專利名稱:具有增加的Fc受體結(jié)合親和性和效應(yīng)子功能的CD20抗體的制作方法
具有增加的Fc受體結(jié)合親和性和效應(yīng)子功能的CD20抗體
本發(fā)明是國際申請?zhí)枮镻CT/IB2004/003896，國際申請日為2004年11月5日，進入中國國家階段日期為2006年7月5日，中國申請?zhí)枮?00480039946. 3，發(fā)明名稱為“具有增加的Fc受體結(jié)合親和性和效應(yīng)子功能的CD20抗體”的分案申請。
發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子(ABMs)。在特別的實施方案中，本發(fā)明涉及重組單克隆抗體，包括特異于人⑶20的嵌合的，primatized或人源化的抗體。此外，本發(fā)明涉及編碼這些ABMs的核酸分子，和包括這些核酸分子的載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的ABMs的方法，和將這些ABMs用在治療疾病中的方法。此外，本發(fā)明涉及具有修飾的糖基化作用和具有改善的治療特性的ABMs，包括具有增加的Fc受體結(jié)合和增加的效應(yīng)子功能的抗體。
背景領(lǐng)域
免疫系統(tǒng)和抗-⑶20抗體
包括人的脊椎動物的免疫系統(tǒng)，由許多器官和細胞類型組成，它們逐漸發(fā)展到準(zhǔn)確和特異性識別，結(jié)合和破壞入侵的異種微生物(“抗原”)。淋巴細胞對于免疫系統(tǒng)的正確功能是關(guān)鍵的。這些細胞在胸腺，脾和骨髓(成人)中產(chǎn)生并且代表了在成人循環(huán)系統(tǒng)中存在的全部白血細胞的約30%。存在淋巴細胞的兩個主要的亞群T細胞和B細胞。T細胞對細胞介導(dǎo)的免疫負責(zé)，而B細胞對抗體產(chǎn)生(體液免疫)負責(zé)。然而，在典型的免疫應(yīng)答中，T細胞和B細胞相互依賴地發(fā)揮作用當(dāng)T細胞受體與抗原片段結(jié)合時，T細胞被激活，所述抗原片段與在抗原呈遞細胞表面上的主要組織相容性復(fù)合物(“MHS”)糖蛋白結(jié)合；這種激活導(dǎo)致生物介質(zhì)(“白介素)的釋放，其刺激B細胞分化和產(chǎn)生針對抗原的抗體 (“免疫球蛋白”)。
在宿主中的每種B細胞表達一種特定類型和特異性的抗體，并且不同的B細胞表達特異于不同抗原的抗體。B細胞增殖和抗體產(chǎn)生作為對異源抗原的反應(yīng)而強化(spike)， 并且一旦異源抗原已經(jīng)被中和，兩者典型地停止(或相當(dāng)大地減少)。然而，有時候，特定B 細胞增殖將持續(xù)不減弱；這種增殖可以導(dǎo)致被稱為“B細胞淋巴瘤”的癌癥。
T細胞和B細胞都包括細胞表面蛋白，其可以被用作用于分化和鑒定的“標(biāo)志物”。 一種這樣的人B細胞標(biāo)志物是人B淋巴細胞-局限性分化抗原Bp35，其被稱為“⑶20”。⑶20 在早期前B細胞發(fā)展中表達并且保持到血漿細胞分化。特異性地，CD20分子可以調(diào)節(jié)在激活過程中的步驟，所述激活過程是細胞周期起始和分化所必需的，并且通常在腫瘤性轉(zhuǎn)化 (“腫瘤”)B細胞上以非常高的水平表達。因為⑶20在“惡性”B細胞，即那些未減弱的增殖會導(dǎo)致B細胞淋巴瘤的B細胞上以高水平存在，CD20表面抗原具有充當(dāng)“靶向”B細胞淋巴瘤的候選物的潛能。
本質(zhì)上，這些靶向可以如下進行概括例如，通過注射將特異于B細胞的⑶20表面抗原的抗體引入患者。這些抗-CD20抗體特異性地結(jié)合正常和惡性B細胞兩者(表面上)的CD20細胞表面抗原；與CD20表面抗原結(jié)合的抗-CD20抗體可以導(dǎo)致腫瘤性轉(zhuǎn)化B細胞的破壞和減少。此外，具有破壞腫瘤的潛能的化學(xué)試劑或放射性標(biāo)記可以與抗-CD20抗體綴合從而使該試劑特異性地“遞送”給，例如腫瘤性轉(zhuǎn)化B細胞。無論方法如何，主要的目的是破壞腫瘤具體的方法可以通過所用的具體的抗-CD20抗體來確定，并因此靶向CD20 抗原的可獲得的方法可以相當(dāng)大地改變。
未綴合的單克隆抗體(mAbs)可以是用于治療癌癥的藥，如由美國食品和藥物管理局(U. S. Food and Drug Administration)所批準(zhǔn)的下列藥物所證明用于治療⑶20陽性B細胞，低級或濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤的利妥昔單抗(RituXan ;IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA,禾口 Genentech Inc. , San Francisco, CA),用于治療晚期乳腺癌(GrilIo-Lopez，A. -J.，et al.，Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M.M·，Clin. Ther. 21 :309-18(1999))的曲妥單抗(Herceptin ；Genentech Inc,)，用于治療復(fù)發(fā)性急性骨髓白血病的吉姆單抗(Mylotarg ，Celltech/Wyeth-Ayerst)，和用于治療B細胞慢性淋巴細胞白血病的阿侖單抗(CAMPATH ，Millenium Pharmaceuticals/ Schering AG)。這些產(chǎn)品的成功不僅依賴于它們的功效，還依賴于它們突出的安全模式 (Grillo-Lopez, A. -J. , et al. , Semin. Oncol. 26 :66-73(1999) ；Goldenberg, M. M. , Clin. Ther. 21 :309-18 (1999))。盡管在這些藥物上所取得的成就，目前在獲得更高特異性抗體活性中存在巨大的目標(biāo)，所述特異性活性比典型地由未綴合的mAb療法所提供的要高。鼠單克隆抗體，B-Lyl，是另一種已知特異于人CD20的抗體(Poppema, S. ^P Visser, L.，Biotest Bulletin 3 131-139(1987))。
許多研究的結(jié)果顯示Fc-受體依賴性機制相當(dāng)大地有利于對針對腫瘤的細胞毒性抗體的作用，并且指示針對腫瘤的最佳抗體將優(yōu)先結(jié)合激活Fc受體，并且與抑制性配偶體 FcyRIIB 結(jié)合程度最小(Clynes, R. A.，et al.，Nature Medicine 6(4) 443-446 (2000) ；Kalergis, A.M.，和 Ravetch，J. V.，J. Exp. Med. 195(12) :1653-1659 (June 2002)。例如，至少一項研究的結(jié)果顯示Fc γ RIIIa受體特別地與抗體療法的功效緊密相關(guān) (Cartron,G. , et al.，Blood99 (3) :754-757 (February 2002))。該研究顯示對于Fc γ RIIIa 是純合的患者，與對于Fc y RIIIa是雜合的患者相比，具有更好的針對利妥昔單抗的應(yīng)答。作者得出結(jié)論為更優(yōu)的應(yīng)答是由于抗體與Fc γ RIIIa的更好的體內(nèi)結(jié)合，其導(dǎo)致了針對淋巴瘤細胞的更好的 ADCC 活性(Cartron，G.，et al.，Blood99(3) :754-757 (February 200 )。
已經(jīng)報道了對靶向⑶20表面抗原的各種嘗試。據(jù)報道，鼠(小鼠)單克隆抗體1F5(抗-⑶20抗體)通過持續(xù)的靜脈內(nèi)輸注被施用給B細胞淋巴瘤患者。據(jù)報道，需要極高水平(> 2克)的1F5來減少循環(huán)的腫瘤細胞，并且該結(jié)果被描述為“瞬時的”。 Press et al. , “ Monoclonal Antibody 1F5(Anti_CD20)Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas. " Blood 69/2:584-591(1987)。關(guān)于該方法的潛在問題是非人單克隆抗體 (即，鼠單克隆抗體)典型地缺乏人效應(yīng)子功能度，即它們不能，特別是通過抗體依賴性細胞毒性或Fc-受體介導(dǎo)的吞噬作用來介導(dǎo)補體依賴性的裂解或溶解人靶標(biāo)細胞。此外，非人單克隆抗體可以被人宿主識別為異源蛋白質(zhì)；因此重復(fù)注射這些異源抗體可以導(dǎo)致免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，其導(dǎo)致有害的過敏性反應(yīng)。對于基于鼠的單克隆抗體，這經(jīng)常被稱為人抗小鼠抗體應(yīng)答，或"HAMA"應(yīng)答。此外，這些“異源”抗體可以被宿主的免疫系統(tǒng)所攻擊從而使它們，在達到它們的靶位點前被有效地中和。
報道的提高鼠單克隆抗體有效治療B細胞疾病的能力的另一種方法是將放射性標(biāo)記或毒素與抗體結(jié)合從而使標(biāo)記或毒素位于腫瘤位點。例如，上述1F5抗體已經(jīng)用碘-131(" 131I")進行標(biāo)記，并且據(jù)報道進行了在兩個患者中關(guān)于生物分布的評價° 見 Eary, J. F. et al. , “ Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8 :1257-1268(1990)；還見，Press，0. W. et al. , “ Treatment of Refractory Non-Hodgkin ' s Lymphoma with Radiolabeled MB-I(Anti-CD37)Antibody " J. Clin. One. 7/8 :1027-1038(1989)(指示用131I-標(biāo)記的IF_5處理的一個患者獲得了“部分應(yīng)答，，)；Goldenberg, D. M. et al. , “ Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-I3I-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J.Clin. One. 9/4 :548-564(1991)(據(jù)報道接受多次注射的8個患者中有3個已經(jīng)發(fā)展了 HAMA應(yīng)答)；Appelbaum, F. R. “ Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin' s Lymphoma" Hem. /One. Clinics of N. A. 5/5 :1013-1025 (1991)(綜述文章)；Press, 0. W. et al" Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. “ New England J. Med. 329/17 :1219-12223(1993) (碘-131 標(biāo)記的抗-CD20 抗體 IF5 和 Bi)；和 Kaminski，M. G. et al “ Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131IAnti-Bl (Anti-CD20) Antibody “ . New England J. Med. 329/7(1993)(碘-131 標(biāo)記的抗-CD20 抗體 Bl ；下文“Kaminski ”)。毒素(即，化療試劑諸如多柔比星或絲裂霉素C)也與抗體綴合。見，例如，PCT公布的申請W092/07466(公布于1992年5月14日)。
已經(jīng)將包括來自兩種或更多種不同物種(例如，小鼠和人)的抗體的部分的嵌合抗體發(fā)展為“綴合”抗體的備選。例如，Liu，A. Y. et al, “ Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10 :3521-3526 (1987)，描述了定向針對 CD20 抗原的小鼠 / 人嵌合抗體。還見，PCT出版號WO 88/04936。例如，已經(jīng)批準(zhǔn)將利妥昔單抗(RITUXAN )，一種嵌合的抗-CD20抗體用于治療非霍奇金氏淋巴瘤。
假定⑶20由B細胞淋巴瘤表達，這種抗原可以充當(dāng)“靶向”這些淋巴瘤的候選物。 本質(zhì)上，這種靶向可以如下進行歸納將特異于B細胞上CD20表面抗原的抗體施用于患者。 這些抗-⑶20抗體特異性地結(jié)合于正常和惡性B細胞兩者(表面上)的⑶20抗原，并且結(jié)合在細胞表面上的CD20的抗體導(dǎo)致了腫瘤發(fā)生B細胞的破壞和減少。此外，化學(xué)試劑，細胞毒素或放射性試劑可以直接或間接連接于抗-⑶20抗體從而使該試劑選擇性地“遞送” 給CD20抗原表達B細胞。關(guān)于這兩種方法，主要的目標(biāo)都是破壞腫瘤。該特異性的方法將取決于所用的特定抗-CD20抗體。因此，顯而易見的是靶向CD20抗原的各種方法可以相當(dāng)大地變化。
該利妥昔單抗(RITUXAN )抗體是遺傳改造的嵌合人Υ ι鼠恒定結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含定向針對人CD20抗原的單克隆抗體。該嵌合抗體包含人Yl不變結(jié)構(gòu)域并在美國專利號5，736，137 (Andersen et. al.)中以名稱“C2B8”進行鑒別，所述專利在1998 年 4 月 17 日被授權(quán)，并被轉(zhuǎn)讓給 IDEC Pharmaceuticals Corporation。RITUXAN 被批準(zhǔn)用于治療具有復(fù)發(fā)性或折射性低級或濾泡性，CD20陽性，B細胞非霍奇金氏淋巴瘤的患者。體外的作用機制研究已經(jīng)顯示RITUXAN 展示了人補體依賴性細胞毒性(⑶C) (Reff et. al, Blood 83(2) :435-445 (1994))。此外，其顯示了測量抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)的測定中的明顯活性。RITUXAN 已經(jīng)顯示具有在胸苷結(jié)合測定中的抗增生活性和直接誘導(dǎo)程序性細胞死亡的有限能力，而⑶20抗體則沒有顯示(Maloney et. al, Blood 88(10) :637a(1996))ο
抗體糖基化
寡糖成分可以顯著地影響與治療性糖蛋白的功效有關(guān)的特性，包括物理穩(wěn)定性， 對蛋白酶攻擊的抗性，與免疫系統(tǒng)的相互作用，藥物代謝動力學(xué)，和特異性生物活性。這些特性可以不僅依賴于寡糖的存在或缺乏，還依賴于寡糖的特異性結(jié)構(gòu)?？梢栽诠烟墙Y(jié)構(gòu)和糖蛋白功能之間進行一些總結(jié)。例如，某些寡糖結(jié)構(gòu)通過與特異性糖結(jié)合蛋白相互作用介導(dǎo)糖蛋白從血流中快速清除，而其它的可以被抗體結(jié)合并且觸發(fā)不需要的免疫反應(yīng)。 (Jenkins et al.，Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
哺乳動物細胞是用于產(chǎn)生治療性糖蛋白的優(yōu)選宿主，由于它們具有以對于人應(yīng)用的最相容的形式使蛋白質(zhì)糖基化的能力。(Cumming et al. , Glycobiology 1 115-30(1991) Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81 (1996))。細菌極少使蛋白質(zhì)糖基化，并且類似的其它類型的常見宿主，諸如酵母，絲狀真菌，昆蟲和植物細胞，產(chǎn)生糖基化模式，所述糖基化模式與從血流中快速清除，不理想的免疫相互作用有關(guān)，并且在一些特別的情形中，減少生物學(xué)活性。在哺乳動物細胞中，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞是過去的20年間最常用的細胞。除了給出適合的糖基化模式之外，這些細胞容許持續(xù)的產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定性，高生產(chǎn)性的克隆細胞系。使用無血清培養(yǎng)基，它們可以在簡單生物反應(yīng)器中被培養(yǎng)到高密度，并且容許開發(fā)安全和可再現(xiàn)的生物工藝。其它常用的動物細胞包括幼倉鼠腎 (BHK)細胞，NSO-和SP2/0-小鼠骨髓瘤細胞。最近，還已經(jīng)測試了來自轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)物。 (Jenkins et al. , Nature Biotechnol. 14 :975-81(1996))。
所有的抗體在重鏈恒定區(qū)的保守區(qū)域包含糖結(jié)構(gòu)，其中每種同種型都具有N-連接的糖結(jié)構(gòu)的獨特陣列，其可變地影響蛋白質(zhì)排列，分泌或功能活性。(Wright，Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。連接的 N-連接糖的結(jié)構(gòu)取決于加工的程度而相當(dāng)大地變化，并且可以包括高-甘露糖，多支鏈以及雙觸角的復(fù)合物寡糖 (Wright, Α.，和 Morrison, S. L.，Trends Biotech. 15 :26-32 (1997))。典型地，存在在特定糖基化位點連接的核心寡糖結(jié)構(gòu)的不均勻加工從而使均一的單克隆抗體作為多種糖形存在。類似地，已經(jīng)顯示在抗體糖基化中的主要不同發(fā)生在不同細胞系之間，并且在不同培養(yǎng)條件下，甚至觀察到對于給定細胞系的微小差異。(Lifely, M. R. et al.，Glycobiology 5(8) :813-22(1995))。
獲得潛能的大的增加，同時維持簡單的生產(chǎn)過程并潛在地避免明顯的，不理想的副作用的一種方式是通過改造它們的寡糖成分增加單克隆抗體的天然的、細胞介導(dǎo)的效應(yīng)子功能，如在Umafia, P. et al.，Nature Biotechnol. 17 :176-180(1999)和美國專利號6，602，684中所述，將它們?nèi)績?nèi)容并入作為參考。IgGl型抗體，在癌癥的免疫療法中最常用的抗體是在每個CH2結(jié)構(gòu)域的Asn297具有保守N-連接糖基化位點的糖蛋白。與 Asn297連接的兩個復(fù)合雙觸角寡糖隱藏在CH2結(jié)構(gòu)域之間，形成了與多肽主鏈的廣泛接觸，并且它們的存在對于抗體介導(dǎo)效應(yīng)子功能諸如抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)是
6必要的。(Lifely, M. R.，et al.，Glycobiology5 :813-822(1995) Jefferis, R.，et al.， Immunol Rev.163 :59-76(1998) ；Wright, A.and Morrison, S. L. , Trends Biotechnol. 15 ^-32(1997))。
本發(fā)明者在前面顯示了 β (l，4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(“( TΠI”)，其是催化等分寡糖的形成的糖基轉(zhuǎn)移酶，在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中的過量表達，顯著增加了由改造的CHO細胞產(chǎn)生的抗-成神經(jīng)細胞瘤嵌合單克隆抗體(chCE7)的體外ADCC活性。(見 Umana, P. et al. , Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999)；和國際公開號 WO 99/54342， 將其全部內(nèi)容并入作為參考)?？贵wchCE7屬于未綴合的mAbs的大類，其具有高腫瘤親和性和特異性，但是當(dāng)在缺乏&1TIII酶的標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)化細胞系中生產(chǎn)時，潛能過低而無法進行臨床應(yīng)用(Umana, P.，et al.，Nature Biotechnol. 17 176-180 (1999))。該研究首先顯示 ADCC活性的大量增加可以通過將產(chǎn)生抗體的細胞改變?yōu)楸磉_&1TIII而獲得，其也導(dǎo)致了恒定區(qū)(Fe)-關(guān)聯(lián)的，等分的寡糖的比例增加到在天然存在的抗體中發(fā)現(xiàn)水平以上，所述寡糖包括等分的，非巖藻糖基化的寡糖。
仍舊存在對于靶向CD20抗原以治療靈長類動物中的B細胞淋巴瘤的增加的治療性方法的需要，所述靈長類動物包括，但不限于，人。
發(fā)明簡述
認識到抗原結(jié)合分子(ABMs)的巨大治療潛能，本發(fā)明人開發(fā)了生產(chǎn)這些ABMs的方法，所述ABMs具有鼠B-Lyl抗體的結(jié)合特異性并且已經(jīng)進行了糖改造(glycoengineer) 以增加Fc受體結(jié)合親和性和效應(yīng)子功能。特別地，該方法包括產(chǎn)生重組的，嵌合抗體或其嵌合片段。這些ABMs的功效還通過改變抗體Fc區(qū)域的糖基化模式而增加。
因此，在一方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包括(a)選自由SEQ ID N0. :5， SEQ ID NO. :6 和 SEQ ID NO. :7. (CDRs Vih)組成的組的序列；(b)選自由 SEQ ID N0. :21， SEQ ID NO. :22 和 SEQ ID NO. :23. (CDRs VH_2)和 SEQ ID NO :24 組成的組的序列。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包括SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. :9和SEQ ID NO. 10.(⑶Rs VJ。在一個實施方案中，這些多核苷酸的任一個編碼融合的多肽。
在另一個方面，本發(fā)明涉及包括SEQ ID No. :2的分離的多核苷酸。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括SEQ ID No. :4的分離的多核苷酸。在又一個方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包括選自由 SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ； SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和 SEQ ID No :71組成的組的序列。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括SEQ ID No. :75的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，這些多核苷酸編碼融合的多肽。
本發(fā)明還涉及包括與SEQ ID NO :2具有至少80%同一性的序列的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸編碼融合的多肽。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括與SEQ ID NO :4具有至少80%同一性的序列的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸編碼融合的多肽。本發(fā)明還涉及包括與選自由SEQ ID No 29 ；SEQ ID No 31 ；SEQ ID No 33 ；SEQ ID No 35 ；SEQ ID No 37 ；SEQ ID No 39 ；SEQ ID No 41 ；SEQ ID No 43 ；SEQ ID No 45 ；SEQ ID No 47 ；SEQ ID No 49 ；SEQ ID No 51 ；SEQ ID No 53 ；SEQ ID No 55 ；SEQ ID No 57 ；SEQ ID No 59 ；SEQ ID No 61 ；SEQ ID No 63 ；SEQ ID No 65 ；SEQ ID No 67 ；SEQ ID No 69 ；和SEQ ID No :71組成的組的序列具有至少80%同一性的序列的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸編碼融合的多肽。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括與SEQ ID N0:75具有至少80%同一性的序列的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸編碼融合的多肽。
本發(fā)明還涉及包括SEQ ID NO :11(整個重鏈)的多核苷酸，或與SEQ ID NO: 11具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包括SEQ ID NO :12(整個輕鏈)的多核苷酸，或與SEQ ID而12具有80%，85%，90%，95%或99%同一性的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及編碼具有SEQ ID No. :1的序列的嵌合多肽的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸包括編碼具有SEQ ID No. :1的序列的多肽的序列；和來自除了小鼠之外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。本發(fā)明還涉及編碼具有選自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ； SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；和 SEQ ID No 72組成的組的序列的嵌合多肽的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸包括編碼具有選自由 SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2 組成的組的序列的多肽的序列；和來自除了小鼠之外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及編碼具有SEQ ID No. :3的序列的嵌合多肽的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸包括編碼具有SEQ ID No. :3的序列的多肽的序列；和來自除小鼠外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。在另一個方面中，本發(fā)明涉及編碼具有SEQ ID No. :76的序列的嵌合多肽的分離的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸包括編碼具有SEQ ID No. :76的序列的多肽的序列； 和來自除了小鼠之外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列編碼具有鼠B-Lyl抗體的Vh區(qū)域的多肽，或其功能變體，和一段序列，所述序列來自除小鼠之外的物種，編碼具有抗體Fc區(qū)域序列的多肽，或其片段。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的多核苷酸，其包括一段序列，所述序列編碼具有鼠B-Lyl抗體的/區(qū)域的多肽，或其功能變體，和一段序列， 所述序列來自除小鼠之外物種，編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
本發(fā)明還涉及包括上述分離的多核苷酸的任一種的表達載體，并且涉及包括這樣的表達載體的宿主細胞。在另一個方面，本發(fā)明涉及包括上述分離的多核苷酸的任一種的宿主細胞。
在一個方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包括(a)選自由SEQ ID NO. 15，SEQ ID NO. :16 和 SEQ ID NO. :17. (CDRs Vh^1)組成的組的序列；(b)選目由 SEQ ID NO. :25，SEQID NO. J6和SEQ ID NO. :27 (CDRs VH_2)；和SEQ ID NO :28組成的組的序列，其中所述多肽是融合多肽。在另一個方面，本發(fā)明涉及分離的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO. :18, SEQ ID NO. :19和SEQ ID NO. :20.(⑶Rs Vj，其中所述多肽是融合的多肽。
本發(fā)明還涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :1的序列，或其變體。本發(fā)明還涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :3的序列，或其變體。在一個實施方案中，這些多肽的任何一個還包括人Fc區(qū)域。本發(fā)明還涉及嵌合的多肽，其包括選自由SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ； SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ；禾口 SEQ ID No -J2組成的組的序列，或其變體。本發(fā)明還涉及嵌合多肽，其包括SEQ ID NO. :76的序列，或其變體。在一個實施方案中，這些多肽的任何一個還包括人Fc區(qū)域。
在另一個方面，本發(fā)明涉及這樣的多肽，所述多肽包括來自鼠B-Lyl抗體的序列和來自異源多肽的序列，并且涉及包括這樣的多肽的抗原結(jié)合分子。在一個實施方案中，抗原結(jié)合分子是抗體。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是嵌合的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，該抗體是人源化的或primatized。
在另外的方面中，本發(fā)明涉及分離的多肽，其包括SEQ ID NO :13，或其變體。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包括SEQ ID NO :14的分離的多肽。
在另一方面，本發(fā)明涉及ABM，其能夠與鼠B-Lyl抗體競爭結(jié)合⑶20并且是嵌合的。在一個實施方案中，該ABM是抗體或其片段。在另一個實施方案中，ABM是重組抗體，其包括具有選自由 SEQ ID N0. 1 ；SEQ ID No 30 ；SEQ ID No 32 ；SEQ ID No 34 ；SEQ ID No 36 ；SEQ ID No 38 ；SEQ ID No 40 ；SEQ ID No 42 ；SEQ ID No 44 ；SEQ ID No 46 ；SEQ ID No 48 ；SEQ ID No 50 ；SEQ ID No 52 ；SEQ ID No 54 ；SEQ ID No 56 ；SEQ ID No 58 ；SEQ ID No 60 ；SEQ ID No 62 ；SEQ ID No 64 ；SEQ ID No 66 ；SEQ ID No 68 ；SEQ ID No 70 ； 和SEQ ID No :72組成的組的氨基酸序列的Vh區(qū)域。在另一個實施方案中，ABM是重組抗體，其包括具有選自由SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO :76組成的組的氨基酸序列的Vl區(qū)域。 在另一個實施方案中，ABM是primatized的重組抗體。在另一個實施方案中，ABM是人源化的重組抗體。在另一個實施方案中，ABM是包括人Fc區(qū)域的重組抗體。在另一個實施方案中，上述討論的ABMs的任一個可以綴合于諸如毒素或放射性標(biāo)記的部分。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的ABM，所述ABM具有修飾的寡糖。在一個實施方案中，與未修飾的寡糖相比，修飾的寡糖具有減少的巖藻糖基化。在其它的實施方案中，修飾的寡糖是雜合的或復(fù)合的。在另一個實施方案中，ABM在所述分子的Fc區(qū)域中具有增加比例的非巖藻糖基化的寡糖或等分的非巖藻糖基化的寡糖。在一個實施方案中，等分的，非巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個實施方案中，該等分的，非巖藻糖基化的寡糖是復(fù)合的。在一個實施方案中，在所述多肽的Fc區(qū)域中，寡糖的至少20%是非巖藻糖基化的或等分的，非巖藻糖基化的。在更優(yōu)選的實施方案中，寡糖的至少30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%， 65 %，70 %或75 %或更多是非巖藻糖基化的或等分的，非巖藻糖基化的。
本發(fā)明還涉及編碼上述討論的ABMs的任一種的多核苷酸，并涉及包括這樣的多核苷酸的表達載體和細胞。[0041]本發(fā)明還涉及生產(chǎn)ABM的方法，其能夠與鼠B-Lyl抗體競爭結(jié)合⑶20，并且其中所述ABM是嵌合的；所述方法包括(a)在容許編碼所述ABM的所述多核苷酸表達的條件下， 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明的ABM的多核苷酸的宿主細胞；和(b)從得到的培養(yǎng)物中回收所述ABM。
在另一個方面，本發(fā)明涉及包括本發(fā)明的ABM的藥物組合物。意欲該藥物組合物還可以包含藥用載體，佐劑或其組合。
在另一個方面，本發(fā)明涉及治療可通過B細胞消減治療的疾病的方法。所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明的ABM施用給需要其的人受試者。在優(yōu)選的實施方案中，通過施用ABM來治療所述疾病，所述ABM是嵌合抗體，或抗體的嵌合片段。
在另一個方面，本發(fā)明涉及宿主細胞，所述宿主細胞被改造從而以足以修飾由該宿主細胞產(chǎn)生的Fc區(qū)域中寡糖的量，表達編碼具有&1TIII活性的多肽的至少一種核酸，其中所述ABM能夠與鼠B-Lyl抗體競爭結(jié)合CD20，并且其中ABM是嵌合的。在一個實施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽。在另一個實施方案中，由宿主細胞產(chǎn)生的ABM是抗體或抗體片段。在另一個實施方案中，該ABM包括與人IgG的Fc區(qū)域等價的區(qū)域。
本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸，其包括鼠B-Lyl抗體的至少一個互補決定區(qū)，或包含所述互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式，其中所述分離的多核苷酸編碼融合的多肽。優(yōu)選地，這種分離的多核苷酸編碼作為抗原結(jié)合分子的融合多肽。在一個實施方案中，多核苷酸包括鼠B-Lyl抗體的三個互補決定區(qū)，或包含所述三個互補決定區(qū)的每個的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式。在另一個實施方案中，多核苷酸編碼嵌合(例如，人源化)抗體的輕鏈或重鏈的整個可變區(qū)。本發(fā)明還涉及由這些多核苷酸編碼的多肽。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包括鼠B-Lyl抗體的至少一個互補決定區(qū)的抗原組合分子，或包含所述互補決定區(qū)的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式，并包含來自異源多肽的序列。在一個實施方案中，抗原結(jié)合分子包括鼠B-Lyl抗體的三個互補決定區(qū)，或包含所述三個互補決定區(qū)的每個的至少特異性決定殘基的其變體或截短形式。在另一個方面，抗原結(jié)合分子包括抗體輕鏈或重鏈的可變區(qū)。在一個特別有用的實施方案中， 抗原結(jié)合分子是嵌合的，例如人源化的抗體。本發(fā)明還涉及制備這些抗原結(jié)合分子的方法， 和將這些分子用在治療疾病中的應(yīng)用，所述疾病包括B細胞淋巴瘤。
本發(fā)明是對II型抗-⑶20抗體進行了改造從而增加其效應(yīng)子功能諸如ADCC，同時仍舊保持有效的程序性細胞死亡能力的第一個已知實例。因此，本發(fā)明涉及改造的II型抗-CD20抗體，其因為所述改造而具有增加的ADCC并且沒有喪失誘導(dǎo)程序性細胞死亡的基本能力。在一個實施方案中，II型抗-CD20抗體已經(jīng)被改造從而具有在Fc區(qū)域中的改變的糖基化模式。在特別的實施方案中，改變的糖基化包括在Fc區(qū)域中增加水平的的等分的復(fù)合殘基。在另一個特別的實施方案中，改變的糖基化包括在Fc區(qū)域中減少水平的巖藻糖殘基。在另一個實施方案中，II型-抗⑶20抗體已經(jīng)進行了多肽改造。本發(fā)明還涉及制備這樣的被改造的II型抗體的方法，和涉及使用這些抗體治療各種B細胞疾病，包括B細胞淋巴瘤的方法。
本發(fā)明的宿主細胞可以選自這樣的組，所述組包括，但不限于，CHO細胞，BHK細胞，NSO細胞，SP2/0細胞，YO骨髓瘤細胞，P3X63小鼠骨髓瘤細胞，PER細胞，PER. C6細胞或雜交瘤細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞還包括轉(zhuǎn)染的多核苷酸，其包括編碼鼠B-Lyl抗體的/區(qū)域或其變體的多核苷酸和編碼等價于人免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域的序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞還包括轉(zhuǎn)染的多核苷酸，其包括編碼鼠 B-Lyl抗體的Vh區(qū)域或其變體的多核苷酸和編碼等價于人免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域的序列。
在另一個方面，本發(fā)明涉及這樣的宿主細胞，其產(chǎn)生由于修飾了其寡糖而顯示增加的Fc受體結(jié)合親和性和/或增加的效應(yīng)子功能的ABM。在一個實施方案中，增加的結(jié)合親和性針對Fc受體，特別地針對Fc YRIIIA受體。本文考慮的效應(yīng)子功能可以選自這樣的組，所述組包括，但不限于，增加的Fc-介導(dǎo)的細胞毒性；增加的與NK細胞的結(jié)合；增加的與巨噬細胞的結(jié)合；增加的與多形核細胞的結(jié)合；增加的與單核細胞的結(jié)合；增加的定向信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)程序性細胞死亡；增加的樹突細胞成熟；和增加的T細胞引發(fā)。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞包括至少一個編碼具有&1TIII活性的多肽的核酸，其與組成型啟動子元件可操作地連接。
在另一個方面中，本發(fā)明涉及在宿主細胞中產(chǎn)生ABM的方法，其包括(a)在容許所述ABM產(chǎn)生和容許在所述ABM的Fc區(qū)域上存在的寡糖的修飾的條件下，培養(yǎng)這樣的宿主細胞，所述宿主細胞被改造從而表達至少一個編碼具有&1TIII活性的融合多肽的多核苷酸；和(b)分離所述ABM ；其中所述ABM能夠與鼠B-Lyl抗體競爭結(jié)合CD20并且其中所述 ABM是嵌合的。在一個實施方案中，具有&1TIII活性的多肽是融合多肽，優(yōu)選地包括&1TIII 的催化結(jié)構(gòu)域和異源高爾基體定居(resident)多肽的高爾基體定位結(jié)構(gòu)域，所述定位結(jié)構(gòu)域選自由下列組成的組甘露糖苷酶II的定位結(jié)構(gòu)域，β (1,2)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 K "GnTI")的定位結(jié)構(gòu)域，甘露糖苷酶I的定位結(jié)構(gòu)域，β (1，2)-Ν-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 IK "GnTII")的定位結(jié)構(gòu)域，和α 1-6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的定位結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該高爾基體定位結(jié)構(gòu)域來自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在另一個方面，本發(fā)明涉及改進由宿主細胞產(chǎn)生的抗-CD20 ABM的糖基化模式的方法，所述方法包括向該宿主細胞引入至少一個本發(fā)明的核酸或表達載體。在一個實施方案中，該ABM是抗體或其片段；優(yōu)選地包括IgG的Fc區(qū)域。或者，多肽是融合蛋白質(zhì)，其包括等價于人IgG的Fc區(qū)域的區(qū)域。
在一個方面，本發(fā)明涉及重組的，嵌合抗體，或其片段，其能夠與鼠B-Lyl抗體競爭結(jié)合CD20并具有減少的巖藻糖基化。
在另一個方面，本發(fā)明涉及通過使用融合多肽，來改進本發(fā)明的重組抗體或其片段的糖基化的方法，所述融合多肽具有&1ΤΙΙΙ活性并包括異源高爾基體定居多肽的高爾基體定位結(jié)合域。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合多肽包括&1ΤΙΙΙ的催化結(jié)構(gòu)域。在另一個實施方案中，高爾基體定位結(jié)構(gòu)域選自由下列組成的組甘露糖苷酶II的定位結(jié)構(gòu)域，&ιΤΙ的定位結(jié)構(gòu)域，甘露糖苷酶I的定位結(jié)構(gòu)域，&1ΤΙΙ的定位結(jié)構(gòu)域，和α 1-6核心巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的定位結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，該高爾基體定位結(jié)構(gòu)域來自甘露糖苷酶II或&ιΤΙ。
在一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生具有修飾的寡糖的重組的，嵌合的抗體或其片段，其中所述修飾的寡糖與未修飾的寡糖相比具有減少的巖藻糖基化。按照本發(fā)明，這些修飾的寡糖可以是雜合的或復(fù)合的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生重組的，嵌合的抗體或其片段，其在所述多肽的Fc區(qū)域中具有增加比例的等分的，非巖藻糖基化的寡糖。在一個實施方案中，等分的，非巖藻糖基化的寡糖是雜合的。在另一個實施方案中，等分的，非巖藻糖基化的寡糖是復(fù)合的。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法涉及產(chǎn)生重組的，嵌合的抗體或其片段，其在所述多肽的Fc區(qū)域中具有至少20 %的寡糖，所述寡糖是等分的，非巖藻糖基化的。在優(yōu)選的實施方案中，在所述多肽的Fc區(qū)域中至少30% 的寡糖是等分的，非巖藻糖基化的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，其中在所述多肽的Fc區(qū)域中，至少35%的寡糖是等分的，非巖藻糖基化的。
在另一個方面，本發(fā)明涉及重組的，嵌合的抗體或其片段，其由于其寡糖的修飾而顯示增加的Fc受體結(jié)合親和性和/或增加的效應(yīng)子功能。在一個實施方案中，增加的結(jié)合親和性針對Fc激活受體。在另一個實施方案中，F(xiàn)c受體是Fc γ激活受體，特別地 Fc γ RIIIA受體。本文考慮的效應(yīng)子功能可以選自這樣的組，所述組包括，但不限于，增加的Fc-介導(dǎo)的細胞的細胞毒性；增加的與NK細胞的結(jié)合；增加的與巨噬細胞的結(jié)合；增加的與多形核細胞的結(jié)合；增加的與單核細胞的結(jié)合；增加的定向信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)程序性細胞死亡；增加的樹突細胞成熟；和增加的T細胞引發(fā)。
在另一個方面，本發(fā)明涉及重組的，嵌合的抗體片段，其具有鼠B-Lyl抗體的結(jié)合特異性并包含F(xiàn)c區(qū)域，所述抗體片段被進行了改造從而具有由本發(fā)明的方法的任一個所產(chǎn)生的增加的效應(yīng)子功能。
在另一個方面，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :1的序列的多肽和等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域，并且所述融合蛋白被改造從而具有由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的增加的效應(yīng)子功能。
在另一個方面，本發(fā)明涉及融合蛋白，其包括具有SEQ ID NO :3的序列的多肽和等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域，并且所述融合蛋白被改造從而具有由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的增加的效應(yīng)子功能。
在一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的重組的嵌合的抗體，和藥用載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的重組的嵌合的抗體片段，和藥用載體。在另一個方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包括由本發(fā)明的任一方法所產(chǎn)生的融合蛋白和藥用載體。
本發(fā)明還涉及治療可通過B細胞消減來治療的疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的通過本發(fā)明的方法的任一種產(chǎn)生的重組的，嵌合抗體或其片段施用于需要其的人受試者。
附圖簡述

圖1鼠B-Lyl的Vh區(qū)域的核苷酸(SEQ ID NO 2)和氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。
圖2鼠B-Lyl的Vl區(qū)域的核苷酸(SEQ ID NO 4)和氨基酸序列(SEQ ID NO 3)。
圖3利妥昔單丨充 (0)和ch_B_Lyl ( Δ )與在feiji B-淋巴瘤細胞上的⑶20的結(jié)
口 O
圖4在下列三種不同種類的FCYRIIIa-158V/F基因型的全血中，利妥昔單抗 (0)和ch-B_Lyl ( Δ )導(dǎo)致的B細胞消減㈧來自對于較低親和性受體純合的F/F供體的全血；(B)來自對于親和性受體是雜合的F/V供體的全血；和(C)來自對于較高親和性受體純合的V/V供體的全血。
圖5嵌合的，抗-⑶20抗體的重鏈的核苷酸(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQID NO 13)。
圖6嵌合的，抗-⑶20抗體的輕鏈的核苷酸(SEQ ID NO 12)和氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。
圖7鼠B-Lyl抗體CDRs的核苷酸和氨基酸序列。(A) Vh區(qū)域的預(yù)期CDRs。(B)Vl 區(qū)域的預(yù)期⑶Rs。
圖8糖改造的，嵌合B-Lyl抗體的MALDI-T0F模式。(A)詳述特異性峰的百分比的表；(B)糖改造的嵌合B-Lyl的光譜；(C)用Endo-H處理的糖改造的嵌合B-Lyl的光譜。
圖9不同的人源化的抗-⑶20抗體與Raji B細胞的結(jié)合。在B-HH2構(gòu)建體和 B-HL8和B-HLll構(gòu)建體之間的差異存在于構(gòu)架1和2區(qū)域中，其中所有的三個⑶Rs是相同的。B-HL8和B-HLll的FRl和FR2序列來自人VH3類，而完整的B-HH2構(gòu)架是人VHl來源的。B-HLll是具有單一突變GlulGln的B-HL8的衍生物，其中Gln是B-HH2構(gòu)建體的氨基酸殘基。這意味著GlulGln交換沒有改變結(jié)合親和性或強度。在B-HH2和B-HL8之間的其它差異是14FR殘基，其中一個或多個將影響該抗體的抗原結(jié)合行為。
圖10在Raji靶細胞上的人源化的抗-⑶20抗體BHL4-KV1的結(jié)合。通過用人種系序列VH1_45的FRl替換B-HH2的FRl，該B-HL4構(gòu)建體來源自B-HH2抗體。該構(gòu)建體顯示大大減少的抗原結(jié)合能力，盡管在FRl中的僅三個位點上具有不同的氨基酸。這些殘基位于按照Kabat編號方式的位點2，14，和30處。其中，位點30似乎是最有影響的位點，因為其是⑶Rl的Chothia限定的部分。
圖11.在B-HH1，B-HH2，B_HH3和母體抗體B-Iyl之間的結(jié)合行為的比較。該數(shù)據(jù)顯示所有的Abs顯示相似的EC50值，但是與變體B-HH2和B-HH3相比，B-HHl構(gòu)建體以更低的強度/化學(xué)計量結(jié)合。B-HHl可以通過其部分人⑶Rl和⑶R2區(qū)域(Kabat定義)，以及在位點28 (Kabat編號方式)上的Ala/Thr多態(tài)性，與B-HH2和B-HH3區(qū)分。這顯示位點觀，完整的⑶R1，和/或完整的⑶R2的任一對于抗體/抗原相互作用是重要的。
圖12B-HL1，B-HHljP B-Iyl母體抗體的比較。該數(shù)據(jù)顯示在B-HLl構(gòu)建體中的任何結(jié)合活性的缺乏，和與B-Iyl相比，大約一半的B-HHl結(jié)合強度/化學(xué)計量。B-HLl以及B-HHl兩者，基于來自人VHl類的受體構(gòu)架進行設(shè)計。在其它的差異中，B-HLl的位點 71 (Kabat編號方式)構(gòu)建體是顯著的差異，顯示其對于抗原結(jié)合的推定的重要性。
圖13抗-CD20抗體與其抗原的capaicty的熒光細胞計量(Fluorocytometric) 分析。該數(shù)據(jù)顯示B-HL2和B-HL3構(gòu)建體沒有顯示CD-20結(jié)合活性。
圖14在Z-138MCL細胞上的抗-⑶20抗體的程序性細胞死亡。
