn)品中含有的食源性致病菌種類(lèi)比較多，常見(jiàn)的致病微生物菌有副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌屬、志賀氏菌屬、埃希氏菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等。這些食源性致病菌都能引起食源性疾病，其中沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌這三種食源性致病菌所引起食源性疾病占很大的比例，因此，這三種食源性致病菌是世界上許多國(guó)家水產(chǎn)品進(jìn)出口中必檢的致病菌指標(biāo)，同樣也是我國(guó)對(duì)水產(chǎn)品的檢測(cè)中必檢的致病菌指標(biāo)。
現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于對(duì)食源致病菌的檢驗(yàn)大多沿用傳統(tǒng)的對(duì)殘余食物的細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定方法，檢驗(yàn)步驟繁瑣，檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)，較易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，而且檢測(cè)的靈敏度也較低。尤其是在應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，不能夠滿(mǎn)足診斷及時(shí)、結(jié)果準(zhǔn)確、敏感性和特異性高的要求。鑒于此，為了能夠更快速地實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中的多種致病菌的診斷和監(jiān)控，各國(guó)學(xué)者研究出了一些新的觀點(diǎn)和方法，如酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、熒光免疫分析法(FIA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等。在上述的檢測(cè)方法中，PCR技術(shù)可以說(shuō)是20世紀(jì)核酸分子生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑，該方法改變了傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)的模式，不通過(guò)活細(xì)胞，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到IO7 IO9倍，大大提高了 DNA的得率；同時(shí)，隨著熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶的應(yīng)用和自動(dòng)化熱循環(huán)儀的成功設(shè)計(jì)，PCR技術(shù)的操作程序大大簡(jiǎn)化，并很快成為分子生物學(xué)和基因工程中的一個(gè)強(qiáng)有利的工具。在國(guó)外，該技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、食品衛(wèi)生學(xué)等領(lǐng)域。另外，從理論上講，只要有限的核酸序列是清楚的，PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用也必將成為今后我國(guó)食品中各種病原菌檢測(cè)的一個(gè)重要方向。
近年來(lái)，針對(duì)單一致病菌的PCR快速檢驗(yàn)方法已經(jīng)建立起來(lái)，如沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等食源性致病菌的單一PCR快速檢測(cè)方法。然而在食品生產(chǎn)和流通中， 企業(yè)和政府監(jiān)管部門(mén)均需對(duì)大批食品進(jìn)行食品中食源性的致病菌的檢測(cè)，樣本量大、時(shí)間急，采用單一致病菌的PCR檢測(cè)技術(shù)和一般方法仍然不能滿(mǎn)足這些部門(mén)不斷發(fā)展的需要。 針對(duì)上述的問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)出了一種多種致病菌同時(shí)檢測(cè)的多重PCR檢測(cè)技術(shù)。在該項(xiàng)技術(shù)中，靶基因的選擇和設(shè)計(jì)合理的引物以及在PCR擴(kuò)增過(guò)程中反應(yīng)體系中各物質(zhì)的用量和條件的選擇都是至關(guān)重要的。
如中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(公開(kāi)號(hào)CN1603422A)公開(kāi)了一種沙門(mén)氏菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌多重PCR快速檢測(cè)方法，具體方法是將沙門(mén)氏菌和大腸桿菌(YZU_DSL1)分別采用熱裂法提取各自DNA模板、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌采用酶解法DNA模板，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后經(jīng)電泳鑒定。該方法采用了多重PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，提高了工作效率，所采用的引物的特異性也較高，但是該方法只能同時(shí)檢測(cè)出沙門(mén)氏菌和單核細(xì)胞李斯特菌，且在DNA模板的提取過(guò)程中不容易確保所提取的DNA模板的純度等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種能夠同時(shí)檢測(cè)出水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三種致病菌的檢測(cè)速度快、特異性高的多重PCR快速檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的，一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重 PCR快速檢測(cè)方法，該方法包括對(duì)沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的活化、培養(yǎng)；DNA模板的提取；多重PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；所述的多重 PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括
DNA 模板0.02 0. 5 μ 1/μ 1 ;10XPCR buffer :0. 1 1·0μ 1/μ 1 ；dNTPs 180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4· Ommol/μ 1 ； Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙門(mén)氏菌引物 100 200ymol/L ；副溶血性菌引物:100 200ymol/L ；單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌引物200 400 μ mol/L ；所述的沙門(mén)氏菌引物上游為5，-TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，，下游為:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游為:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游為:5，-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，；所述的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌引物的上游為5'-TAA TTT AATTTT CCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游為5’ -CTT TCG TTA TAA TGTCTG GCT TTA TCG A-3，。
本發(fā)明的上述一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，所述的多重 PCR擴(kuò)增還包括擴(kuò)增反應(yīng)條件，所述的擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C變性15min后進(jìn)行循環(huán)程序， 所述的循環(huán)程序?yàn)?4°C變性30秒，46°C 50°C退火1分鐘，72°C延伸1分鐘，循環(huán)35次， 再在72°C下延伸補(bǔ)足10分鐘。
本發(fā)明的上述一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法中多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中所述的dNIPs是用于DNA半保留復(fù)制的主要原料，所述的dNIPs表示為dATP、 dTTP、dCTP、dGTP四種脫氧核苷酸的混合物，表示四種脫氧核苷酸的用量相同，均為180 220 μ mol/L，使用時(shí)四種脫氧核苷酸的濃度要相等，即等摩爾配制成dNIPs混合物，當(dāng)任何一種脫氧核苷酸的濃度不同于其它幾種時(shí)，不管是偏高或偏低，都會(huì)引起錯(cuò)酸，影響PCR擴(kuò)增的質(zhì)量。所述的Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有很大的影響，如果Mg2+的濃度過(guò)低， 則會(huì)使PCR擴(kuò)增的特異性降低，而且還會(huì)影響Taq酶的活性，影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，而在本發(fā)明的范圍內(nèi)能夠保證PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量，能夠保證最終的電泳檢測(cè)的穩(wěn)定性，使條帶清晰。本發(fā)明的上述三對(duì)引物是針對(duì)沙門(mén)氏菌、副溶血性菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌三種菌中各自的毒力因子所設(shè)計(jì)的引物，沙門(mén)氏菌、副溶血性菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌三種菌的基因序列是本領(lǐng)域的公知常識(shí)，可以在基因庫(kù)里得到這三種菌的基因序列。其中沙門(mén)氏菌的主要毒力因子是invA，是沙門(mén)氏菌的致病基因片段之一，invA 基因比較保守，能夠作為靶基因，具有針對(duì)性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，最終得到的擴(kuò)增產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度為 213bPo但是對(duì)于以毒力因子invA為靶基因，本領(lǐng)域普通的PCR擴(kuò)增中所用的引物是上游為5，-ATC GGC GTT ATC CCTTTC TCT GGT G-3，，下游為5，-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAAGAG A-3’，且擴(kuò)增產(chǎn)物的片段的長(zhǎng)度為4%bp，采用該引物對(duì)應(yīng)用到本發(fā)明的多重PCR 擴(kuò)增中效果不佳，不利于本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明針對(duì)副溶血性弧菌選用的目的基因irgB是副溶血性弧菌致病的主要毒力因子，也具有較好的保守性，對(duì)于副溶血性弧菌的PCR擴(kuò)增， 常規(guī)的方法是采用toxR為靶基因，且所用的引物的上游為5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3，，下游為5'-ATACGA CTG CTT CGT CTC ATG-3，，擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度為368bp。針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌選用PrfA為目的基因，具有較好的標(biāo)記性，有利于本發(fā)明的電泳檢測(cè)分析。本發(fā)明所用的沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌三種菌的引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物及所用的目的基因可以通過(guò)表1看出
表1:
權(quán)利要求
1.一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，該方法包括對(duì)沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的活化、培養(yǎng)；DNA模板的提取；多重PCR擴(kuò)增；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；所述的多重PCR擴(kuò)增包括多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述的多重PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括DNA 模板0. 02 0. 5 μ 1/μ 1 ； 10 X PCR buffer :0. 1 1. 0 μ 1/μ 1 ；dNTPs :180 220ymol/L ；Mg2+ :0. 6 4. Ommol/μ 1 ；Taq 酶0. 05 0. 3U/μ 1 ；沙門(mén)氏菌引物:100 200μπιΟ1/1;副溶血性菌引物100 200μπιΟ1/1;單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌引物 200 400 μ mol/L ；所述的沙門(mén)氏菌引物上游為5，_TTA CAACGC TCT TTC GTC TGG C-3，， 下游為:5，-AAA ATC GGG CCG CGACTT-3，；所述的副溶血性菌引物的上游為:5，-CGA TAC ACA CCACGA TCC AG-3，，下游為5'-ATA CGG CCG GGG TGA TGT TTC T-3，;所述的單核增生李斯特氏菌引物的上游為5，-TAA TTT MT TTTCCC CAA GTA GCA GGAC-3，，下游為5，_CTT TCG TTA TAA TGT CTGGCT TTA TCG A-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的多重PCR擴(kuò)增還包括擴(kuò)增反應(yīng)條件，所述的擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C變性15min 后進(jìn)行循環(huán)程序，所述的循環(huán)程序?yàn)?4°C變性30秒，46°C 50°C退火lmin，72 V延伸 lmin，循環(huán)35次，再在72°C下延伸補(bǔ)足IOmin0
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法， 其特征在于所述的沙門(mén)氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的活化、培養(yǎng)，通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的i、在無(wú)菌條件下，將腦心浸液培養(yǎng)基加入裝有菌粉的西林瓶中，使充分懸浮后，得菌懸液，然后取菌懸液接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，在35°C 40°C的條件下，活化培養(yǎng)20 26小時(shí)，得到一級(jí)菌種；ii、用接種針挑取一環(huán)上述活化后的單菌落的一級(jí)菌種至營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，放入搖床，控制溫度在35°C 40°C的條件下，培養(yǎng)20 沈小時(shí)，得到相應(yīng)細(xì)菌的菌液。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的副溶血性弧菌的活化、培養(yǎng)，通過(guò)以下方法實(shí)現(xiàn)的a、在無(wú)菌條件下，將3%NaCl堿性蛋白水加入裝有菌粉的西林瓶中，使充分懸浮后，得菌懸液，然后取菌懸液接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，在35°C 40°C的條件下，活化培養(yǎng) 20 沈小時(shí)，得到一級(jí)菌種；b、用接種針挑取一環(huán)上述活化后的單菌落的一級(jí)菌種至營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，放入搖床，控制溫度在35°C 40°C的條件下，培養(yǎng)20 沈小時(shí)，得相應(yīng)細(xì)菌的菌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括提取試劑盒，所述的提取試劑盒包括緩沖液GA ；緩沖液GB ；緩沖液GD ；漂洗液PW ；洗脫緩沖液TE ；蛋白酶K ；吸附柱CB3。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的DNA模板的提取包括以下步驟A、取細(xì)菌培養(yǎng)液樣品1.0 5. OmL，控制轉(zhuǎn)速為IOOOOrpm的條件下，離心1 lOmin， 去上清液，得菌體沉淀物；B、向菌體沉淀物中加入緩沖液GA懸浮菌體沉淀物；C、再加入蛋白酶K溶液，使混合均勻，加入緩沖液GB，在70°C條件下保溫5 15min，再加入無(wú)水乙醇，使混合均勻；D、再將步驟C所得的混合液加入到收集管中，加入吸附柱CB3,離心，去除廢液，再加入緩沖液⑶，控制轉(zhuǎn)速為12000rpm的條件下，離心15 30秒，去除廢液，得到的吸附柱CB3 ；E、將步驟D中得到的吸附柱CB3放入到收集管中，再加入漂洗液PW，控制轉(zhuǎn)速為 12000rpm的條件下，離心15 30秒，去除廢液，得到的吸附柱CB3 ；F、將上述的吸附柱( 放入另一離心管中，再加入洗脫緩沖液TE，室溫下放置1 IOmin,離心，得到DNA模板提取物。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于在提取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌DNA模板時(shí)，步驟A之后首先將溶菌酶加入菌體沉淀物中進(jìn)行破壁處理，再省略過(guò)步驟B的操作，直接依次進(jìn)行步驟C及之后的操作過(guò)程最終得到單核增生李斯特氏菌DNA模板提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于步驟C中所述的蛋白酶K溶液的加入量為18 22 μ 1 ；所述的緩沖液GB的加入量為 200 ~ 250 μ I0
9.根據(jù)權(quán)利要求
6或7或8所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的DNA模板提取物的DNA純度0擬60/0D280值為1. 6 1. 9。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，其特征在于所述的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)包括用0. 5XTBE緩沖液配制成2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，用紫外透射檢測(cè)儀檢測(cè)電泳結(jié)果。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及一種用于水產(chǎn)品中致病菌的多重PCR快速檢測(cè)方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明的方法包括對(duì)沙門(mén)氏菌、副溶血性弧菌和單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的活化、培養(yǎng)；DNA模板的提?。欢嘀豍CR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；所述的多重PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中包括DNA模板、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2+、Taq酶、沙門(mén)氏菌引物、副溶血性菌引物、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌引物。該方法具有能夠同時(shí)檢測(cè)出水產(chǎn)品中沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌三種致病菌，且所需檢測(cè)時(shí)間短，電流檢測(cè)拖帶少，特異性條帶清晰及靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GKCN102329877SQ201110311334
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月14日
發(fā)明者夏慧麗 申請(qǐng)人:臺(tái)州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan