專利名稱:δ-內(nèi)毒素基因家庭，AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040和AXMI-049，及其使用方法
δ -內(nèi)毒素基因家族，AXM1-031, AXMI -039、AXMI -040 禾口 AXM卜049，及其使用方法
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。提供了編碼殺有害生物蛋白質(zhì)的新型基因。這些蛋白質(zhì)和編碼它們的核酸序列可用于制備殺有害生物制劑和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的抗有害生物的植物。
發(fā)明背景
蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)是革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢土壤細(xì)菌，其特征在于其產(chǎn)生晶狀內(nèi)含體的能力，所述晶狀內(nèi)含體特異性地對于昆蟲的某些目和種具有毒性，但對于植物和其他非靶生物體是無害的。因此，包含蘇云金芽孢桿菌菌株或它們的殺昆蟲蛋白質(zhì)的組合物可用作環(huán)境上可接受的殺昆蟲劑以用于防治農(nóng)業(yè)昆蟲有害生物或者各種人或動物疾病的昆蟲媒介物。
來自蘇云金芽孢桿菌的晶體(Cry)蛋白(δ -內(nèi)毒素)具有有效的主要針對鱗翅類昆蟲、雙翅類昆蟲和鞘翅類昆蟲幼蟲的殺有害生物活性。這些蛋白質(zhì)也顯示出針對膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、風(fēng)目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)禾口蜱螨亞綱(Acari)有害生物，以及其他無脊椎動物例如線形動物門(Nemathelminthes)、 扁形動物門(Platyhelminthes)和肉鞭毛蟲門(Sarcomastigorphora) (Feitelson(1993) The BacillusThuringiensis family tree. Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc. , New York，N. Y.)。這些蛋白質(zhì)最初主要基于它們的殺昆蟲活性而分類為 CryI至CryV。主要類別是鱗翅目特異性的(I)、鱗翅目和雙翅目特異性的(II)、鞘翅目特異性的(III)、雙翅目特異性的(IV)以及線蟲特異性的(V)和(VI)。這些蛋白質(zhì)進(jìn)一步分類成亞家族；在每個(gè)家族內(nèi)更高度相關(guān)的蛋白質(zhì)被指定了分組字母例如Cry 1A、CrylB, CrylC 等。在每個(gè)分組內(nèi)更加密切相關(guān)的蛋白質(zhì)被給予諸如CrylCl、CrylC2等的名稱。
最近基于氨基酸序列同源性而不是昆蟲靶特異性描述了 Cry基因的新命名法 (crickmore 等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813)。在所述新的分類中， 每種毒素被指定了獨(dú)特的名稱，其中包括第一級(primary rank)(阿拉伯?dāng)?shù)字)、第二級 (secondaryrank)(大寫字母)、第三級(tertiary rank)(小寫字母)禾口第四級(quaternary rank)(另一個(gè)阿拉伯?dāng)?shù)字)。在所述新的分類中，在第一級中，羅馬數(shù)字已被換成阿拉伯?dāng)?shù)字。具有低于45%的序列同一性的蛋白質(zhì)具有不同的第一級，第二和第三級的標(biāo)準(zhǔn)分別為 78% 禾口 95%。
晶體蛋白不展示殺昆蟲活性，直至其被攝取并溶解在昆蟲中腸之中。被攝取的原毒素在昆蟲消化道中被蛋白酶水解成活性毒性分子。(Hiifte和Whiteley(1989) Microbiol. Rev. 53 :242-255)。該毒素與靶幼蟲的中腸中的頂端刷狀緣受體結(jié)合并插入頂端膜中，因而產(chǎn)生離子通道或孔，從而導(dǎo)致幼蟲死亡。
δ -內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(參見，例如，de Maagd等人Q001)Trends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域由7個(gè) α螺旋組成，并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型進(jìn)行排列的三個(gè)β折疊片組成，和結(jié)構(gòu)域III由以“果凍卷餅(jelly-roll)”樣式的兩個(gè)反向平行β折疊片組成(de Maagd等人，2001，同上)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識別和結(jié)合，因而被認(rèn)為是毒素特異性的決定子。
因?yàn)槔ハx可帶來的破壞，所以存在對于發(fā)現(xiàn)新形式的蘇云金芽孢桿菌δ -內(nèi)毒素的持續(xù)需要。
發(fā)明概述
提供了用于將有害生物抗性賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子的組合物和方法。組合物包括編碼δ -內(nèi)毒素多肽的序列的核酸分子、含有這些核酸分子的載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。組合物還包括內(nèi)毒素的多肽序列和針對這些多肽的抗體。所述核苷酸序列可以在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中使用以用于轉(zhuǎn)化生物體(包括微生物和植物)并在其中表達(dá)。所述核苷酸或氨基酸序列可以是被設(shè)計(jì)用于在生物體(包括但不限于微生物或植物)中表達(dá)的合成序列。組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。
特別地，提供了相應(yīng)于δ-內(nèi)毒素核酸序列的分離的核酸分子。另外，還包括相應(yīng)于所述多核苷酸的氨基酸序列。特別地，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 或 38 中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、M、26J8、30、32、34 或 37 中所示的核苷酸序列，或以登記號B-30935、B-30936、B-30937和B-50046保藏在細(xì)菌宿主中的 S-內(nèi)毒素核苷酸序列，以及其變體和片段。還包括與本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列或與本發(fā)明的序列雜交的核苷酸序列。
提供了用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的方法，和用于使用這些多肽來防治或殺死鱗翅類或鞘翅類有害生物的方法。還包括用于在樣品中檢測本發(fā)明的核酸和多肽的方法和試劑
品.ο
進(jìn)一步提供了用于防治或殺死線蟲有害生物群體的方法。所述方法包括向植物中引入編碼具有大于22kDa的分子大小的線蟲活性多肽的多核苷酸。這些線蟲活性多肽可用于防治或殺死植物寄生性線蟲，特別是胞囊線蟲(cyst nematodes)。
本發(fā)明的組合物和方法可用于產(chǎn)生具有有害生物抗性的生物體，特別是細(xì)菌和植物。這些生物體和從其衍生的組合物對于農(nóng)業(yè)目的來說是所希望的。本發(fā)明的組合物還可用于產(chǎn)生改變的或改進(jìn)的具有殺有害生物活性(pesticidal activity)的δ -內(nèi)毒素蛋白，或用于檢測產(chǎn)品或生物體中S -內(nèi)毒素蛋白或核酸的存在。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)生物體特別是植物或植物細(xì)胞中的有害生物抗性的組合物和方法。所述方法包括用編碼本發(fā)明的S-內(nèi)毒素蛋白的核苷酸序列來轉(zhuǎn)化生物體。特別地，本發(fā)明核苷酸序列可用于制備具有殺有害生物活性的植物和微生物。因此，提供了轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物是蘇云金芽孢桿菌的S-內(nèi)毒素核酸和蛋白質(zhì)。所述序列可用于構(gòu)建用于隨后轉(zhuǎn)化入目的生物體中的表達(dá)載體，用作用于分離其他S-內(nèi)毒素基因的探針，和用于通過本領(lǐng)域中已知的方法(例如，結(jié)構(gòu)域交換或DNA改組)來產(chǎn)生改變的殺有害生物蛋白質(zhì)(pesticidal protein)。所述蛋白質(zhì)可用于防治或殺死鱗翅類昆蟲、鞘翅類昆蟲和線蟲有害生物群體，和用于生產(chǎn)具有殺有害生物活性的組合物。[0017]包含本發(fā)明的核苷酸序列的質(zhì)粒于2006年6月9日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(Agricultural Research Service CultureCollection, Northern Regional Research Laboratory(NRRL),1815North University Street, Peoria, Illinois 61604, United Statesof America)的永久收藏中，登記號為 NRRL B-30935 (axmi-031), NRRL B-30936 (axmi-039)、NRRL B-30937 (axmi-040)；和于 2007 年 5 月四日保藏于農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心的永久收藏中，登記號為NRRL B-50046 (axmi-049)。這些保藏將根據(jù)國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約的條款進(jìn)行維持。這些保藏僅僅為了本領(lǐng)域技術(shù)人員方便而進(jìn)行，并非承認(rèn)保藏是根據(jù)35U. S. C. § 112所要求的。
“ δ -內(nèi)毒素”意指來自蘇云金芽孢桿菌的毒素，其具有針對一種或多種有害生物的毒性活性，所述有害生物包括但不限于鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)和鞘翅目(Coleoptera)的成員或線蟲動物門(Nematoda)的成員；或者與此類蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)。在一些情況下，已從其他生物體(包括雙酶梭菌(Clostridium bifermentans) 和日本甲蟲類芽孢桿菌(Paenikicillus popilliae))中分離出了 δ-內(nèi)毒素蛋白。δ-內(nèi)毒素蛋白包括從本文公開的全長核苷酸序列中推導(dǎo)出的氨基酸序列，和比全長序列短的氨基酸序列(由于使用了備選的下游起始位點(diǎn)，或由于產(chǎn)生更短的具有殺有害生物活性的蛋白質(zhì)的加工過程)。所述加工可以在其中表達(dá)所述蛋白質(zhì)的生物體中進(jìn)行，或者在攝取所述蛋白質(zhì)后在昆蟲中進(jìn)行。S -內(nèi)毒素包括被鑒定為cryl至cry43、cytl和cyt2的蛋白質(zhì)以及Cyt-樣毒素。目前存在超過250種已知的δ-內(nèi)毒素，它們具有廣泛的特異性和毒性。 關(guān)于龐大的列表，可參見 Crickmore 等人(1998)，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813 ； 和關(guān)于定期的更新，可參見 Crickmore 等人 Q003) 〃 Bacillus thuringiensistoxin nomenclature “，在 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index 處。
本文提供了賦予殺有害生物活性的新型分離的核苷酸序列。還提供了 δ -內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列。由該基因的翻譯而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)允許細(xì)胞防治或殺死攝取了所述細(xì)胞的有害生物。
分離的核酸分子，及其變體和片段
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的或重組的核酸分子，其包含編碼δ-內(nèi)毒素蛋白和多肽或其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列；以及足以用作雜交探針以鑒定編碼S-內(nèi)毒素的核酸的核酸分子。如本文所使用的，術(shù)語“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，重組DNA、 cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及通過使用核苷酸類似物而產(chǎn)生的DNA或 RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。
“分離的”或“純化的”核酸分子或者蛋白質(zhì)或其生物學(xué)活性部分，基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí))，或者基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)制品 (當(dāng)以化學(xué)方法合成時(shí))。優(yōu)選地，“分離的”核酸不含在該核酸所源自的生物體的基因組 DNA中天然地位于該核酸側(cè)翼的序列(S卩，位于該核酸的5'和3'末端處的序列)(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。對本發(fā)明而言，當(dāng)用于指核酸分子時(shí)，“分離的”不包括分離的染色體。例如，在各種實(shí)施方案中，分離的編碼S -內(nèi)毒素的核酸分子可以包含少于約51Λ、41Λ、31Λ、 2kbUkb,0. 5kb或0. Ikb的在該核酸所源自的細(xì)胞的基因組DNA中天然地位于該核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列?；旧喜缓?xì)胞材料的S-內(nèi)毒素蛋白包括具有少于約30%、20%、 10%或5% (干重)的非δ-內(nèi)毒素蛋白(在本文中也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制劑。
編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括SEQ ID NO :1、3、5、34和37中所示的序列，以登記號NRRL B-309;35、B-30936、B-30937和B-50046保藏在細(xì)菌宿主中的δ -內(nèi)毒素核苷酸序列，及其變體、片段和互補(bǔ)物(例如，SEQ ID N0:7、9、ll、14、16、18、20、22、24、 26,28,30和3 ?！盎パa(bǔ)物”意指這樣的核苷酸序列，即其與給定的核苷酸序列充分互補(bǔ)， 如此使得它可以與給定的核苷酸序列雜交從而形成穩(wěn)定的雙鏈體。由該核苷酸序列編碼的 S -內(nèi)毒素蛋白的相應(yīng)氨基酸序列顯示于SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34 和 37 中。
本發(fā)明還包括這樣的核酸分子，其為編碼這些δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列的片段 (例如，SEQ ID N0:9、ll、14、18、20、22和24)?！捌巍币庵妇幋aδ-內(nèi)毒素蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼S-內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性部分，或者它可以是使用下文公開的方法而可以用作雜交探針或PCR引物的片段。作為δ-內(nèi)毒素核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約 50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、 1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、 1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、 2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、3100、3150、3200、3250、3300、 3350個(gè)鄰接核苷酸，或高至在本文公開的全長的編碼δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列中存在的核苷酸的數(shù)目(例如，對于SEQ ID NO :1為3558個(gè)核苷酸，對于SEQ ID NO :3為3984個(gè)核苷酸，對于SEQ ID NO 5為3720個(gè)核苷酸，和對于SEQ ID NO :34為3669個(gè)核苷酸)，這取決于所期望的用途?！班徑印焙塑账嵋庵副舜司o鄰的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段將編碼保留S-內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性并因而保留殺有害生物活性的蛋白質(zhì)片段。 “保留活性”意指該片段將具有δ-內(nèi)毒素蛋白的至少約30%、至少約50%、至少約70%、 80<%、90%、95%或更高的殺有害生物活性。用于測量殺有害生物活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Czapla 和 Lang(1990) J. Econ. Entomo 1. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252:199-206 ；Marrone 等人(1985)J. of Economic Entomology78 290-293 ；和美國專利號5，743，477，所有這些文獻(xiàn)均通過提及而整體合并入本文。
編碼δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列的片段(其編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分) 將編碼至少約 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100 個(gè)鄰接氨基酸，或高至在本發(fā)明的全長S-內(nèi)毒素蛋白中存在的氨基酸的總數(shù)目(例如，對于SEQ ID NO :2為1185個(gè)氨基酸， 對于SEQ ID NO 4為1327個(gè)氨基酸，對于SEQ ID NO 6為1239個(gè)氨基酸，和對于SEQ ID Ν0:35為1223個(gè)氨基酸)。
優(yōu)選的本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素蛋白由與SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、 22、24J6、28、30、32、34或37的核苷酸序列具有足夠同一性的核苷酸序列編碼?！熬哂凶銐蛲恍浴币庵高@樣的氨基酸或核苷酸序列，即通過使用本文描述的比對程序之一并采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)，其與參照序列相比較具有至少約60 %或65 %序列同一性，約70 %或75 %序列同一性，約 80%或 85%序列同一性，約 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%或者更高的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會認(rèn)識到，這些值可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行調(diào)整以通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、讀碼框定位等來確定由2個(gè)核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相應(yīng)同一性。
為了確定2個(gè)氨基酸序列或2個(gè)核酸的同一性百分比，就最佳比較目的來對序列進(jìn)行比對。2個(gè)序列之間的同一性百分比是由所述序列共有的相同位置的數(shù)目的函數(shù)(即， 同一性百分比=相同位置的數(shù)目/位置(例如，重疊位置)的總數(shù)目X100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，2個(gè)序列具有相同的長度。2個(gè)序列之間的同一性百分比可以使用與下文描述的那些類似的技術(shù)來進(jìn)行確定，其中允許或不允許缺口。在計(jì)算同一性百分比中，通常計(jì)數(shù)準(zhǔn)確的匹配。
2個(gè)序列之間的同一性百分比的確定可以使用數(shù)學(xué)算法來完成。用于2個(gè)序列比較的數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Karlin和Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 的算法，其在 Karlin 和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877 中進(jìn)行了修改。將此類算法整合入Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的BLASTN和 BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分=100、字長=12)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的S-內(nèi)毒素樣核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可以用BLASTX 程序(得分=50、字長=3)來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的δ -內(nèi)毒素蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對，可以使用如Altschul等人(1997)NuCleiC Acids Res. 25 :3389 中所描述的 Gapped BLAST (在 BLAST 2. 0 中)。備選地，PSI-Blast 可以用于執(zhí)行檢測分子間的遠(yuǎn)距離關(guān)系的迭代搜索。參見Altschul等人(1997)(同上)。 當(dāng)利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如，BLASTX和 BLASTN)的缺省參數(shù)。還可通過目測檢查而手工地進(jìn)行比對。
用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res. 22 :4673-4680)。ClustalW 比較序列并比對氨基酸或 DNA 序列的整體，因此可以提供關(guān)于整個(gè)氨基酸序列的序列保守性的數(shù)據(jù)。ClustalW算法在幾個(gè)商購可得的DNA/氨基酸分析軟件包中使用，例如Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)的ALIGNX模塊。在用ClustalW比對氨基酸序列后，可以評估氨基酸同一性百分比?？捎糜贑lustalW比對分析的軟件程序的非限制性例子是GeneDoc 。 GeneDoc (KarlNicholas)允許評估多個(gè)蛋白質(zhì)之間的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。 用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)非限制性例子是Myers和Miller (1988) CABI0S4 11-17 的算法。此類算法被整合入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序是GCG Wisconsin GeneticsSof tware Package，Version 10 (可從 Accelrys，Inc.，9685 ScrantonRd.，San Diego，CA，USA獲得)的一部分。當(dāng)利用ALIGN程序來比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120 權(quán)重殘基表、12的缺口長度罰分和4的缺口罰分。
除非另有說明，采用 Needlenan 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48 (3) :443-453 的算法的GAP Version 10將被用于測定序列同一性或相似性，其中使用下述參數(shù)關(guān)于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP權(quán)重和3的長度權(quán)重，以及nwsgapdna. cmp評分矩陣；關(guān)于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用8的GAP權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及 BL0SUM62評分矩陣。還可以使用等價(jià)的程序?！暗葍r(jià)的程序”意指任何這樣的序列比較程序，即對于所研究的任何2個(gè)序列，當(dāng)與由GAP Version 10產(chǎn)生的相應(yīng)比對相比較時(shí)，產(chǎn)生具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的序列同一性百分比的比對。本發(fā)明還包括變體核酸分子(例如，SEQ ID NO :7、9、11、16、18、22、24、26、28、30 和 32)。編碼 δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列的“變體”包括編碼本文公開的S -內(nèi)毒素蛋白但由于遺傳密碼的簡并性而保守性地不同的那些序列，以及如上所述具有足夠同一性的那些序列。天然存在的等位基因變體可以使用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)來鑒定，例如如下所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，其例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生但仍編碼本發(fā)明中公開的S-內(nèi)毒素蛋白，如下所述。本發(fā)明所包括的變體蛋白質(zhì)是在生物學(xué)上有活性的，即它們繼續(xù)具有所需的天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留了殺有害生物活性。 “保留活性”意指該變體將具有至少約30%、至少約50%、至少約70%或至少約80%的天然蛋白質(zhì)的殺有害生物活性。用于測量殺有害生物活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Czapla 禾口 Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人(1985) J. ofEconomic Entomology 78 :290-293 ；和美國專利號5，743，477，所有這些文獻(xiàn)均通過提及而整體合并入本文。
技術(shù)人員將會進(jìn)一步意識到，可以通過突變本發(fā)明的核苷酸序列而引入改變，從而導(dǎo)致編碼的S-內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列中的改變，而不改變該蛋白質(zhì)的生物活性。因此，分離的核酸分子變體可以通過下述方式來制備將一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或刪除引入本文公開的相應(yīng)的核苷酸序列中，從而使得將一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、添加或刪除引入所編碼的蛋白質(zhì)中?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來引入突變，例如通過定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。此類變體核苷酸序列也包括在本發(fā)明內(nèi)。
例如，保守氨基酸置換可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行?！胺潜匦琛卑被釟埢强梢詮腟-內(nèi)毒素蛋白的野生型序列中進(jìn)行改變而不改變生物活性的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的置換。在本領(lǐng)域中已定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如， 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β -分枝的側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
δ -內(nèi)毒素通常具有5個(gè)保守的序列結(jié)構(gòu)域和3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(參見，例如，de Maagd等人Q001)Trends Genetics 17:193-199)。第一個(gè)保守結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域由7個(gè) α螺旋組成，并且參與膜插入和孔形成。結(jié)構(gòu)域II由以希臘鑰匙構(gòu)型進(jìn)行排列的三個(gè)β 折疊片組成，和結(jié)構(gòu)域III由以“果凍卷餅(jelly-roll)”樣式的兩個(gè)反向平行β折疊片組成(de Maagd等人，2001，同上)。結(jié)構(gòu)域II和III參與受體識別和結(jié)合，因而被認(rèn)為是毒素特異性的決定子。
氨基酸置換可以在保留功能的非保守區(qū)域中進(jìn)行。一般而言，此類置換不對保守的氨基酸殘基，或者不對位于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行，其中此類殘基是蛋白質(zhì)活性所需的。保守并且可能對于蛋白質(zhì)活性而言必需的殘基的例子包括，例如在本發(fā)明的氨基酸序列與已知的S-內(nèi)毒素序列的比對中所包含的所有蛋白質(zhì)之間相同的殘基。保守但可能允許保守氨基酸置換并仍保留活性的殘基的例子包括，例如僅在本發(fā)明的氨基酸序列與已知的S-內(nèi)毒素序列的比對中所包含的所有蛋白質(zhì)之間具有保守置換的殘基。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，功能性變體可以具有較少的在保守殘基中的保守或非保守改變。
備選地，可以通過沿著全部或部分編碼序列隨機(jī)引入突變，例如通過飽和誘變，來制備變體核苷酸序列，并且可以就賦予S -內(nèi)毒素活性的能力來篩選所得到的突變體，以鑒定保留活性的突變體。在誘變后，編碼的蛋白質(zhì)可以重組地表達(dá)，并且蛋白質(zhì)的活性可以通過使用標(biāo)準(zhǔn)測定法技術(shù)來測定。
使用諸如PCR、雜交等的方法可以鑒定出相應(yīng)的δ -內(nèi)毒素序列，此類序列與本發(fā)明的序列具有實(shí)質(zhì)的同一性。參見，例如，Sambrook和Russell (2001)Molecular Cloning A Laboratory Manual(ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 禾口 Innis 等人(1990) PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY)。
在雜交方法中，全部或部分δ-內(nèi)毒素核苷酸序列可以用于篩選cDNA或基因組文庫。用于構(gòu)建此類cDNA和基因組文庫的方法是本領(lǐng)域通常已知的，并且在Sambrook和 Russell，2001(同上)中公開。所謂的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可檢測基團(tuán)例如32P或任何其他可檢測標(biāo)記例如其他放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子進(jìn)行標(biāo)記。可以基于本文公開的已知的編碼S-內(nèi)毒素的核苷酸序列，通過對合成的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記來制備用于雜交的探針?？梢粤硗馐褂没谠谒龊塑账嵝蛄谢蚓幋a的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸殘基而設(shè)計(jì)的簡并引物。探針通常包含這樣的核苷酸序列區(qū)域，所述核苷酸序列區(qū)域在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的編碼δ -內(nèi)毒素的核苷酸序列或其片段或變體的至少約12個(gè)，至少約25個(gè)，至少約50、 75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。用于制備用于雜交的探針的方法是本領(lǐng)域通常已知的，并且公開于Sambrook和Russell，2001(同上)中，該文獻(xiàn)通過提及而合并入本文。
例如，本文公開的完整δ -內(nèi)毒素序列，或者其一個(gè)或多個(gè)部分，可以用作能夠與相應(yīng)的δ -內(nèi)毒素樣序列和信使RNAs特異性地雜交的探針。為了達(dá)到在各種條件下的特異性雜交，此類探針包括獨(dú)特的并且長度優(yōu)選為至少約10個(gè)核苷酸或長度為至少約20個(gè)核苷酸的序列。此類探針可以用于通過PCR從所選擇的生物體中擴(kuò)增出相應(yīng)的δ-內(nèi)毒素序列。這種技術(shù)可以用于從所需生物體中分離另外的編碼序列，或用作診斷測定法以測定生物體中編碼序列的存在。雜交技術(shù)包括鋪板的DNA文庫的雜交篩選(噬斑或菌落；參見，例如，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二片反，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)0
此類序列的雜交可以在嚴(yán)格條件下進(jìn)行?！皣?yán)格條件”或“嚴(yán)格雜交條件”意指這樣的條件，即在所述條件下探針將與其靶序列雜交，達(dá)到相比與其他序列來說可檢測地更大的程度(例如，為背景的至少2倍)。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同情況下是不同的。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴(yán)格性，可以鑒定出與探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探測)。備選地，可以調(diào)整嚴(yán)格條件以允許序列中的一些錯配，從而使得檢測出較低程度的相似性(異源探測)。一般地，探針長度為小于約1000個(gè)核苷酸，優(yōu)選地長度小于500個(gè)核苷酸。
通常，嚴(yán)格條件是這樣的條件，其中在pH 7. 0-8. 3下鹽濃度小于約1. 5M Na離子， 通常約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，以及溫度對于短探針(例如，10_50個(gè)核苷酸)為至少約30°C，和對于長探針(例如，超過50個(gè)核苷酸)為至少約60°C。嚴(yán)格條件還可以用添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺來達(dá)到。示例性的低嚴(yán)格性條件包括于37°C用30-35%甲酰胺、 IM NaCl、l% SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩沖溶液進(jìn)行雜交，和于50_55°C在1X-2X SSC(20X SSC = 3. 0MNaCl/0. 3M檸檬酸三鈉)中進(jìn)行洗滌。示例性的中等嚴(yán)格性條件包括于37°C 在40-45%甲酰胺、1.0M NaCl、l%SDS中進(jìn)行雜交，和于55-60°C在0. 5X-1X SSC中進(jìn)行洗滌。示例性的高嚴(yán)格性條件包括于37°C在50%甲酰胺、IM NaClU% SDS中進(jìn)行雜交，和于 60-65°C在0. IX SSC中進(jìn)行洗滌。任選地，洗滌緩沖液可以包含約0. -約SDS0雜交的持續(xù)時(shí)間一般少于約M小時(shí)，通常為約4-約12小時(shí)。
特異性通常是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是離子強(qiáng)度和最終洗滌溶液的溫度。 對于 DNA-DNA 雜交物，Tm 可以從 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 的等式中進(jìn)行估計(jì):Tm = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -0. 61(% form) -500/L ；其中 M是一價(jià)陽離子的摩爾濃度，％ GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form是雜交溶液中甲酰胺的百分比，和L是以堿基對計(jì)的雜交物的長度。Tm是這樣的溫度，在該溫度下50% 的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交(在限定的離子強(qiáng)度和PH下)。對于每的錯配， Tm減少約1°C ；因此，可以調(diào)整1、雜交和/或洗滌條件，以與所需同一性的序列雜交。例如，如果尋求具有彡90%同一性的序列，那么1可以減少10°C。一般地，嚴(yán)格條件被選擇為在限定的離子強(qiáng)度和PH下比關(guān)于特定序列和其互補(bǔ)物的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C。然而， 極端嚴(yán)格條件可以利用在比熱解鏈點(diǎn)(Tm)低1、2、3或4°C下的雜交和/或洗滌；中等嚴(yán)格條件可以利用在比熱解鏈點(diǎn)(Tm)低6、7、8、9或10°C下的雜交和/或洗滌；低嚴(yán)格條件可以利用在比熱解鏈點(diǎn)(Tffl)低11、12、13、14、15或20°C下的雜交和/或洗滌。使用該等式、雜交和洗滌組成以及所需Tm，普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，內(nèi)在地描述了雜交和/或洗滌溶液的嚴(yán)格性中的改變。如果所希望的錯配程度導(dǎo)致低于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液) 的Tm，那么優(yōu)選增加SSC濃度，從而使得可以使用更高的溫度。關(guān)于核酸雜交的詳細(xì)指導(dǎo)可見下述參考文獻(xiàn)Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第 I 部分，第 2 章(Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等人，編輯，(1995) Current Protocols in Molecular Biology，第 2 章 (GreenePub lishing and Wi ley-Inter science, New York)。參見 Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)0
分離的蛋白質(zhì)及其變體和片段
δ -內(nèi)毒素蛋白也包括在本發(fā)明中?！?δ -內(nèi)毒素蛋白”意指具有SEQ ID NO :2、4、 6、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或38中所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。還提供了其片段、生物學(xué)活性部分和變體，并且它們可以用于實(shí)踐本發(fā)明的方法。
“片段”或“生物學(xué)活性部分”包括這樣的多肽片段，所述多肽片段包含與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、16、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 或 38 中所示的氨基酸序列具有足夠同一性的氨基酸序列并且展示出殺有害生物活性(例如，SEQ ID NO :15,19, 21、 23或25)。δ -內(nèi)毒素蛋白的生物學(xué)活性部分可以是例如長度為10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸的多肽。此類生物學(xué)活性部分可以通過重組技術(shù)來制備，并且就殺有害生物活性來進(jìn)行評估。用于測量殺有害生物活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Czapla禾口 Lang(1990)J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 199-206 ；Marrone 等人(1985) J. of EconomicEntomology 78 :290-293 ；和美國專利號 5，743，477，所有這些文獻(xiàn)均通過提及而整體合并入本文。如本文所使用的，片段包含SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、；35 或 38 的至少 8個(gè)鄰接氨基酸。 然而，本發(fā)明包括其他片段，例如該蛋白質(zhì)中超過約10、20、30、50、100、150、200、250、300、 350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、 1200、1250或1300個(gè)氨基酸的任何片段。
“變體”意指這樣的蛋白質(zhì)或多肽，其具有與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、16、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、；35 或 38 的氨基酸序列至少約 60%、65%，約 70%、75%，約 80%、85%，約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO :10、12、17、19、23、25、27、29、31或33)。變體還包括由這樣的核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、 22、24J6、28、30、32、34或37的核酸分子或其互補(bǔ)物雜交。變體包括由于誘變而在氨基酸序列方面不同的多肽。本發(fā)明所包括的變體蛋白質(zhì)是生物學(xué)上有活性的，即它們繼續(xù)擁有所希望的該天然蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，即保留了殺有害生物活性。用于測量殺有害生物活性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomo 1. 83 2480-2485 ；Andrews ^ 人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone ^ 人(1985)J. of EconomicEntomology 78 :290-293 ；和美國專利號5，743，477，所有這些文獻(xiàn)均通過提及而整體合并入本文。
細(xì)菌基因，例如本發(fā)明的axmi-031、axmi-039、axmi-040和axmi-049基因，在開放讀碼框的起始附近十分經(jīng)常具有多個(gè)甲硫氨酸起始密碼子。通常，在這些起始密碼子中的一個(gè)或多個(gè)處的翻譯起始將導(dǎo)致功能蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。然而，諸如芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.)的細(xì)菌還將密碼子GTG識別為起始密碼子， 并且在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質(zhì)在第一個(gè)氨基酸處包含甲硫氨酸。此外，常常事先不確定這些密碼子中的哪一些天然地在細(xì)菌中使用。因此，應(yīng)當(dāng)理解，備選的甲硫氨酸密碼子之一的使用也可能導(dǎo)致產(chǎn)生編碼殺有害生物活性的S-內(nèi)毒素蛋白。這些δ-內(nèi)毒素蛋白包括在本發(fā)明中，并且可以在本發(fā)明的方法中使用。
還包括了針對本發(fā)明的多肽或者其變體或片段的抗體。用于產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如 Harlow 禾口 Lane (1988) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.；美國專利號 4，196，265)。
改變或改善的變體
應(yīng)認(rèn)識到，可以通過各種方法來改變改變δ-內(nèi)毒素的DNA序列，并且這些改變可以導(dǎo)致編碼這樣的蛋白質(zhì)的DNA序列，所述蛋白質(zhì)具有與由本發(fā)明的δ -內(nèi)毒素所編碼的氨基酸序列不同的氨基酸序列。這種蛋白質(zhì)可以以各種方式進(jìn)行改變，包括SEQ ID NO 2, 4、6、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35 或 38 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸置換、刪除、截短和插入，包括高至約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、 約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、 約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130個(gè)或更多氨基酸置換、刪除或插入。
用于此類操作的方法是本領(lǐng)域通常已知的。例如，可以通過DNA中的突變來制備S-內(nèi)毒素蛋白的氨基酸序列變體。這還可以通過幾種誘變形式之一和/或在定向進(jìn)化中來完成。在某些方面，氨基酸序列中所編碼的改變將基本上不影響蛋白質(zhì)的功能。此類變體將具有所希望的殺有害生物活性。然而，應(yīng)當(dāng)理解，S-內(nèi)毒素賦予殺有害生物活性的能力可以通過對于本發(fā)明的組合物使用此類技術(shù)來進(jìn)行改善。例如，可以在這樣的宿主細(xì)胞中表達(dá)S-內(nèi)毒素，所述宿主細(xì)胞顯示出高比率的在DNA復(fù)制期間的堿基錯摻入，例如 XL-lRedGtratagene)。在此類菌株中進(jìn)行繁殖后，可以分離出δ -內(nèi)毒素DNA(例如通過制備質(zhì)粒DNA，或者通過經(jīng)由PCR進(jìn)行擴(kuò)增并將所得到的PCR片段克隆到載體中)，在非誘變菌株中培養(yǎng)S-內(nèi)毒素突變，并鑒定具有殺有害生物活性的經(jīng)突變的δ-內(nèi)毒素基因，例如通過進(jìn)行用于測試殺有害生物活性的測定法。通常，在飼喂測定法中混入和使用所述蛋白質(zhì)。參見,例如，Marrone 等人(198 J. of Economic Entomology 78:290-293。此類測定法可包括使植物與一種或多種有害生物接觸，并測定植物存活和/或引起有害生物死亡的能力。導(dǎo)致毒性增加的突變的實(shí)例可在khn印f等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 775-806中找到。
備選地，可以在氨基或羧基末端處對許多蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行改變而基本上不影響活性。這可以包括通過現(xiàn)代分子方法例如PCR而引入的插入、刪除或改變，所述方法包括借助于在PCR擴(kuò)增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長蛋白質(zhì)編碼序列的PCR擴(kuò)增。備選地，所添加的蛋白質(zhì)序列可以包括完整的蛋白質(zhì)編碼序列，例如本領(lǐng)域通常用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)融合物的那些序列。此類融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白質(zhì)的表達(dá)；(2)引入結(jié)合結(jié)構(gòu)域、酶活性或表位以有助于蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)檢測或本領(lǐng)域已知的其他實(shí)驗(yàn)用途；或(3)將蛋白質(zhì)的分泌或翻譯靶向至亞細(xì)胞器，例如革蘭氏陰性菌的壁膜間隙，或真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，后者常常導(dǎo)致蛋白質(zhì)的糖基化。
本發(fā)明的變體核苷酸和氨基酸序列還包括衍生自誘變和重組操作程序例如DNA 改組的序列。使用此類操作程序，可以將一個(gè)或多個(gè)不同的S-內(nèi)毒素蛋白編碼區(qū)用于制備具有所需性質(zhì)的新的S-內(nèi)毒素蛋白。以這種方式，從包含這樣的序列區(qū)域的相關(guān)序列多核苷酸群體中產(chǎn)生重組多核苷酸的文庫，所述序列區(qū)域具有充分的序列同一性并可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行同源重組。例如，使用這種方法，可以在本發(fā)明的S-內(nèi)毒素基因和其他已知的S -內(nèi)毒素基因之間改組編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序，以獲得編碼具有改善的目的性質(zhì)例如增加的殺昆蟲活性的蛋白質(zhì)的新基因。用于此類DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Stemmer (1994)Proc. Natl. Acad. ki. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370 :389-391 ；Crameri 等人(1997) Nature Biotech. 15 :436-438 ； Moore 等人(1997) J. Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等人(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :4504-4509 ；Crameri 等人(1998)Nature 391 :288-291 ；以及美國專利號 5，605，793 和 5，837，458。
結(jié)構(gòu)域交換或改組是用于產(chǎn)生改變的δ-內(nèi)毒素蛋白的另一種機(jī)制?？稍?δ -內(nèi)毒素蛋白之間交換結(jié)構(gòu)域II和III，從而導(dǎo)致具有改進(jìn)的殺有害生物活性或靶標(biāo)譜(target spectrum)的雜合或嵌合毒素。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)和就殺有害生物活性來對它們進(jìn)行測試的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見，例如，Naimov等人Q001)Appl. Environ. Microbiol. 67 :5328-5330 ；de Maagd 等人(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 1537-1543 ；Ge 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 :17954-17958 ；Schn印f 等人(1990) J. Biol.Chem. 265 :20923-20930 ；Rang 等人(1999) Appl. En viron. Microbiol. 65 :2918-2925)。
載體
本發(fā)明的δ-內(nèi)毒素序列可以在用于在目的植物中表達(dá)的表達(dá)盒中提供。“植物表達(dá)盒”意指能夠?qū)е略谥参锛?xì)胞中從開放讀碼框表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體。通常，這些構(gòu)建體包含啟動子和編碼序列。通常，此類構(gòu)建體還將包含3'非翻譯區(qū)。此類構(gòu)建體可以包含“信號序列”或“前導(dǎo)序列”(即，SEQ ID N0:9、11J8、30和32)，以有助于所述肽的共翻譯或翻譯后運(yùn)輸至某些細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，例如葉綠體(或其他質(zhì)體)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體。
“信號序列”意指已知或懷疑導(dǎo)致穿過細(xì)胞膜的共翻譯或翻譯后肽運(yùn)輸?shù)男蛄?。在真核生物中，這通常涉及分泌到高爾基體內(nèi)，其中具有某些發(fā)生的糖基化?！扒皩?dǎo)序列”意指當(dāng)被翻譯時(shí)導(dǎo)致足以引發(fā)肽鏈共翻譯運(yùn)輸至亞細(xì)胞器的氨基酸序列(即，SEQ ID NO 10, 12、29、31和33)的任何序列。因此，這包括通過進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，進(jìn)入液泡、質(zhì)體(包括葉綠體、線粒體)等中來對運(yùn)輸和/或糖基化實(shí)施靶向的前導(dǎo)序列。
“植物轉(zhuǎn)化載體”意指對于植物細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)化來說所必需的DNA分子。此類分子可以由一個(gè)或多個(gè)植物表達(dá)盒組成，或可以組織入超過一個(gè)的“載體”DNA分子中。例如，二元載體是植物轉(zhuǎn)化載體，其利用2個(gè)非鄰接DNA載體來編碼用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的所有必需的順式和反式作用功能(Hellens 和 MullineauxQOOO)Trends in PlantScience 5 446-451)。“載體”指設(shè)計(jì)用于在不同宿主細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體?！氨磉_(dá)載體” 指具有將異源DNA序列或片段引入、整合入外源細(xì)胞中并在其中表達(dá)該異源DNA序列或片段的能力的載體。所述表達(dá)盒將包含與本發(fā)明的序列可操作地連接的5'和3'調(diào)節(jié)序列。 “可操作地連接”意指啟動子和第二序列之間的功能連接，其中啟動子序列起始并介導(dǎo)相應(yīng)于第二序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。一般地，可操作地連接意指，被連接的核酸序列是鄰接的， 并且在必需使2個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)聯(lián)合在一起時(shí)是鄰接的并在同一讀碼框中。所述盒可以另外還包含至少一種待共轉(zhuǎn)化到生物體中的另外的基因。備選地，所述另外的基因可以在多個(gè)表達(dá)盒上提供。
“啟動子”是指發(fā)揮功能以指導(dǎo)下游編碼序列轉(zhuǎn)錄的核酸序列。啟動子連同其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)核酸序列(也稱為“控制序列”)一起是目的DNA序列表達(dá)所必需的。
給此類表達(dá)盒提供多個(gè)限制位點(diǎn)，所述限制位點(diǎn)用于插入δ-內(nèi)毒素序列以處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。
所述表達(dá)盒以5' -3'的轉(zhuǎn)錄方向包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即，啟動子)，本發(fā)明的DNA序列，和在植物中具有功能的翻譯和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(即，終止區(qū))。啟動子對于植物宿主和/或本發(fā)明的DNA序列來說可以是天然的或類似的，或者外源的或異源的。此外，啟動子可以是天然序列或者備選地是合成序列。當(dāng)啟動子對于植物宿主是“天然的”或“同源的”時(shí)，意指所述啟動子在該啟動子所引入的天然植物內(nèi)存在。當(dāng)啟動子對于本發(fā)明的DNA 序列是“外源的”或“異源的”時(shí)，意指所述啟動子對于可操作地連接的本發(fā)明DNA序列來說不是天然的或天然存在的啟動子。
終止區(qū)可以對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)來說是天然的，可以對于可操作地連接的目的DNA序列來說是天然的，可以對于植物宿主來說是天然的，或可以衍生自另一種來源(即，對于啟動子、目的DNA序列、植物宿主或其任何組合來說是外源的或異源的)。方便的終止區(qū)可從根瘤土壤桿菌的Ti質(zhì)粒中獲得，例如章魚堿合酶和胭脂堿合酶的終止區(qū)。還可參見Guerineau 等人(1991)Mol. Gen. Genet. 262 :141-144 ；Proudfoot (1991) Cell 64 :671-674 ； Sanfacon等人(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ；Mogen等人(1990)Plant Cell 2 :1261-1272 ； Munroe 等人(1990)Gene 91 :151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic AcidsRes. 17 7891-7903 ；和 Joshi 等人(1987) Nucleic Acid Res. 15 :9627-9639。
在適當(dāng)時(shí)，可以就在轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中的表達(dá)增加來優(yōu)化所述基因。即，可以使用宿主細(xì)胞偏愛的密碼子來合成所述序列以獲得改善的表達(dá)，或者可以通過以宿主偏愛的密碼子使用頻率使用密碼子來合成所述基因。一般地，將增加所述基因的GC含量。關(guān)于宿主偏愛的密碼子使用的討論，可參見例如Campbell和Gowri (1990)PlantPhysiol. 92 =I-Il0 用于合成植物偏愛的基因的方法是本領(lǐng)域中可得的。參見，例如，美國專利號5，380，831和 5，436，391，以及 Murray 等人(1989) Nucleic Acids Res. 17 :477_498，通過提及而合并入本文。
在一個(gè)實(shí)施方案中，δ -內(nèi)毒素被靶向葉綠體以進(jìn)行表達(dá)。以這種方式，當(dāng)δ -內(nèi)毒素不直接插入葉綠體內(nèi)時(shí)，表達(dá)盒將另外包含編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸以將S -內(nèi)毒素導(dǎo)向葉綠體。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol. Biol. Rep. 9 :104-126 ；Clark 等人(1989)J. Biol. Chem. 264 :17544-17550 ；Della-Cioppa 等人(1987) Plant Physiol. 84 :965-968 ;Romer 等人(199 Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 ；和 Shah 等人(1986) Science 233 :478-481。
可以就在葉綠體中的表達(dá)來優(yōu)化被靶向葉綠體的δ -內(nèi)毒素基因，以解決植物細(xì)胞核和這種細(xì)胞器之間的在密碼子使用方面的差異。以這種方式，可以使用葉綠體偏愛的密碼子來合成目的核酸。參見，例如，美國專利號5，380，831，通過提及而合并入本文。
植物轉(zhuǎn)化
本發(fā)明的方法涉及將核苷酸構(gòu)建體引入植物內(nèi)?！耙搿币庵敢允沟迷摌?gòu)建體進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)部的方式將核苷酸構(gòu)建體呈遞給植物。本發(fā)明的方法不要求使用用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物的具體方法，只要求使該核苷酸構(gòu)建體進(jìn)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。 用于將核苷酸構(gòu)建體引入植物內(nèi)的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法和病毒介導(dǎo)的方法。
“植物”意指整個(gè)植株、植物器官(例如，葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚胎及其后代。植物細(xì)胞可以是分化的或未分化的(例如，愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉細(xì)胞、根細(xì)胞、韌皮部細(xì)胞、花粉)。
“轉(zhuǎn)基因植物”或“轉(zhuǎn)化的植物”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”植物或細(xì)胞或組織是指已將外源核酸序列或DNA片段引入或整合到植物細(xì)胞內(nèi)的植物。這些核酸序列包括外源的或不存在于未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的那些序列，以及可以是內(nèi)源的或存在于未轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的那些序列?！爱愒吹摹币话阒高@樣的核酸序列，所述核酸序列對于它們所存在于其中的細(xì)胞來說不是內(nèi)源的或者不是天然基因組的一部分，并且已通過感染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、電穿孔、微粒轟擊等加入細(xì)胞中。
可通過本領(lǐng)域已知的幾種技術(shù)中的一種來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞?？梢孕揎棻景l(fā)明的 S-內(nèi)毒素基因以獲得或增強(qiáng)在植物細(xì)胞中的表達(dá)。通常，表達(dá)此類蛋白質(zhì)的構(gòu)建體將包含啟動子以驅(qū)動所述基因的轉(zhuǎn)錄，以及包含3'非翻譯區(qū)以允許轉(zhuǎn)錄終止和多腺苷酸化。此類構(gòu)建體的組織在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在一些情況下，其可用于對所述基因進(jìn)行改造，
15從而所得的肽被分泌或者在植物細(xì)胞內(nèi)被靶向。例如，基因可以經(jīng)改造以包含信號肽從而有助于將肽轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。還可以優(yōu)選改造植物表達(dá)盒以包含內(nèi)含子，從而使得內(nèi)含子的 mRNA加工是表達(dá)所需的。
通常，這種“植物表達(dá)盒”將被插入“植物轉(zhuǎn)化載體”中。這種植物轉(zhuǎn)化載體可以由對于實(shí)現(xiàn)植物轉(zhuǎn)化所需的一個(gè)或多個(gè)DNA載體構(gòu)成。例如，利用由超過一種鄰接DNA區(qū)段構(gòu)成的植物轉(zhuǎn)化載體是本領(lǐng)域中常見的實(shí)踐。這些載體在本領(lǐng)域中通常稱為“二元載體”。 二元載體以及具有輔助質(zhì)粒的載體最常用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中對于實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)化所需的DNA區(qū)段的大小和復(fù)雜性相當(dāng)大，并且將功能分散到分開的DNA分子上是有利的。 二元載體通常包括質(zhì)粒載體，所述質(zhì)粒載體包含對于T-DNA轉(zhuǎn)移所需的順式作用序列(例如左邊界和右邊界)、經(jīng)改造從而能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)的選擇標(biāo)記、和“目的基因”(經(jīng)改造從而能夠在對于其希望產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞中表達(dá)的基因)。在這種質(zhì)粒載體上還存在有細(xì)菌復(fù)制所需的序列。順式作用序列以允許有效轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)并在其中表達(dá)的方式排列。例如，選擇標(biāo)記基因和S-內(nèi)毒素位于左和右邊界之間。通常，第二質(zhì)粒載體包含介導(dǎo)T-DNA從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的反式作用因子。這種質(zhì)粒通常包含毒力功能 (Vir基因)，其允許用土壤桿菌感染植物細(xì)胞，并通過在邊界序列處進(jìn)行切割和vir介導(dǎo)的 DNA轉(zhuǎn)移來轉(zhuǎn)移 DNA，如本領(lǐng)域中所了解的(Hellens 和MullineauxQOOO) Trends in Plant Science, 5 :446-4δ1)。幾類土壤桿菌屬菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105 等) 可以用于植物轉(zhuǎn)化。第二質(zhì)粒載體不是通過其他方法例如微粒轟擊、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等轉(zhuǎn)化植物所必需的。
一般而言，植物轉(zhuǎn)化法涉及將異源DNA轉(zhuǎn)移到靶植物細(xì)胞(例如，未成熟或成熟的胚胎、懸浮培養(yǎng)物、未分化的愈傷組織、原生質(zhì)體等)中，隨后應(yīng)用最大閾值水平的合適選擇(取決于選擇標(biāo)記基因)，以從未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群體中回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。通常將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。隨后，在置于補(bǔ)充有最大閾值水平的選擇試劑的再生培養(yǎng)基上后，使經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分化成幼芽。然后將幼芽轉(zhuǎn)移至選擇性生根培養(yǎng)基中以用于回收生根的幼芽或小植物。然后，轉(zhuǎn)基因小植物生長為成熟植物并產(chǎn)生能育的種子(例如，Hiei 等人(1994) The Plant Journal 6 :271-282 ；Ishida 等人(1996) Nature Biotechnology 14 :745-750)。通常將外植體轉(zhuǎn)移到新鮮供應(yīng)的相同培養(yǎng)基中并進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)和方法的概括性描述可以在Ayres和Park(1994) Critical Reviews inPlant Science 13:219—239 以及 Bommineni 禾口 Jauhar(1997) Maydica42 :107-120中找到。因?yàn)榻?jīng)轉(zhuǎn)化的材料包含許多細(xì)胞；所以經(jīng)轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞存在于受試靶愈傷組織或組織或細(xì)胞群的任何部分中。殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞并允許經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞增殖的能力導(dǎo)致產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物培養(yǎng)物。通常，去除未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力是快速回收經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和成功產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的限制條件。
轉(zhuǎn)化方案以及用于將核苷酸序列引入植物的方案可依據(jù)作為轉(zhuǎn)化的靶標(biāo)的植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉或雙子葉)而變化。轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生可以通過幾種方法之一來進(jìn)行，包括但不限于，顯微注射，電穿孔，直接的DNA轉(zhuǎn)移，通過土壤桿菌將異源 DNA引入植物細(xì)胞內(nèi)(土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)，用與粒子附著的異源外源DNA轟擊植物細(xì)胞，射彈粒子力口速(ballistic particle acceleration),氣溶膠束轉(zhuǎn)化(aerosol beam transformation)(美國公開申請?zhí)?0010026941 ；美國專利號4，945，050 ；國際公開號WO91/00915 ；美國公開申請?zhí)?002015066)，Lecl轉(zhuǎn)化，和用于轉(zhuǎn)移DNA的各種其他非粒子直接介導(dǎo)的方法。
用于轉(zhuǎn)化葉綠體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Svab等人(1990) Natl. Acad. Sci. USA 87 :8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 913-917 ；Svab和Maliga (1993) EMBO J. 12 :601_606。該方法依賴于包含選擇標(biāo)記的DNA的基因槍遞送并通過同源重組將該DNA靶向質(zhì)體基因組。此外，質(zhì)體轉(zhuǎn)化可以通過核編碼且質(zhì)體指導(dǎo)的RNA聚合酶的組織偏愛的表達(dá)，經(jīng)由沉默的質(zhì)體攜帶的轉(zhuǎn)基因的反式激活來完成。此類系統(tǒng)已在 McBride 等人(1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :7301-7305 中得到報(bào)道。
在將異源外源DNA整合入植物細(xì)胞中后，然后在培養(yǎng)基中應(yīng)用最大閾值水平的合適選擇以殺死未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并通過定期轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基來分離和增殖從該選擇處理中存活的假定經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。通過連續(xù)傳代和使用合適的選擇進(jìn)行攻擊，可鑒定和增殖用所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然后，分子和生物化學(xué)法可以用于證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物的基因組中存在整合的異源目的基因。
已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以依照常規(guī)方法生長為植物。參見，例如，McCormick等人(1986) Plant Cell Reports 5 :81_84。然后，可以讓這些植物進(jìn)行生長，并用相同的轉(zhuǎn)化株或不同株進(jìn)行授粉，并且鑒定出具有所需表型特征的組成型表達(dá)的所得到的雜種?？梢陨L兩代或更多代以確保所需表型特征的表達(dá)被穩(wěn)定地維持和遺傳，并隨后收獲種子以確保已獲得了所需表型特征的表達(dá)。以這種方式，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的種子(也稱為“轉(zhuǎn)基因種子”)，其具有本發(fā)明的核苷酸構(gòu)建體，例如穩(wěn)定地整合入其基因組內(nèi)的本發(fā)明的表達(dá)盒。
植物轉(zhuǎn)化的評估
在將異源外源DNA弓丨入植物細(xì)胞內(nèi)后，通過各種方法來證實(shí)異源基因已轉(zhuǎn)化或整合入植物基因組中，所述方法例如為分析與整合的基因相關(guān)的核酸、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物。
PCR分析是在移植到土壤中之前的較早階段時(shí)就整合的基因的存在來篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或幼芽的快速方法(Sambrook和Russell (2001)Molecular Cloning =A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。 PCR使用對目的基因或土壤桿菌載體背景等特異的寡核苷酸引物來進(jìn)行。
可以通過基因組DNA的Southern印跡分析來證實(shí)植物轉(zhuǎn)化(Sambrook和 Russell, 2001,同上)。一般而言，從轉(zhuǎn)化體中提取總DNA，用合適的限制酶消化，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分級，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素或尼龍膜上。隨后，用例如放射標(biāo)記的32P靶DNA片段來探測膜或“印跡”，以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Sambrook和Russell，2001，同上)來證實(shí)引入的基因整合到植物基因組中。
在Northern印跡分析中，從轉(zhuǎn)化體的特定組織中分離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分級，并根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)操作程序印跡到尼龍濾紙上(Sambrook和 RUSSell，2001，同上)。隨后，通過采用本領(lǐng)域已知的方法將濾紙與衍生自δ-內(nèi)毒素的放射性探針雜交來測試由S -內(nèi)毒素編碼的RNA的表達(dá)(Sambrook和Russell，2001，同上)。
可以對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行Western印跡法、生物化學(xué)測定法等，以通過標(biāo)準(zhǔn)操作程序來確證由S-內(nèi)毒素基因編碼的蛋白質(zhì)的存在(Sambrook和Russell，2001，同上)，其中使用與S-內(nèi)毒素蛋白上存在的一種或多種表位結(jié)合的抗體。[0082]棺物中的殺有害牛物活件
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，可產(chǎn)生表達(dá)具有殺有害生物活性的δ -內(nèi)毒素的轉(zhuǎn)基因植物。如上作為實(shí)例而描述的方法可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，但產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方式對于本發(fā)明而言不是至關(guān)重要的?？梢罁?jù)實(shí)驗(yàn)者的判斷，使用在本領(lǐng)域中已知或描述的方法，例如土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化和非粒子介導(dǎo)的方法?？赏ㄟ^在本領(lǐng)域中描述的普遍方法來分離表達(dá)δ -內(nèi)毒素的植物，例如通過愈傷組織的轉(zhuǎn)化，選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的愈傷組織， 并從此類轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生出能育的植物。在這樣的方法中，可使用任何基因作為選擇標(biāo)記，只要其在植物細(xì)胞中的表達(dá)賦予鑒定或選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的能力。
已開發(fā)了許多用于植物細(xì)胞的標(biāo)記，例如對于氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。編碼參與葉綠體代謝的產(chǎn)物的其他基因也可用作選擇標(biāo)記。例如，提供對于植物除草劑例如草甘磷、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可以是特別有用的。已報(bào)導(dǎo)了此類基因(Stalker等人(1985) J. Biol. Chem. 263 :6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和 Sathasivan 等人(1990) Nucl. Acids Res. 18 :2188 (AHAS 咪唑啉酮抗性基因))。另夕卜，本文公開的基因可用作標(biāo)記來評估細(xì)菌或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于檢測植物、植物器官(例如， 葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞、繁殖體、胚胎或其后代中轉(zhuǎn)基因的存在的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過就殺有害生物活性進(jìn)行測試來檢測轉(zhuǎn)基因的存在。
可就殺有害生物活性來對表達(dá)δ -內(nèi)毒素的能育的植物進(jìn)行測試，并選擇顯示出最佳活性的植物以用于進(jìn)一步的育種。在本領(lǐng)域中可獲得用于檢驗(yàn)有害生物活性的方法。通常，在飼喂測定法中混入和使用所述蛋白質(zhì)。參見，例如，Marrone等人(198 J. of EconomicEntomology 78 :290_293。
本發(fā)明可以用于轉(zhuǎn)化任何植物種類，包括但不限于，單子葉植物和雙子葉植物。 目的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油籽油菜、蕓苔屬物種 (Brassicasp.)、苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑橘類樹、可可、 茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅(jiān)果、杏樹、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。
蔬菜包括但不限于，番茄、萵苣、青豆、利馬豆、豌豆，以及甜瓜屬(Cucumis)的成員，例如黃瓜、羅馬甜瓜和香瓜。觀賞植物包括但不限于，杜鵑花、繡球、木槿、玫瑰花、郁金香、水仙花、矮牽牛、康乃馨、一品紅和菊花。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物是農(nóng)作物植物(例如，玉蜀黍、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒屬植物、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、 甘蔗、煙草、大麥、油籽油菜等)。
在有害生物防治中的用途
用于在有害生物防治中或在改造其他生物體中使用包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的株系作為殺有害生物劑的一般方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如，美國專利號 5，039，523 和 EP 0480762A2。
包含本發(fā)明的核苷酸序列或其變體的芽孢桿菌菌株或者已被遺傳改變而包含殺有害生物基因和蛋白質(zhì)的微生物可用于保護(hù)農(nóng)作物和產(chǎn)品免受有害生物侵害。在本發(fā)明的一個(gè)方面，用這樣的試劑來處理產(chǎn)生毒素(殺有害生物劑)的生物體的完整的(即未裂解的)細(xì)胞，所述試劑在將所述細(xì)胞施用于靶有害生物的環(huán)境時(shí)延長在所述細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性。
備選地，通過向細(xì)胞宿主中引入δ -內(nèi)毒素基因來產(chǎn)生殺有害生物劑。δ -內(nèi)毒素基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致殺有害生物劑的細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。在本發(fā)明的一個(gè)方面， 然后在當(dāng)將所述細(xì)胞施用于靶有害生物的環(huán)境時(shí)延長在所述細(xì)胞中產(chǎn)生的毒素的活性的條件下處理這些細(xì)胞。所得的產(chǎn)物保持所述毒素的毒性。然后可按照常規(guī)技術(shù)來配制這些天然膠囊化的殺有害生物劑，以施用于棲宿有靶有害生物的環(huán)境例如土壤、水和植物的葉。 參見，例如EPA 0192319，以及其中所引用的文獻(xiàn)。備選地，可配制表達(dá)本發(fā)明的基因的細(xì)胞，以例如允許作為殺有害生物劑來施用所得的材料。
線蟲防治
植物寄生性線蟲，包括胞囊線蟲(cyst nematodes)、根結(jié)線蟲(root knot nematodes)和其他線蟲，每年對農(nóng)作物造成數(shù)十億美元的損害。植物寄生性線蟲用它們的口針(stylet)(由嘴和食道部分中的一些部分形成)刺穿植物細(xì)胞壁，并將植物細(xì)胞汁液抽吸入它們的消化系統(tǒng)中。本領(lǐng)域中的許多出版物得出結(jié)論定居型(sedentary) 植物寄生性線蟲在體內(nèi)不攝取大于約23j8kDa的分子。這已導(dǎo)致普遍的信念由這些線蟲產(chǎn)生的攝食管用作分子篩，從而限制了可被攝取的分子的大小。Biickenhoff和 Grundler((1994)Parasitologyl09 =249-254)將經(jīng)熒光標(biāo)記的葡聚糖注射入被甜菜異皮線蟲(Heterodera schachtii)攝食的合胞體。他們發(fā)現(xiàn)，線蟲攝取22kDa的葡聚糖，但不攝取40kDa的葡聚糖。Urwin等人((1998)Planta204 :472-479)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的23kDa融合蛋白不能被甜菜異皮線蟲攝取，盡管約IlkDa的蛋白質(zhì)可被攝取。類似地，Unwin 等人((I997)Molecular Plant-Microbe Interactions 10 :394-400)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)的^kDa綠色熒光蛋白(GFP)不能被甜菜異皮線蟲攝取。因此，先前沒有認(rèn)識到或沒有證明，可通過在植物中表達(dá)大于22kDa的蛋白質(zhì)來防治線蟲，因?yàn)閾?jù)了解線蟲不攝取這樣的蛋白。
本文提供了用于在植物中賦予對于線蟲的抗性的方法和組合物。所述方法包括將至少一個(gè)編碼線蟲活性多肽的核苷酸序列引入植物中，和在包含線蟲的田地中使所述植物生長?！熬€蟲活性多肽(nematode-active polypeptide) ”意指，當(dāng)被線蟲攝取時(shí)導(dǎo)致至少一個(gè)線蟲死亡或者生長或增殖受到阻礙的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，線蟲活性多肽具有大于約 22kDa，約 23kDa，約 24、約 25、約 26、約 27、約 28、約 29、約 30、約 31、約 32、約 33、約 34、 約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、 約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、 約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、 約77、約78、約79、約80kDa或更大的分子量。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，線蟲活性多肽具有針對植物寄生性線蟲的活性。線蟲活性多肽在植物中的表達(dá)降低了線蟲侵染植物的根或攝食植物的根的能力。對本發(fā)明的組合物敏感的植物寄生性線蟲的實(shí)例包括根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲屬物種(Meloidogyne sp·))、矮化線蟲(矮化線蟲屬物種(Tylenchorhynchus sp.))、矛形線蟲(紐帶線蟲屬物種(Hoplolaimus sp·))、螺旋線蟲(螺旋線蟲屬物種(Helicotylenchus sp·))、根腐線蟲(lesion nematode)(短體線蟲屬物種(Pratylenchus sp.))、胞囊線蟲(異皮線蟲屬物種(Heterodera sp.)和球異皮線蟲屬物種(Globodera sp.))和環(huán)線蟲(環(huán)線蟲屬物種(Criconema sp.))0
殺有害牛物組合物
本發(fā)明的活性成分通常以組合物的形式進(jìn)行施用，并且可以同時(shí)或相繼地與其他化合物一起施用于待處理的作物區(qū)域或植物。這些化合物可以是肥料、除草劑、冷凍保護(hù)劑(cryoprotectants)、表面活性劑、去污劑、殺有害生物肥皂(pesticidal soaps)、休眠噴灑油(dormant oils)、聚合物和/或定時(shí)釋放或生物可降解載體制劑(其允許在單次施用所述制劑后對靶區(qū)域進(jìn)行長期給藥)。它們還可以是選擇性除草劑、化學(xué)殺昆蟲劑、殺病毒齊U、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺害蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或幾種這些制劑的混合物，如果想要，與其他農(nóng)業(yè)上可接受的載體、表面活性劑或促進(jìn)施用的助劑(在制劑領(lǐng)域中通常使用的)一起。合適的載體和助劑可以是固體或液體，并且相應(yīng)于配制技術(shù)中常常使用的物質(zhì)，例如天然或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、濕潤劑、增粘劑、粘合劑或肥料。同樣地，可將所述制劑制備成可食用的“誘餌”或塑造成有害生物“陷阱”以允許靶有害生物攝食或攝取所述殺有害生物制劑。
用于施用本發(fā)明活性成分或包含至少一種由本發(fā)明的細(xì)菌菌株產(chǎn)生的殺有害生物蛋白質(zhì)的本發(fā)明農(nóng)業(yè)化學(xué)組合物的方法包括葉面施用、種子包衣和土壤施用。施用次數(shù)和施用率(rate of application)取決于受相應(yīng)有害生物侵染的強(qiáng)度。
可以將組合物配制成粉劑、粉塵劑(dust)、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、乳液、膠體、溶液等，并且可以通過常規(guī)方法，例如包含所述多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物的脫水(desiccation)、凍干、 勻漿、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮來制備所述組合物。在包含至少一種此類殺有害生物多肽的所有此類組合物中，所述多肽可以以約1重量％至約99重量％的濃度存在。
可通過本發(fā)明的方法在給定區(qū)域內(nèi)殺死鱗翅類、鞘翅類或線蟲有害生物或減少其數(shù)目，或者可將本發(fā)明的方法預(yù)防性地應(yīng)用于環(huán)境區(qū)域以防止被可能的有害生物侵染。優(yōu)選地，有害生物攝取殺有害生物有效量的多肽或與殺有害生物有效量的多肽接觸。“殺有害生物有效量(pesticidally-effective amount) ”意指這樣的殺有害生物劑的量，所述量能夠引起至少一個(gè)有害生物死亡，或者明顯減少有害生物生長、取食或正常的生理發(fā)育。該量將隨下列因素而變化例如，待防治的特定的靶有害生物，待處理的特定的環(huán)境、地點(diǎn)、植物、作物或農(nóng)業(yè)場所，環(huán)境條件，以及施用在殺有害生物上有效的多肽組合物的方法、比率 (rate)、濃度、穩(wěn)定性和數(shù)量。所述制劑還可以隨氣候條件、環(huán)境考慮和/或施用頻率和/ 或有害生物侵染的嚴(yán)重度而變化。
可通過將細(xì)菌細(xì)胞、晶體和/或芽孢懸浮液或者分離的蛋白質(zhì)組分與所希望的農(nóng)業(yè)上可接受的載體配制在一起來制備所描述的殺有害生物劑組合物。在施用前，可以以合適的方法例如凍干、冷凍干燥、脫水，或者在水性載體、介質(zhì)或合適稀釋劑例如鹽水或其他緩沖液中配制所述組合物。經(jīng)配制的組合物可以為粉塵劑或顆粒材料的形式，或者在油 (植物油或礦物油)中的懸浮液的形式，或者水或油/水乳劑的形式，或者作為可濕性粉齊IJ，或者與適合于農(nóng)業(yè)應(yīng)用的任何其他載體材料相組合。合適的農(nóng)業(yè)載體可以是固體或液體，并且是本領(lǐng)域眾所周知的。術(shù)語“農(nóng)業(yè)上可接受的載體”包括通常用于殺有害生物劑配制技術(shù)的所有助劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、粘合劑等；這些對于殺有害生物劑配制領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是熟知的。所述制劑可以與一種或多種固體或液體助劑相混合，并且可以通過各種方法來制備，例如通過使用常規(guī)配制技術(shù)將殺有害生物組合物與合適的助劑一起均勻地混合、摻合和/或研磨。合適的制劑和施用方法描述于美國專利號 6，468，523中，該文獻(xiàn)通過提及而合并入本文。
“有害生物(pest)”包括但不限于，昆蟲、真菌、細(xì)菌、線蟲、螨、蜱等。昆蟲有害生物包括選自鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目 (L印idoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目 (Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目 (Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等的昆蟲，特別是選自鞘翅目、 鱗翅目和雙翅目的昆蟲。
鞘翅目包括肉食亞目(Acbphaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包括步甲總科(Caraboidea)和豉甲總科(Gyrinoidea)，而多食亞目包括牙甲總科(Hydrophiloidea)、 隱翅甲總科 Gtaphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公蟲總科(Cleroidea), πρ 頭蟲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科 (Byrrhoidea)、扁甲總禾斗(Cucujoidea)、芫菁總禾斗(Meloidea)、花圣總禾斗(Mordelloidea)、 擬步甲總禾斗(Tenebrionoidea)、長蠹總禾斗(Bostrichoidea)、金龜總禾斗(Scarabaeoidea)、 天?？偪?Cerambycoidea)、葉甲總科(Chrysomeloidea)和象甲總科(Curculionoidea)。 步甲總科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龍虱科(Dytiscidae)。豉甲總科包括豉甲科(Gyrinidae)。牙甲總科包括牙甲科(Hydrophi 1 idae)。隱翅甲總科包括葬甲科(Silphidae)和隱翅甲科(Maphylinidae)?；ㄎ灴偪瓢ɑㄎ灴?Cantharidae) 和螢科(Lampyridae)。郭公蟲總科包括郭公蟲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。 叩頭蟲總科包括叩頭蟲科(Elateridae)和吉丁蟲科(Buprestidae)。扁甲總科包括瓢蟲科(Coccinellidae)。芫菁總科包括芫菁科(Meloidae)。擬步甲總科包括擬步甲科 (Tenebrionidae)。金龜總科包括黑蜣科(Passalidae)和金龜科(Scarabaeidae)。天?？偪瓢ㄌ炫？?Cerambycidae)。葉甲總科包括葉甲科(Chrysomelidae)。象甲總科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)
雙翅目包括長角亞目(Nema tocera)、短角亞目(Brachycera)和環(huán)裂亞目 (Cyclorrhapha)。長角亞目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(I3Sychodidae)、蚊科 (Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭岐科(Cecidomyiidae)。短角亞目包括水虻科(Stra tiomyidae)、 虻科(Tabanidae)、劍虻科(Therevidae)、食蟲虻科(Asilidae)、擬食蟲虻科(Mydaidae)、 蜂虻科(Bombyliidae)和長足虻科(Dolichopodidae)。環(huán)裂亞目包括無縫組(Aschiza) 和有縫組(Schizophora)。無縫組包括蚤蠅科(Phoridae)、蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。有縫組包括無瓣類(Acalyptratae)和有瓣類(Calyptratae)。無瓣類包括斑蠅科(Otitidae)、實(shí)蠅科(T印hritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科 (Drosophilidae)。有瓣類包括虱蠅科(Hippoboscidae)、狂蠅科(Oestridae)、寄蠅科 (Tachinidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、蠅科(Muscidae)、麗蠅科(Calliphoridae)和麻蠅禾4" (Sarcophagidae)。
鱗翅目包括鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、 蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、 天蛾科(Sphingidae)、天蠶蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾禾斗(Tineidae)。
對于主要農(nóng)作物的本發(fā)明的昆蟲有害牛物包括玉米玉米螟(Ostrinia nubilalis)；小地老虎(Agrotis ipsilon)；谷實(shí)夜蛾(Helicoverpa zea)；草地夜 (Spodoptera frugiperda) ； Hf ΞΕ f If 胃 _ (Diatraea grandiosella) ； 1 ^ ΞΕ 米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)；小蔴桿草螟(Diatraeasaccharalis)；玉米根葉甲(Diabrotica virgifera)；長角葉甲巴氏亞種(Diabrotica Iongicornis
barberi) ；HjH--M Bf ￥ ^ IH M ft (Diabrotica undecimpunctata howardi) ； ^t JTl
叩頭蟲屬物種(Melanotus spp.)；北方圓頭犀金龜(Cycloc^phala borealis)；南方圓頭犀金龜(Cyclocephala immaculata)；日本弧麗金龜(Popillia japonica)；玉米銅色跳甲(Chaetocnema pulicaria)；玉米隱 _ 象(Sphenophorus maidis)；玉米縊管蚜(Rhopalosiphummaidis)；玉米根蟲牙(Anuraphis maidiradicis)；美洲谷長蟲春(Blissusleucopterus leucopterus)；赤胚黑幢(Melanoplus femurrubrum)；血黑幢(Melanoplus sanguinipes)；玉米禾中妮(Hylemya platura)玉米斑潛妮(Agromyza parvicornis)；玉米黃呆 !馬(Anaphothripsobscrurus)；竊蟲義(Solenopsis molesta)； 二斑葉螨CTetranychusurticae)高梁斑末草螟(Chilo partellus)；草地夜峨；谷實(shí)夜蛾；南美玉米苗斑螟；粒膚臟切夜蛾(Feltia subterranea)；長毛食葉鰓金龜 (Phyllophaga crinita) ；Eleodes spp.、寬胸口口頭蟲屬物種(Conoderus spp.)禾口 Aeolus spp.；黑角負(fù)泥蟲(Oulemamelanopus)；玉米銅色跳甲；玉米隱喙象；玉米縊管蚜；美甘蔗偽毛蚜(Sipha flava)；美洲谷長蝽；高粱癭蚊(Contarinia sorghicola)；朱砂葉螨 (Tetranychus cinnabarinus) ；二SE卩十■；小麥一(Pseudaletia unipunctata)；
草地夜峨；南美玉米苗斑螟；西方灰地老虎(Agrotis orthogonia)；南美玉米苗斑螟； 黑角負(fù)泥蟲；三葉草葉象(Hypera punctata)；黃瓜i^一星葉甲食根亞種；俄羅斯小麥蚜蟲；麥二叉蚜(Schizaphis graminum)；麥長管蚜(Macrosiphumavenae)；赤胚黑幢； 異黑蝗(Melanoplus differentials)；血黑蝗；小麥癭蚊(Mayetiola destructor)； 麥紅吸菜蟲(Sitodiplosismosellana)；美洲稈蠅(Meromyza americana)；麥?zhǔn)莘N蠅 (Hylemyacoarctata)；煙褐花薊馬(Frankliniella fusca)；麥蓮蜂(Cephus cinctus)； 郁金香瘤癭螨(Aceria tulipae)向日葵向日葵芽卷葉蛾(Suleima helianthana)；向曰葵同斑螟(Homoeosomaelectellum)；向曰葵葉甲(Zygogramma exclamationis)；古月蘿卜禾1J — (Bothyrus gibbosus) ； ( H^ff^K (Neolasiopteramurtfeldtiana)棉花 煙芽夜蛾(Heliothis virescens)；谷實(shí)夜蛾；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)；紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella)；棉鈴象(Anthonomus grandis)；棉蟲牙(Aphisgossypii)； 棉序盲蟲春(Pseuda tomoscelis seriatus)；苘麻粉風(fēng)(Trialeurodes abutilonea)；美國牧草盲蝽(Lygus lineolaris)；赤脛黑蝗；異黑蝗；煙薊馬(Thrips tabaci)；煙褐花薊馬；朱砂葉螨；二斑葉螨小蔗桿草螟；草地夜蛾；谷實(shí)夜蛾；葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea)；禾象(Lissorhoptrus oryzophilus)；米象(Sitophilus oryzae) ； ■^條黑 ■ 口十 單(Nephotettixnigropictus) 十(Acrosternum hilare)大豆 大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；大豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)；苜猜綠夜蛾(Plathypena scabra)；玉米螟；小地老虎；甜菜夜蛾；煙芽夜蛾；谷實(shí)夜蛾；墨西哥大豆票瓜蟲(Epilachnavariyestis)；桃蟲牙(Myzus persicae)；香豆微葉蝶(Empoasca fabae)； 擬緣蝽；赤脛黑蝗；異黑蝗；玉米種蠅；大豆薊馬(Sericothripsvariabilis)；煙薊馬；草莓葉螨(Tetranychus turkestani) ；二斑葉螨大壽玉米蜈小地老虎；麥二叉蚜；美洲谷長蝽；擬緣蝽；煙草椿(Euschistus servus)；灰地種蠅(Delia platura)；小麥癭蚊；潛巖螨(Petrobia latens)油籽油菜甘藍(lán)蟲牙(Brevicorynebrassicae)；蔬菜黃條 Ι 甲(Phyllotreta cruciferae) ；^？！ ^(Mamestra configurata) : ! (Plutella xylostella)；地種蠅屬物種(Delia ssp.)。
線蟲包括寄生性線蟲，例如根結(jié)線蟲、胞囊線蟲和根腐線蟲，包括異皮線蟲屬物種、根結(jié)線蟲屬物種和球異皮線蟲屬物種；特別是胞囊線蟲的成員，包括但不限于，大豆異皮線蟲(Heterodera glycines)；甜菜異皮線蟲；燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)；以及馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和蒼白球異皮線蟲(Globoderapailida)。根腐線蟲包括短體線蟲屬物種。
用于增加棺物產(chǎn)量的方法
提供了用于增加植物產(chǎn)量的方法。所述方法包括將包含本文公開的殺有害生物序列的多核苷酸引入植物或植物細(xì)胞中。如本文所定義的，植物的“產(chǎn)量”指由植物產(chǎn)生的生物量的品質(zhì)和/或數(shù)量。“生物量”意指任何經(jīng)測量的植物產(chǎn)物。生物量產(chǎn)生方面的增加是在所測量的植物產(chǎn)物的產(chǎn)量方面的任何改善。增加植物產(chǎn)量具有幾種商業(yè)應(yīng)用。例如，增加植物葉生物量可以增加用于人或動物消費(fèi)的葉菜的產(chǎn)量。此外，增加葉生物量可以用于增加植物衍生的藥物或工業(yè)產(chǎn)物的生產(chǎn)。產(chǎn)量的增加可以包括相比于不表達(dá)所述殺有害生物序列的植物而言任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，包括但不限于，產(chǎn)量的至少的增加，至少 3 %的增加，至少5 %的增加，至少10 %的增加，至少20 %的增加，至少30 %、至少50 %、至少 70%、至少100%或更大的增加。
在具體方法中，由于表達(dá)本文公開的殺有害生物蛋白質(zhì)的植物的有害生物抗性得到提高，因而增加了植物產(chǎn)量。殺有害生物蛋白質(zhì)的表達(dá)導(dǎo)致有害生物侵染或取食植物的能力降低，從而提高了植物產(chǎn)量。
提供了下述實(shí)施例，這是為了舉例說明而不是為了限制。
實(shí)驗(yàn)
實(shí)施例1.ATX9387的生長以及提取物的制備
使菌株ATX9387(其通過MIDI分析而被鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)/ 蘇云金芽孢桿菌群的成員)于30度在T3培養(yǎng)基中生長16小時(shí)至5天。離心培養(yǎng)物，并將上清液通過0. 2微米的濾膜，從而得到無菌的上清液。
實(shí)施例2.秀麗隱桿線蟲生物測定法
如本領(lǐng)域中已知的來飼養(yǎng)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)雌雄同體， 從而產(chǎn)生用于生物測定法的健康動物群體。用于秀麗隱桿線蟲的生長、收獲和遺傳操作的一般程序(包括生長培養(yǎng)基等)可在本領(lǐng)域中找到，例如在Wood，ed. (1988)The NematodeCaenorhabditis elegans (Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY)中。
就對于秀麗隱桿線蟲的活性來測試來自菌株ATX9387的無菌上清液。在96孔平板中進(jìn)行生物測定法。將5至10只線蟲加至80 μ 1 S培養(yǎng)基中(Wood，同上)，并與20 μ 1
23無菌上清液、0.5μ 1濃縮的HBlOl (如Wood(同上)中所描述的來制備)和利福平(0. 1 μ g/ μ 1的終濃度)相混合。使測定法在室溫下進(jìn)行3天，并對線蟲進(jìn)行定量。陰性對照樣品 (Τ3培養(yǎng)基或來自失活的菌株的無菌上清液)包含數(shù)百只活躍的線蟲，而受試樣品(含有 ΑΤΧ9387上清液)包含5至10只行動遲緩的或死亡的線蟲。在秀麗隱桿線蟲上ΑΤΧ9387提取物的生物測定法的結(jié)果顯示在表1中。
表1. ΑΤΧ9387提取物對于秀麗隱桿線蟲的活性
權(quán)利要求
1.分離的或重組的核酸分子，其包含選自下列的核苷酸序列a)SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 37 的核苷酸序列，或其互補(bǔ)物；b)與SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 37 的核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，或其互補(bǔ)物，其中所述核苷酸序列編碼具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性的多肽；c)編碼包含SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33 或 38 的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；d)編碼包含與SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、四、31、33 或 38 的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性的多肽；和e)以登記號B-30935進(jìn)行保藏的質(zhì)粒的DNA插入片段的δ-內(nèi)毒素核苷酸序列，或其互補(bǔ)物。
2.權(quán)利要求
1的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列與能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的啟動子可操作地連接。
3.權(quán)利要求
1或2的分離的或重組的核酸分子，其中所述核苷酸序列是被設(shè)計(jì)用于在植物中表達(dá)的合成序列。
4.載體，其包含權(quán)利要求
1，2或3的核酸分子。
5.權(quán)利要求
4的載體，其進(jìn)一步包含編碼異源多肽的核酸分子。
6.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求
1的分離的或重組的核酸分子，并且其不是植物細(xì)胞。
7.權(quán)利要求
6的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞。
8.具有殺有害生物活性的分離的或重組的多肽，其選自a)包含SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33 或 38 的氨基酸序列的多肽；b)包含與SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、四、31、33 或 38 的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性；c)由SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32 或 37 的核苷酸序列編碼的多肽；d)由與SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32 或 37 的核苷酸序列至少95%同一的核苷酸序列編碼的多肽，其中所述多肽具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性；和e)由以登記號B-30935進(jìn)行保藏的質(zhì)粒的DNA插入片段的δ-內(nèi)毒素核苷酸序列編碼的多肽。
9.權(quán)利要求
8的多肽，其進(jìn)一步包含異源氨基酸序列。
10.抗體，其選擇性地結(jié)合權(quán)利要求
8的多肽。
11.組合物，其包含權(quán)利要求
8的多肽。
12.權(quán)利要求
11的組合物，其中所述組合物選自粉劑、粉塵劑、丸劑、顆粒劑、噴霧劑、 乳液、膠體和溶液。
13.權(quán)利要求
11的組合物，其中通過蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞的培養(yǎng)物的脫水、凍干、勻漿、提取、過濾、離心、沉淀或濃縮來制備所述組合物。
14.權(quán)利要求
11的組合物，其包含大約1重量％至大約99重量％的所述多肽。
15.用于防治線蟲有害生物群體的方法，所述方法包括使所述群體與殺有害生物有效量的權(quán)利要求
8的多肽接觸。
16.用于殺死線蟲有害生物的方法，所述方法包括使所述有害生物與殺有害生物有效量的權(quán)利要求
8的多肽接觸，或者用殺有害生物有效量的權(quán)利要求
8的多肽飼喂所述有害生物。
17.用于產(chǎn)生具有殺有害生物活性的多肽的方法，其包括在其中表達(dá)編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求
6的宿主細(xì)胞。
18.用于保護(hù)植物免受有害生物侵害的方法，其包括將至少一個(gè)包含編碼殺有害生物多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述植物或其細(xì)胞中，其中所述核苷酸序列選自a)SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32 或 37 的核苷酸序列；b)與SEQ ID NO :1、7、9、11、14、16、18、20、22、24、洸、28、30、32 或 37 的核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性的多肽；c)編碼包含SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33 或 38 的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；d)編碼與SEQ ID NO :2、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、四、31、33 或 38 的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列編碼具有抗植物寄生性線蟲的殺有害生物活性的多肽；和e)以登記號B-30935進(jìn)行保藏的質(zhì)粒的DNA插入片段的δ-內(nèi)毒素核苷酸序列，或其互補(bǔ)物。
19.權(quán)利要求
18的方法，其中所述植物產(chǎn)生殺有害生物多肽，所述殺有害生物多肽具有針對線蟲有害生物的殺有害生物活性。
專利摘要
提供了用于將殺有害生物活性賦予細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子的組合物和方法。提供了組合物，其包含δ-內(nèi)毒素多肽的編碼序列。所述編碼序列可以在DNA構(gòu)建體或表達(dá)盒中使用以用于轉(zhuǎn)化植物和細(xì)菌并在其中表達(dá)。所述組合物還包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織和種子。特別地，提供了分離的δ-內(nèi)毒素核酸分子。另外，包括了相應(yīng)于所述多核苷酸的氨基酸序列，和特異性地結(jié)合這些氨基酸序列的抗體。特別地，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或38中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或37中所示的核苷酸序列，以及其變體和片段。
文檔編號A01N65/00GKCN101501066 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200780029753
公開日2012年5月30日 申請日期2007年6月14日
發(fā)明者D·J·湯姆索, J·蒂森, N·卡洛茲, N·達(dá)克, N·迪塞, R·郭, S·簡, T·卡恩 申請人:阿則耐克斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),