圖15抗-⑶20抗體導(dǎo)致程序性細胞死亡。測定詳述將切105細胞/孔接種在M 孔板(5x105細胞/ml)的培養(yǎng)基中。將用于陰性對照的IOmg的各個Ab，PBS或5mM喜樹堿(CPT)陽性對照加入孔中。將樣品溫育ο/η (16小時)，用ArmV-FITC染色，并通過FACS 進行分析。測定以三次重復(fù)進行(*)減去對于單獨的PBS的信號(單獨的PBS對于PR-I 和Ζ-138細胞分別給出8%和2%的ArmV+)。所用的抗體是C2B8 (嵌合的，非糖改造的)； BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的)。注意該測定不包括任何另外的效應(yīng)細胞，僅是靶加上抗體或?qū)φ铡?br>圖16以免疫效應(yīng)細胞造成的抗-⑶20抗體的靶細胞殺傷。測定詳述在過夜溫育的正常全血細胞中的B細胞消減和通過FACS分析⑶19+/⑶3+。使用PBMCs作為效應(yīng)物的ADCC，4小時溫育，25 1的效應(yīng)物靶標(biāo)比率，通過鈣熒光素-保留相對于去污劑-裂解 (100% )和無Ab的裂解(0% )測量的靶標(biāo)殺傷。所用的抗體:C2B8(嵌合的，非糖改造形式)；BHH2-KVl-Wt (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)；BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1的人源化的，非糖改造形式)。
圖17未修飾的，非糖改造的BHH2-KV1人源化的IgGl B-Iyl抗-人⑶20抗體的 PNGaseF-釋放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。
圖18糖改造的BHH2_KVlgl人源化的IgGlB-Iyl抗-人CD20抗體的PNGaseF-釋放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通過在宿主細胞中的抗體基因和編碼具有β_1， 4-Ν-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因的共表達來進行。
圖19糖改造的BHH2_KVlg2人源化的IgGl B-Iyl抗-人CD20抗體的PNGaseF-釋放的Fc-寡糖的MALDI/T0F-MS模式。糖改造通過在宿主細胞中的抗體基因和編碼具有 β-1，4-Ν-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶ΙΙΙ(&ιΤ-ΙΙΙ)催化活性的酶的基因以及編碼具有高爾基體 α -甘露糖苷酶II催化活性的酶的基因的共表達來進行。
圖20非糖改造和糖改造的抗體與在重組CHO-⑶16細胞表面展示上的人 Fc γ RIIIa受體的結(jié)合。
圖21非-Fc改造的和Fc改造的抗-⑶20抗體對Z-138MCL細胞造成的程序性細胞死亡。測定詳述將切105細胞/孔接種在對孔板(5x105細胞/ml)的培養(yǎng)基中。將用于陰性對照的IOmg的各個Ab，PBS加入孔中。將樣品溫育ο/η (16小時)，用ArmV-FITC染色，并通過FACS進行分析。測定以三次重復(fù)進行。所用的Abs:C2B8=利妥昔單抗(嵌合的，非糖改造形式，與商業(yè)形式相同)；BHH2-KV1 (人源化的，非糖改造的-見圖6糖基化模式)；BHH2-KVlgl(人源化的，糖改造的-見圖7糖基化模式)；BHH2_KVlg2 (人源化的，糖改造的-見圖8糖基化模式)。注意這種測定不包括任何另外的效應(yīng)細胞，僅是靶標(biāo)加抗體或?qū)φ铡?*)減去單獨的PBS的信號。
發(fā)明詳述
本文所用的術(shù)語如本領(lǐng)域通常所用的，除非如下另外指出。
用于本文時，術(shù)語抗體意欲包括整個抗體分子，以及具有Fc區(qū)域并保留結(jié)合特異性的抗體片段，和融合蛋白，所述融合蛋白包括等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域并保留結(jié)合特異性，所述整個抗體分子包括單克隆抗體，多克隆抗體和多特異性(例如，二特異性)的抗體。還包括人源化，primatized和嵌合的抗體。
用于本文時，術(shù)語Fc區(qū)域意欲指IgG重鏈的C-末端區(qū)域。盡管IgG重鏈的Fc區(qū)域的范圍可以輕微變化，人IgG重鏈Fc區(qū)域通常限定為從位點的氨基酸殘基延伸到羧基末端一段。
用于本文時，術(shù)語“等價于免疫球蛋白的Fc區(qū)域的區(qū)域”意欲包括免疫球蛋白的 Fc區(qū)域的天然存在的等位基因變體以及具有改變的變體，所述改變產(chǎn)生置換，添加，或缺失，但是基本不會減少免疫球蛋白介導(dǎo)效應(yīng)子功能(諸如抗體依賴性的細胞的細胞毒性) 的能力。例如，在免疫球蛋白的Fc區(qū)域的N-末端或C末端可以缺失一個或多個氨基酸，而基本不喪失生物學(xué)功能。可以按照本領(lǐng)域已知的一般規(guī)則來選擇這些變體從而對活性具有最小的影響。(見，例如 Bowie，J. U. et al. , Science 247:1306-10(1990)。
用于本文時，在其最廣義上講，術(shù)語抗原結(jié)合分子指特異性結(jié)合抗原決定簇的分子。更具體地，結(jié)合CD20的抗原結(jié)合分子是特異性結(jié)合35，000道爾頓的細胞表面的非糖基化磷蛋白的分子，所述細胞表面的非糖基化磷蛋白典型地指通常被稱為CD20的人B淋巴細胞限制性分化抗原Bp35。所謂“特異性結(jié)合”指結(jié)合對于抗原是選擇性的并且可以與不需要的或非特異性相互作用區(qū)別開。
用于本文時，當(dāng)用在涉及多肽諸如ABMs中時，術(shù)語融合的和嵌合的，指這樣的多肽，所述多肽包括來自兩個或更多異源多肽的氨基酸序列，諸如來自不同物種的抗體的部分。例如，對于嵌合ABMs而言，非抗原結(jié)合成分可以來自廣泛種類的物種，包括靈長類動物諸如黑猩猩和人。最優(yōu)選嵌合ABM的恒定區(qū)與天然人抗體的恒定區(qū)基本相同；最優(yōu)選嵌合抗體的可變區(qū)與重組抗⑶-20抗體的可變區(qū)基本相同，所述抗⑶-20抗體具有鼠B-Lyl的可變區(qū)的氨基酸序列。人源化的抗體是融合或嵌合抗體的特別優(yōu)選的形式。
用于本文時，具有"&1TIII活性"的多肽指這樣的多肽，所述多肽能夠催化以 β -1-4連接將N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)殘基添加到N-連接的寡糖中的三甘露糖基核心的β連接的甘露糖苷上。這包括融合多肽，所述多肽顯示類似于但不必須相同于，β (1， 4)-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III的活性的酶活性，如在特別的生物測定中所測量的，具有或不具有劑量依賴性，按照國際生化和分子生物學(xué)命名委員會(NC-IUBMB)，其也被稱為β-1， 4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰基葡糖胺基-轉(zhuǎn)移酶(EC 2.4.1.144)。在其中確實存在劑量依賴性的情形中，其不需要與&1TIII的劑量依賴性相同，但是與&1TIII活性相比， 基本類似于在給定活性中的劑量依賴(即，相對于&1TIII，候選多肽將顯示更大的活性或不超過約25倍更少，并且優(yōu)選地，不超過約10倍更少的活性，并且最優(yōu)選地，不超過約三倍更少的活性)。
用于本文時，術(shù)語變體(或類似物)指通過使用，例如重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的氨基酸插入，缺失，和置換而與本發(fā)明特別陳述的多肽區(qū)別開的多肽。本發(fā)明的ABMs的變體包括嵌合的，primatized或人源化的抗原結(jié)合分子，其中氨基酸殘基的一個或數(shù)個通過以這樣的方式置換，添加和/或缺失進行修飾，所述方式基本上不影響抗原(例如，CD20)結(jié)合親和性?？梢酝ㄟ^將特定多肽的序列與同源肽的序列進行比較并使在高同源性的區(qū)域(保守區(qū)域)中所作的氨基酸序列變化的數(shù)量最少化，或通過用共有序列來替代氨基酸來發(fā)現(xiàn)確定哪種氨基酸可以被取代，添加，或缺失而不會破壞目標(biāo)活性的指導(dǎo)。
或者，編碼這些相同或類似多肽的重組變體可以通過使用在遺傳密碼中的“豐余性”來合成或選擇。各種密碼子置換，諸如產(chǎn)生各種限制性位點的沉默改變可以被引入從而優(yōu)化克隆到質(zhì)?；虿《据d體中，或在特定原核或真核系統(tǒng)中的表達。在多核苷酸序列中的突變可以反映在多肽或被加入多肽的其它肽的結(jié)構(gòu)域中從而修飾多肽的任何部分的特性， 從而改變特性諸如配體結(jié)合親和性，鏈間親和性，或降解/更新率。
優(yōu)選地，氨基酸“置換”是用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的另一個氨基酸取代的結(jié)果，即保守性氨基酸取代?！氨Ｊ匦浴卑被嶂脫Q可以在涉及的殘基的極性、電荷、溶解度、 疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相似性基礎(chǔ)上進行。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和甲硫氨酸；極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，和谷氨酰胺；帶正電荷(堿性) 的氨基酸包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸；并且?guī)ж撾姾傻?酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。“插入”或“缺失”優(yōu)選地在約1到20個氨基酸的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1-10個氨基酸范圍內(nèi)。容許的變化可以使用重組DNA技術(shù)和測定得到的重組變體的活性，通過系統(tǒng)性在多肽分子中進行氨基酸插入，缺失或置換來實驗性地進行確定。
用于本文時，術(shù)語人源化用于指來自非人抗原結(jié)合分子，例如，鼠抗體的抗原結(jié)合分子，其保持或基本保持母體分子的抗原結(jié)合特性，但是在人中具有更少的免疫原性。這可以通過各種方法來實現(xiàn)，所述方法包括(a)將整個非人的可變結(jié)構(gòu)域移植到人恒定區(qū)上從而產(chǎn)生嵌合抗體，(b)僅將非人CDRs移植到人構(gòu)架和恒定區(qū)上，保留或不保留關(guān)鍵的構(gòu)架殘基(例如，對于保持良好的抗原結(jié)合親和性或抗體功能是重要的那些)，或(c)移植整個非人的可變結(jié)構(gòu)域，但是通過表面殘基的取代用人樣切片來“遮蔽”它們。這些方法公開于 Jones et al.，Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. ,81 6851-6855(1984) ；Morrison 禾口 Oi，Adv. Immunol. ,44 :65-92(1988) ；Verhoeyen et al.， Science,239 :1534-1536(1988) ；Padlan, Molec. Immun. ,28 :489-498(1991) ；Padlan, Molec. Immun. ,31(3) :169-217 (1994)，將它們?nèi)坎⑷氡疚淖鳛閰⒖?。在抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的每一個通常存在3個互補決定區(qū)，或⑶Rs，(⑶R1，⑶R2和⑶R3)，其側(cè)面是抗體的重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的每個中的四個構(gòu)架亞區(qū)域(即，F(xiàn)Rl, FR2，F(xiàn)R3，和 FR4) :FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗體的討論可以，見于特別是美國專利號 6，632，927，和公開的美國申請?zhí)?003/0175269中，將它們兩者全文并入本文作為參考。
類似地，用于本文時，術(shù)語primatized用于指來自非靈長類動物抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合分子，例如，鼠抗體，其保留或基本保留母體分子的抗原結(jié)合性質(zhì)，但是在靈長類動物中具有更少的免疫原性。
在本領(lǐng)域使用和/或接受的術(shù)語存在兩個或多個定義的情形中，用于本文時的術(shù)語的定義傾向于包括所有的這些含義，除非明確地以相反的意思指出。具體的實例是使用術(shù)語“互補決定區(qū)”("CDR")來描述在重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)抗原結(jié)合位點。這種特別的區(qū)域已經(jīng)在Kabat et al. , U. S. Dept. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)禾口 Chothia et al. ,J. Mol.Biol. 196 :901-917(1987)中進行了描述，將它們并入本文作為參考，其中當(dāng)針對彼此比較時，所述定義包括氨基酸殘基的重疊或子集。但是，將任一定義用于指抗體或其變體的CDR的應(yīng)用傾向于在本文所限定和使用的術(shù)語的范圍內(nèi)。構(gòu)成如上面引用的參考文獻的每個所定義的CDRs的適合的氨基酸殘基在下面的表I中提出作為比較。構(gòu)成特定 CDR的精確殘基數(shù)目將根據(jù)CDR的序列和大小而變化。假定抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)確定那一種殘基構(gòu)成特定的CDR。
表1.CDR 定義1
KabatChothiaAbMVh CDRl31-3526-3226-35Vh CDR250-6552-5850-58Vh CDR395-10295-10295-102
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸,其包括SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10。
2.分離的多核苷酸，其包括SEQID No:2。
3.分離的多核苷酸，其包括SEQID No:4。
4.分離的多核苷酸，其包括與SEQID NO :2具有至少80%同一性的序列，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。
5.分離的多核苷酸，其包括與SEQID NO :4具有至少80%同一性的序列，其中所述分離的多核苷酸編碼融合多肽。
6.分離的多核苷酸，其包括a.編碼具有SEQID No 1的序列的多肽的序列；和b.來自除小鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
7.分離的多核苷酸，其包括a.編碼具有SEQID No 3的序列的多肽的序列；和b.來自除小鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
8.分離的多核苷酸，其包括與SEQID N0:11或SEQ ID NO :12具有至少80%同一性的序列。
9.分離的多核苷酸，其包括a. 一段序列，所述序列編碼具有鼠B-Lyl抗體的VH區(qū)域的多肽，或其變體；和b來自除小鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
10.分離的多核苷酸，其包括a.一段序列，所述序列編碼具有鼠B-Lyl抗體的V區(qū)域的多肽，或其變體；和b.來自除小鼠以外的物種的序列，所述序列編碼具有抗體Fc區(qū)域的序列的多肽，或其片段。
專利摘要
本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子(ABMs)。在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及重組單克隆抗體，其包括特異于人CD20的嵌合的、primatized或人源化的抗體。此外，本發(fā)明涉及編碼這些ABMs的核酸分子，和包括這些核酸分子的載體和宿主細胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明的ABMs的方法，并且涉及使用這些ABMs治療疾病的方法。此外，本發(fā)明涉及具有修飾的糖基化的ABMs，所述ABMs具有改善的治療性質(zhì)，包括具有增加的Fc受體結(jié)合和增加的效應(yīng)子功能的抗體。
文檔編號C12Q1/68GKCN102373214SQ201110285833
公開日2012年3月14日 申請日期2004年11月5日
發(fā)明者C·費拉拉, E·默斯納, P·烏馬納, P·布倫克爾, T·蘇特, U·蓬特納 申請人:格黎卡特生物技術(shù)股份公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan