專利名稱:植物代謝物輸出基因啟動子的制作方法
植物代謝物輸出基因啟動子
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)類似于蔡藜苜猜(Medicgo truncatula)結(jié)瘤素21(MtN21)的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。本發(fā)明的MtN21-樣基因的啟動子用于控制在植物根部中任何感興趣的核酸的轉(zhuǎn)錄。特別地，本發(fā)明的啟動子可用于控制那些抑制植物寄生性線蟲繁殖的核酸的轉(zhuǎn)錄。
發(fā)明背景
植物寄生性線蟲是微小的蠕蟲樣動物，其以超過2，000種農(nóng)作物、蔬菜、水果和觀賞植物的根、葉和莖為食，導(dǎo)致全世界估計(jì)1000億美元的農(nóng)作物損失。一種線蟲的常見類型是根結(jié)線蟲(RKN)，其覓食引起根部特征性的蟲癭。其它覓食根部的線蟲是孢囊和斑(lesion)-類型，其更具有宿主特異性。
目前線蟲遍及美國，但是在西部和南部的溫暖潮濕地區(qū)和在砂質(zhì)土中成為主要問題。大豆孢囊線蟲(SCN),大豆異皮線蟲(Heterodera glycine),是1954年在美國北卡羅來納州第一個被發(fā)現(xiàn)的。它是大豆植物最嚴(yán)重的害蟲。一些地區(qū)被SCN重度侵染，以至于在沒有控制手段情況下，大豆生產(chǎn)在經(jīng)濟(jì)上不再可能。雖然大豆是受SCN侵襲的主要經(jīng)濟(jì)作物，但SCN寄生于總共大約五十種宿主，包括農(nóng)田作物、蔬菜、觀賞植物和雜草。
線蟲損害的癥狀包括矮化和葉的黃化，以及在炎熱時期期間的植物萎蔫。然而，包括SCN的線蟲在沒有明顯的上述地面征狀情況下可以引起重大的產(chǎn)量損失。此外，受SCN感染的根部變得矮小或者矮化。線蟲侵染可以減少根部上的固氮瘤數(shù)量，且可能使得根部更容易受其它土傳植物病原體的侵 襲。
線蟲的生活周期具有三個主要階段:卵、幼體和成體。生活周期在線蟲種類之間不同。例如，SCN的生活周期在適宜條件下可以在24至30天內(nèi)完成，而其它物種可用一年或更長的時間來完成生活周期。在春天當(dāng)溫度和濕度水平變得充足時，蠕蟲形狀的幼體從土壤里的卵中孵化而來。這些幼體是線蟲可以感染大豆根部的唯一的生活階段。
SCN的生活周期已成為許多研究的課題，因此可被用作了解線蟲生活周期的例子。在穿透大豆根部之后，SCN幼體移動穿過根部直到它們接觸維管組織，它們停在那里并開始覓食。線蟲注入分泌物以修飾某些根細(xì)胞且將它們轉(zhuǎn)變成專門的覓食部位。根細(xì)胞在形態(tài)上被轉(zhuǎn)變成大的多核合胞體(或者在RKN情況下的巨大細(xì)胞)，其用作線蟲的營養(yǎng)物來源?；钴S覓食的線蟲因此從植物中竊取必需的營養(yǎng)物導(dǎo)致產(chǎn)量損失。當(dāng)線蟲覓食時，它們膨脹，最后雌性線蟲變得如此之大以至于它們突破根部組織且暴露于根部的表面上。
在一段時期覓食之后，不是膨脹為成體的雄性SCN線蟲從根部移出進(jìn)入土壤中，并使檸檬狀的成體雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍附著于根系且繼續(xù)覓食。在膨脹的雌性內(nèi)的卵開始發(fā)育，最初在體外的一團(tuán)或者卵囊中，然后隨后在體腔內(nèi)。最后成體雌性的整個體腔充滿了卵，雌性線蟲死亡。充滿了卵的死亡的雌性軀體被稱為胞囊。最后胞囊移出，在土壤中游離地被發(fā)現(xiàn)。胞囊的壁變得很堅(jiān)韌，為內(nèi)含的大約200至400個卵提供極好的保護(hù)。SCN的卵生存在胞囊內(nèi)直到合適的孵化條件發(fā)生。雖然許多卵可能在第一年內(nèi)孵化，但也有許多在胞囊內(nèi)要生存好幾年。
線蟲自身每年可以通過土壤移動僅幾英寸。然而，線蟲侵染可以用各種方式遍布相當(dāng)大的距離?？梢砸苿邮芮秩就寥赖娜魏挝镔|(zhì)都能夠傳播該侵染，包括農(nóng)業(yè)機(jī)械、交通工具和工具、風(fēng)、水、動物和農(nóng)場工人。種子大小的土壤顆粒經(jīng)常污染收獲的種子。因此，當(dāng)將受侵染田地中的受污染的種子種植在未受侵染的田地時，線蟲侵染可被傳播。甚至有證據(jù)表明某些線蟲種類可以通過鳥類傳播。不幸的是，在這些因素中僅有一些可被阻止。
管理線蟲侵染的傳統(tǒng)實(shí)踐包括:在線蟲侵染的土地中保持合適的土壤養(yǎng)分和土壤pH水平；控制其它的植物病害，像昆蟲和雜草害蟲；使用衛(wèi)生設(shè)施實(shí)踐例如對SCN侵染的田地的耕作、種植和栽培只在非侵染田地工作之后；在侵染的田地中工作之后用高壓水或者蒸汽徹底清洗設(shè)備；不使用在受侵染的土地上生長的種子種植非侵染的田地，除非該種子已經(jīng)被適當(dāng)?shù)厍逑?；翻轉(zhuǎn)受侵染的田地并用非宿主作物替換宿主作物；使用殺線蟲劑；和種植抗性植物品種。
已經(jīng)提出了方法用植物的遺傳轉(zhuǎn)化以賦予增強(qiáng)對植物寄生性線蟲的抗性。美國專利號5，589，622和5，824，876涉及在植物被線蟲附著后，在覓食部位或靠近覓食部位中特異表達(dá)的植物基因的鑒定。美國專利號5，589，622和5，824，876公開了八個分離自感染馬鈴薯金線蟲 (Globoderarostochiensis)的馬鈴薯根部的啟動子:沒有公開源自其它植物物種的線蟲誘導(dǎo)性啟動子。這些啟動子聲稱對指導(dǎo)毒性蛋白質(zhì)或酶的特異性表達(dá)、或者靶基因或一般細(xì)胞基因的反義RNA的表達(dá)有用。
美國專利號5，023，179公開了被稱為ASF-1的啟動子增強(qiáng)子元件，分離自CaMV啟動子，其聲稱可增強(qiáng)植物在根部的基因表達(dá)。
美國專利號5，750，386公開了煙草(Nicotiana tabacum)的RB7根部特異啟動子的缺失片段，其聲稱是線蟲應(yīng)答的。
美國專利號5，837，876公開了從煙草中分離的根部皮層特異基因的啟動子并稱為 TobRD2。
美國專利號5，866，777公開了一種雙基因方法來阻礙線蟲覓食結(jié)構(gòu)的形成。第一個基因，芽孢桿菌RNA酶，受到至少在覓食結(jié)構(gòu)中驅(qū)動表達(dá)的啟動子的控制。第二個基因，芽孢桿菌RNA酶抑制劑，受到在除了覓食結(jié)構(gòu)外的所有植物細(xì)胞中驅(qū)動表達(dá)的啟動子的控制。覓食部位特異性啟動子在美國專利號5，866，777中公開了，包括Λ 0.3TobRB7和rolC啟動子的截短形式。
美國專利號5,955,646公開了基于源自根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露堿合酶和章魚堿合酶基因的啟動子的嵌合調(diào)節(jié)區(qū),其聲稱是線蟲可誘導(dǎo)的。
美國專利號6，005，092公開了煙草內(nèi)切-1，4_β-葡聚糖酶(Ntcel7)啟動子。
美國專利號6，262，344和6，395，963公開了分離自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的啟動子,其聲稱是線蟲可誘導(dǎo)的。
美國專利號6，448，471公開了源自擬南芥的啟動子，其對于線蟲的覓食部位是特異性的。
美國專利號6，593，513公開了在擬南芥內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶基因(cell)的啟動子控制下用芽孢桿菌RNA酶轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生能破壞線蟲攻擊的植物。
美國專利號6，906, 241公開了 Ntcel7啟動子與編碼殺線蟲的或者殺蟲的蛋白質(zhì)的異源核酸結(jié)合的用途。[0022]美國專利號7，078，589公開了大豆Pyk20基因和啟動子的克隆和分離，其聲稱是被SCN感染誘導(dǎo)的并在維管組織中顯示出強(qiáng)的活性。
美國專利申請公開號2003/0167507公開了大豆異黃酮合酶I的啟動子，其聲稱是根部特異性的且在營養(yǎng)組織中可被寄生蟲攻擊誘導(dǎo)。
美國專利申請公開號2004/0078841公開了擬南芥的TUB_1、RPL16A和ARSKl啟動子的啟動子區(qū)域，和豌豆(Pisum sativum)的PSMTa啟動子,其聲稱都是根部特異的。
美國專利申請公開號N0.2004/0248304公開了大豆Pyk20基因和啟動子的克隆和分離，其聲稱是被SCN感染誘導(dǎo)的并在維管組織中顯示出強(qiáng)的活性。
美國專利申請公開號2004/0029167公開來自煙草的II類咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因的啟動子序列，其聲稱在應(yīng)答機(jī)械的或化學(xué)的損傷或者病原物質(zhì)的攻擊時是可被誘導(dǎo)的。
美國專利申請公開號2005/0262585公開一個源自大豆磷酸核糖基甲酰甘氨脒核糖核苷酸合酶的啟動子和其缺失片段，其聲稱是對線蟲感染應(yīng)答。
W094/10320公開了源自煙草的Λ 0.3TobRB7啟動子片段和它與各種線蟲覓食細(xì)胞特異性表達(dá)的基因結(jié)合的用途。
W003/033651公開了被稱為SCP1、UCP3和SUP的合成的線蟲調(diào)節(jié)啟動子序列。
W02004/029222和其美國的副本即美國專利申請公開號2005/0070697公開了源自大豆腺苷-5'-磷酸脫氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)，用于改進(jìn)植物的抗線蟲性。[0031 ] 上述提到的根部或覓食部位特異的啟動子目前都沒有應(yīng)用于包含抗線蟲轉(zhuǎn)基因的市售種子。雖然這種產(chǎn)品 的需求已經(jīng)長期被公認(rèn)，但迄今沒有人成功通過重組DNA技術(shù)開發(fā)出線蟲抗性植物。對與編碼對植物寄生性線蟲有毒的物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因組合的、根部特異性和/或線蟲覓食部位特異性的啟動子的需求持續(xù)存在。
發(fā)明概述
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物基因啟動子包含以相互特定的方向的某些已知的調(diào)控元件時，這些啟動子共同具有可被線蟲誘導(dǎo)的特性。因此，本發(fā)明提供了適用于在植物根中驅(qū)動另一個核酸表達(dá)的啟動子，其對線蟲侵襲是敏感的。本發(fā)明的啟動子特別用于使農(nóng)作物植物抵抗線蟲的侵染。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了啟動子構(gòu)型I的分離的核酸，其中該核酸具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以Y至:V順序包含正鏈上的P$MADS類元件、負(fù)鏈上的P$MYBS類元件和正鏈上的P$D0FF類元件，其中P$MADS類元件在P$MYBS類元件的約50個核苷酸之內(nèi)，P$MYBS類元件在P$D0FF類元件的約50個核苷酸之內(nèi)，P$MADS類元件在P$D0FF類元件的約100個核苷酸之內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種啟動子構(gòu)型2的分離的核酸，其中該核酸具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$0PAQ類元件、負(fù)鏈上的第一PSAHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件，正鏈上的第二 P$AHPB類元件和正鏈上的P$TBPF類元件，其中P$0PAQ類元件在第一 P$AHPB類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，第一 P$AHPB類元件在P$MADS類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，P$MADS類元件在第二 P$AHPB類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，第二 P$AHPB類元件在P$TBPF類元件的約60個核苷酸內(nèi)，以及P$0PAQ類元件在P$TBPF類元件的約240個核苷酸內(nèi)。[0036]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了啟動子構(gòu)型3的分離的核酸，其中該核酸具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$TBPF類元件、正鏈上的第
一P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件、正鏈上的第一 P$D0FF類元件、負(fù)鏈上的第二PSDOFF類元件，以及正鏈上的第二 P$AHPB類元件，其中P$TBPF類元件在第一 P$AHPB類元件的約60個核苷酸內(nèi)，第一 P$AHPB類元件在P$MADS類元件的約60個核苷酸內(nèi)，P$MADS類元件在第一 P$D0FF類元件的約60個核苷酸內(nèi)、第一 P$D0FF類元件在第二 P$D0FF類元件的約60個核苷酸內(nèi)，第二 P$D0FF類元件在第二 P$AHPB類元件的約60個核苷酸內(nèi)，以及PSTBPF類元件在第二 P$AHPB類元件的約300個核苷酸內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了啟動子，其包含選自以下的分離的核酸:具有如SEQ ID NO:1所示序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:1所示序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ IDNO:1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸雜交的核酸；具有如SEQID NO:2所示序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:2所示序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸雜交的核酸；具有如SEQID NO:3所不序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:3所不序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸；和在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸雜交的核酸。
本發(fā)明也體現(xiàn)在含有本發(fā)明啟動子的表達(dá)盒和轉(zhuǎn)基因植物，和控制農(nóng)作物被寄生性線蟲侵染的方法，其中該方法使用包含本發(fā)明啟動子(與另一個編碼對植物寄生性線蟲有毒的物質(zhì)的核酸有效連接)的重組核酸構(gòu)建體。
附圖簡述

圖1A:基因座Atlg21890(SEQ ID NO:1)的擬南芥啟動子區(qū)域的序列，在堿基1854-1860位的TATA框用 小寫、粗體和斜體表示；圖1B是存在于包含在SEQ ID NO:1所示啟動子內(nèi)的啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3中的啟動子元件類別的表格。
圖2:基因座At4g08290(SEQ ID NO:2)的擬南芥啟動子區(qū)域的序列，在堿基1869-1875位的TATA框用粗體表示。
圖3:大豆(Glycine max)MtN21_3 (SEQ ID NO:3)的啟動子區(qū)域的序列，在堿基664-670位的TATA框部分是小寫的，并且是粗體和下劃線。圖3中也包括存在于包含在SEQID NO:3所示啟動子內(nèi)的啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3中的啟動子元件類別的表格。
圖 4:GmMtN21-2 (GM50444087 ；SEQ ID NO:4)和 GmMtN21_l (GM50862200，SEQ IDNO:5)的 cDNA 序列。
圖5:GmMtN21-3(SEQ ID NO:6)的序列。
圖6:包含基因座Atlg21890 (SEQ ID NO: I)的擬南芥啟動子的二元載體pAW134qcz 的圖譜。
圖7:包含基因座At4g08290 (SEQ ID NO:2)的擬南芥啟動子的二元載體pAW219qcz 的圖譜。
圖8:包含GmMtN21_3啟動子(SEQ ID NO:3)的二元載體pAW223qcz的圖譜。[0048]圖9:在實(shí)施例3所示的大豆發(fā)根測定中二元載體pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qCZ的β -葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)模式。“DAI”是指用SCN接種后的天數(shù)。使用以下計(jì)分指標(biāo)為沒有⑶S染色，“ + ”為⑶S弱的染色，“++”為強(qiáng)的⑶S染色。10個計(jì)數(shù)的大概平均值用于測定該品系合胞體中的⑶S表達(dá)水平。此外，對于其它的根部組織比如愈傷組織、根尖、維管結(jié)構(gòu)、皮層和原基(primordial)，在相同品系中的⑶S表達(dá)水平也用相同的⑶S計(jì)分指標(biāo)記錄即為沒有染色、“ + ”為弱的染色、“++”為強(qiáng)的染色。
圖10:在基因座Atlg21890(SEQ ID NO:1)的擬南芥啟動子和大豆MtN21_3啟動子(SEQ ID NO:3)中啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3的啟動子元件類別的位置。
圖11:在實(shí)施例7中用于獲得SEQ ID NO:USEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的啟動子及SEQ ID NO:1的缺失的PCR引物。
圖 12A-12B:大豆 cDNA GmMtN2卜2 (GM50444087 ;SEQ ID NO:4)和GmMtN21-l(GM50862200, SEQ ID NO:5)的序列比對。
圖 13A，13B，13C:基因組移行片段(walkingfragment)GmMtN21-3(SEQ ID NO:6)和大豆cDNAGmMtN21-2(GM50444087;SEQ ID NO:4)的序列對比。GmMtN21_2 (SEQ ID NO:4)的ATG起始密碼子始于第74bp。一個推定的793bp的啟動子區(qū)域由SEQ ID NO:3所示，且源自于GmMtN21-3(SEQID NO:6)的堿基第126至916位。
圖14A，14B, 14C:比較SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基(對應(yīng)于Atlg21890pr650bp的第I至650位堿基)、SEQ ID NO:2的第1298至1947位堿基(對應(yīng)于At4g08290pr650bp的第I至650位堿基)和SEQ IDNO:3的第142至791位堿基(對應(yīng)于 Gm_MtN21pr650bp 的第 I 至 650 位喊基)的 Genomatix DiAlign 結(jié)果。
圖15:在啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3 (非準(zhǔn)確尺度)中發(fā)現(xiàn)的啟動子元件類別的空間構(gòu)型，包括啟動子元件類別共有序列。在命名為“元件IUPAC串共有序列”的那欄中，使用以下縮寫:A =腺嘌呤，C =胞嘧啶，G =鳥嘌呤，T =胸腺嘧啶，R = A或G，Y = C 或 T，M = A 或 C，K = G 或 T，W = A 或 T，S = C 或 G，和 N = A、C、G 或 T。構(gòu)型關(guān)鍵如下:
1:包含啟動子構(gòu)型I的SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基中包含的啟動子元件類別的表示。
2:包含啟動子構(gòu)型2的SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基中包含的啟動子元件類別的表示。
3:包含啟動子構(gòu)型3的SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基中包含的啟動子元件類別的表示。
圖16:在實(shí)施例9中所示的大豆發(fā)根測定中二元載體pAW134qcz、RTJ137、RTJ141、RTJ142、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135 和 RTJ136 (見實(shí)施例 7 和 8)的覓食部位 β -葡糖醛酸糖苷酶表達(dá)模式。使用以下計(jì)分指標(biāo)“為沒有染色，“ + ”為弱的染色，“++”為強(qiáng)的染色。此外，表明在12個品系中的I個品系在少于或等于10個觀察的覓食部位中的7個中顯示出覓食部位中的GUS染色。因?yàn)橹挥蠭個品系在覓食部位中顯示出活性，得分與真陽性表達(dá)模式不一致，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果。10個計(jì)數(shù)的大概平均值用于確定在每個品系的合胞體中⑶S表達(dá)水平。[0059]優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
通過參考以下本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案和此處包括的實(shí)施例的詳細(xì)說明可以更容易地了解本發(fā)明。除非另有說明，此處使用的術(shù)語是相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)用法理解的。除以下提供的術(shù)語定義之外，在分子生物學(xué)中通用術(shù)語的定義也可以在Rieger等，1991遺傳學(xué)詞匯:經(jīng)典的和分子的，第5版(Glossary of genetics classical andmolecular), Berlin:Springer_Verlag ;和在分子生物學(xué)通用規(guī)程(Current ProtocolsinMolecular Biology), F.M.Ausubel 等,編著,通用規(guī)程(Current Protocols),格林出版聯(lián)合公司(Greene Publishing Associates, Inc.)和約翰 Wiley Sons 公司(John Wiley&Sons, Inc.)合資(1998增刊)中找到。
可理解的是，如說明書和權(quán)利要求
書中使用的，“一個/條/種”依據(jù)其使用的上下文可以表示一個或多個。因此，例如，涉及“一個細(xì)胞”可以表示至少可使用一個細(xì)胞?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明不限于特定的核酸、特定的細(xì)胞類型、特定的宿主細(xì)胞、特定條件或者特定方法等等，當(dāng)然同樣地，其中的改變、許多修飾和變異對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。也可以理解的是，此處使用的術(shù)語只為了描述特定實(shí)施方案的目的，并不是有意限制。
貫穿本申請，參考了許多出版物。為了更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平，所有這些出版物的公開和那些出版物中引用的參考整體地在此通過參考并入到本申請中。用于克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化、包括DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切核酸酶等的酶促反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和多種分離技術(shù)是那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的且常規(guī)使用的。許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述在Sambrook和Russell, 2001年的分子克隆(MolecularCloning),第三版,冷泉港(Cold Spring Harbor), Plainview,紐約；Sambrook 等，1989 年的分子克隆,第二版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室(Cold SpringHarbor Laboratory), Plainview,紐約；Maniatis 等，1982 年的分子克隆，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview,紐約；ffu (編著.)1993年的Meth.Enzymol.218,第I部分；ffu (編著)1979 年的 Meth Enzymol.68 ；ffu 等，(編著)1983 年的 Meth.Enzymol.100和 101 ；Grossman 和 Moldave (編著)1980 年的 Meth.Enzymol.65 ；Miller (編著)1972 年的分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)(Experiments in Molecular Genetics),冷泉港實(shí)驗(yàn)室,冷泉港,紐約；Old 和 Primrose, 1981 年的基因操作原理(Principles of GeneManipulation),加利福尼亞大學(xué)Press,伯克利；Schleif和We`nsink, 1982年的分子生物學(xué)中的實(shí)用方法(PracticalMethods in MolecularBiology) ;Glover (編著)1985 年的 DNA 克隆(DNA Cloning)卷 I和 II, IRLPress,牛津,英國；Hames 和 Higgins (編著)1985 年的核酸雜交(NucleicAcidHybridization), IRL Press,牛津,英國 JPSetlow和 Hollaenderl979年的遺傳工程:原理和方法(Genetic Engineering !Principles and Methods),卷 1-4, Plenum Press,紐約。
本發(fā)明的啟動子是分離的核酸。此處使用的“分離的”核酸是當(dāng)通過重組體技術(shù)產(chǎn)生時，基本上沒有其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上沒有化學(xué)前體。而且，本發(fā)明分離的核酸基本上沒有所述核酸所來源生物的天然基因組中存在的側(cè)翼(即位于其5'或3'的序列)。
根據(jù)本發(fā)明，為了多樣化植物的表型，本發(fā)明的啟動子可以被置于與另一核酸有效聯(lián)結(jié)，用于在植物中對所述另一核酸的根-特異性的和/或線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。如此處使用的，術(shù)語“有效聯(lián)結(jié)”、“有效連接”和“相關(guān)聯(lián)”是可互換的，且表示啟動子和另一個核酸序列在單一核酸片段上的以下述方式功能性的連接，所述方式使得另一核酸轉(zhuǎn)錄是由該啟動子起始和介導(dǎo)的。通常，有效聯(lián)結(jié)的核酸是鄰近的。
另一個核酸序列包括，例如，可讀框、可讀框的一部分、編碼融合蛋白的核酸、反義序列、編碼雙鏈RNA序列的序列、轉(zhuǎn)基因等等。例如，另一個核酸可以編碼昆蟲抗性基因、細(xì)菌病抗性基因、真菌病抗性基因、病毒病抗性基因、線蟲病抗性基因、除草劑抗性基因、影響谷物組成或品質(zhì)的基因、營養(yǎng)物利用基因、真菌毒素減少基因、雄性不育基因、選擇性標(biāo)記基因、可篩選標(biāo)記基因、負(fù)選擇性標(biāo)記基因、正選擇性標(biāo)記基因、影響植物農(nóng)藝性狀的基因(即產(chǎn)量)、環(huán)境脅迫抗性基因(例如賦予對干旱、熱、寒冷、冷凍、過度濕潤、鹽脅迫或者氧化應(yīng)激的抗性或耐受性的基因)、改善淀粉特性或數(shù)量、油數(shù)量和品質(zhì)、氨基酸或蛋白質(zhì)組成的基因等等。
優(yōu)選地，另一個核酸編碼雙鏈RNA或反義核酸，其整個或部分地與形成或維持覓食部位所需的植物基因充分同一或者同源。另一個核酸可選擇性地編碼破壞植物寄生性線蟲生長、發(fā)育和/或繁殖的物質(zhì)(“線蟲毒性”)以減少農(nóng)作物的破壞。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何編碼對植物寄生性線蟲的線蟲毒性物質(zhì)的核酸。例如，線蟲毒性的另一個核酸可以編碼雙鏈RNA，其與與線蟲的生存、變態(tài)或繁殖必要的寄生性植物線蟲靶基因充分同一。如此處使用的，考慮到當(dāng)比較RNA和DNA序列時尿嘧啶取代胸腺嘧啶，術(shù)語“充分同一”和“對應(yīng)于”表示dsRNA的一條鏈的核苷酸序列與靶基因的20個或更多緊接的核苷酸具有至少大約80% -90%的同一，更優(yōu)選地，與靶基因的20個或更多緊接的核苷酸具有至少大約90-95%的同一，最優(yōu)選地，與靶基因的20個或更多緊接的核苷酸具有至少大約95-99%的同一或者完全同一。示例性的植物寄生性線蟲靶基因是例如在共同轉(zhuǎn)讓未決的美國專利申請公開號2005/188438中所示的，在此引用作為參考。另一個核酸可選擇地編碼雙鏈RNA，其與維持線蟲覓食部位所需的植物基因具有充分同一。
可選擇地，為了控制線蟲，被置于與本發(fā)明的啟動子有效聯(lián)結(jié)的另一個核酸可以編碼線蟲毒性蛋白質(zhì)。例如，編碼微生物毒素或其片段、源自昆蟲的毒素或其片段的核酸，比如描述在美國專利號 5，457，178,5, 695，954,5, 763，568,5, 959，182等等中的那些，用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。
作物植物和相應(yīng)的病原性線蟲列于美國植物病害索引(美國農(nóng)業(yè)部手冊號165，1960 年)(Index of Plant Diseases in the United States (U.S.Dept.0fAgricultureHandbook N0.165，1960))、北美洲植物寄生性線蟲種類的分布(線蟲學(xué)家協(xié)會，1985年)(Distribution of Plant-Parasitic Nematode Speciesin North America (Societyof Nematologists, 1985))和美國植物和植物產(chǎn)品的真菌(美國植物病理學(xué)協(xié)會，1989 年)(Fungi on Plants and Plant Productsin the United States (AmericanPhytopathological Society, 1989))中。例如，作為本發(fā)明目標(biāo)的植物寄生性線蟲包括，但不限于，孢囊線蟲和根節(jié)線蟲。作為本發(fā)明目標(biāo)的特定的植物寄生性線蟲包括，但不限于，大豆異皮線蟲(Heterodera glycines)、甜菜異皮線蟲(Heteroderaschachtii)、燕麥異皮線蟲(Heterodera avenae)、水稻異皮線蟲(Heterodera oryzae)、木豆抱囊線蟲(Heterodera cajani)、三葉異皮線蟲(Heterodera trifolii)、馬鈴薯白線蟲(Globodera pallida)、馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis)、或煙草球異皮線蟲(Globodera tabacum)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)、爪睡根結(jié)線蟲(M.javanica)、納西根結(jié)線蟲(M.naasi)、短小根結(jié)線蟲(M.exigua)、起域草莖線蟲(Ditylenchus dipsaci)、窄小莖線蟲(Ditylenchus angustus)、相似穿孔線蟲(Radopholus similis)、柑橘穿孔線蟲(Radopholus citrophilus)、多帶螺旋線蟲(Helicotylenchus multicinctus)、咖啡短體線蟲(Pratylenchus coffeae)、最短尾短體線蟲(Pratylenchus brachyurus)、傷殘短體線蟲(Pratylenchusvulnus)、彎曲針線蟲(Paratylenchus curvitatus)、玉米短體線蟲(Paratylenchus zeae)、腎形小盤旋線蟲(Rotylenchulus reniformis)、銀蓮花擬毛剌線蟲(Paratrichodorus anemones)、較小擬毛剌線蟲(Paratrichodorusminor)、克氏擬毛剌線蟲(Paratrichodorus christiei)、麥粒獲線蟲(Anguinatritici)、Bidera avenae、小麥根瘦線蟲(Subanguina radicicola)、塞氏紐帶線蟲(Hoplolaimus seinhorsti)、哥倫布紐帶線蟲(Hoplolaimus Columbus)、Hoplolaimus galeatus、半穿剌小墊刃線蟲(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘線蟲(Hemicycliophora arenaria)、椰子細(xì)桿刃線蟲(Rhadinaphelenchus cocophilus)、長尾剌線蟲(Belonolaimuslongicaudatus)、原始毛剌線蟲(Trichodorus primitivus)、異常珍珠線蟲(Nacoabbus aberrans)、貝氏滑刃線蟲(Aphelenchiodes besseyi)、卡納亞半輪線蟲(Hemicriconemoides kanayaensis)、克萊頓矮化線蟲(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲劍線蟲(Xiphinema americanum)、核桃固著線蟲(Cacopaurus pestis )等等。
通過包含本發(fā)明啟動子的核酸構(gòu)建體保護(hù)的農(nóng)作物包括，但不限于，大豆(G.max)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉(陸地棉(Gossypium hirsutum))、木薯(Manihot esculenta)、咖啡屬(咖啡屬物種(Cofea spp.))、椰子(Cocos nucifera)、鳳梨(Ananas comosus)、柑桔樹(柑桔屬物種(citrus spp.))、色蕉屬(色蕉屬物種(Musa spp.))、玉米(Zeamays)、油菜一包括卡諾拉油菜(蕓苔屬物種(Brassica spp.))、向日葵、高粱、小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、甜菜一包括糖蘿卜、和蔬菜比如青豆(greenbean)(菜豆(Phaseolus vulgaris))、皇帝豆(Phaseolus Iimensis)和豌豆(香豌豆屬物種(Lathyrus spp.))、煙草(Nicotiana tabacum)等等。
共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請題為“通過線蟲誘導(dǎo)的MtN21-樣基因”，USSN60/743，340，與USSN60/743，341在同一天提交，在此兩者都被引用作為參考，公開和要求保護(hù)了命名為大豆MtN-21的大豆基因，其在線蟲感染后形成的覓食細(xì)胞中被誘導(dǎo)(見SEQ ID NO:4-6) ο本發(fā)明的擬南芥啟動子(SEQ ID N0:1和2)代表大豆MtN_21編碼序列的擬南芥直向同源物的啟動子區(qū)域，且分離自如實(shí)施例1中公開的擬南芥基因組DNA。本發(fā)明的大豆MtN-21啟動子(SEQ ID NO:3)是分離自如實(shí)施例2中公開的大豆基因組DNA。如實(shí)施例3中所證明的，當(dāng)置于與GUS報(bào)道基因有效聯(lián)結(jié)時，本發(fā)明的擬南芥和大豆啟動子在線蟲侵染的大豆發(fā)根中上調(diào)。
因此本發(fā)明具體涉及啟動子，其包含如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的分離的核酸序列，或者SEQ ID NO:U SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3的最小啟動子片段，所述最小啟動子片段能夠驅(qū)動另一個核酸的根部特異性和/或線蟲可誘導(dǎo)的表達(dá)。本發(fā)明特異性的最小啟動子片段包括，但不限于，包含SEQ ID N0:1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；包含SEQ ID NO:2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；和包含SEQ ID NO:3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸。在此公開的方法可以用于分離SEQ ID N0:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的額外的最小片段，其能夠調(diào)節(jié)另一個核酸的根部特異性和/或線蟲可誘導(dǎo)的表達(dá)。
可選擇地，本發(fā)明的啟動子包含分離的核酸，其在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ IDNO=USEQ ID NO:2或者SEQ ID NO:3所示序列的核酸雜交。如此處使用的嚴(yán)格雜交條件是眾所周知的，包括，例如，400mM NaCl,40mM PIPES pH6.4, ImM EDTA，60°C雜交 12-16 小時；接著在0.1SSC和0.1% SDS中在大約65 °C下清洗大約15-60分鐘。本發(fā)明進(jìn)一步具體涉及在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:1所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸雜交的分離的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:2所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸雜交的核酸；和在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:3所示序列的第364至697位核苷酸的核酸雜交的核酸。
除包含SEQ ID NO:1_3中所示特定分離的序列的啟動子和其中包含的最小啟動子區(qū)域的啟動子，以及在嚴(yán)格條件下與包含SEQ ID NO:1-3中所示特定序列的啟動子雜交的啟動子之外，本發(fā)明包含此處所述的啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3的任何分離的核酸。這里使用的術(shù)語“啟動子構(gòu)型”描述了在啟動子序列內(nèi)以5'至3'方向排列的多個啟動子元件類別的特定結(jié)合，其中每個啟動子元件類別相對于每個其他的啟動子元件類別處于特定的空間方向。可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的許多方法鑒定啟動子元件。一種此類方法是利用Genomatix CoreSearch 算法(基因麥克軟件公司(GenomatixSoftware GmbH),慕尼黑,德國)。CoreSearch命名的規(guī)則利用“P”表示基于植物的啟動子元件和“U”鑒定使用者定義的啟動子元件。這些主要的識別符通過“$”從元件類型中分出來。元件類別在“ $ ”之后；例如，“0PAQ”、“MADS”或“MYBS”。
如圖15中所示，P$MADS啟動子元件類別被稱為“元件I”且通過元件描述符P$AGL2.01 例證，其具有共有序列 TNCCAWAWWTRGNAA(SEQ ID NO:17)，見 Huang H.，等(1996)Plant Cell 8:81-94。如圖15中“元件2”所示的P$MYBS啟動子元件類別通過元件描述符 P$0SMYBS.01 例證，其具有共有序列 SWSKTATCCATNYM(SEQ ID NO:18)，見 ToyofukuK.，等(1998)FEBSLett.428:275-280 ；Morita A.，等(1998)FEBS Lett.423:81-85 ；GublerF.,等(1992)Plant Cell 4:1435-1441 ;Lanahan Μ.Β.，等(1992)Plant Cell4:203-211；Huttly A .K.，等 Mol.Gen.Genet.(1988)214:232-240 ；Isabel-LaMoneda 1.，等(2003) Plant J.33:329-340 ;和 Lu C.A.，等(2002) Plant Cell 14:1963_1980。P$D0FF 啟動子元件類別通過元件描述01例證，其具有共有序列WNWAAAGNG(SEQ ID NO:19)且如圖 15 中“元件 3”所示，見 Yanagisawa S.，等Plant J.17:209-214 (1999)。P$0PAQ啟動子元件類別通過元件描述符P$02.02例證，其具有共有序列CCACGT (SEQ ID NO:20)且如圖15 中“元件 4”所示，見 Cord Neto G.，等(1995) Plant.Mol.Biol.27:1015-1029 ；VincentzΜ.，等(1997)Plant.Mol.Biol.34:879-889 ；Hwang Y.S.，等(2004)Plant CellPhysiol45:1509-1518。P$AHPB元件類別通過元件描述符P$WUS.01例證，其具有共有序列TTAATG(SEQ ID NO:21)，且如圖 15 中“元件 5” 所示，見 Hong R.L.，等(2003)Plant Cell15:1296-1309 ；Lohmann J.U.，等(2001)Cell 105:793_803。P$MADS 元件類別通過元件描述符P$MADSB.01例證，其具有共有序列WNCYAAAAATGSMAA(SEQ ID NO:22)，且如圖15中“元件 6” 所示，見 Riechmann J.L.，等(1996) Nucleic AcidsRes.24:3134-3141 ；Hill Τ.A.，等(1998) Development 125:1711-1721。P$AHPB 元件類別通過元件描述符 P$ATHB1.01 例證，其具有共有序列CAATTATT(SEQ ID NO:23)，且如圖15中“元件7”所示，見Sessa G.，等(1993) EMBO J.12:3507_3517。P$TBPF元件類別通過P$TATA.01元件描述符例證，其具有共有序列 YNMTATAMTANA(SEQ ID NO:24)，且如圖 15 中“元件8”所示，見Gidoni D.，等(1989)Mol.Gen.Genet.215:337-344 ;Yang H.，等(2000)Plant Mol.Biol.44:635-647 ；ChironΗ.，等(2000)Plant Physiol 124:865-872 ；Guerineau F.，等(2003)J.Exp.Bot.54:1153-1162 ；Haralampidis K.，等(2002)Plant Physioll29:1138-1149 ；Ishizaka T.，等(2003)Genes Genet.Syst.78:91-194 ；Hasegawa K.,等(2003)Plant J.33:1063-1072。P$AHPB元件類別通過P$ATHB9.01元件描述符例證，其具有共有序列GTAATGATTRC (SEQIDN0:25)，且如圖 15 中“元件 9”所示，見 Sessa G.，等(1998)Plant Mol.Biol.38:609_622。如圖15中“元件10”所示的P$D0FF元件類別通過元件描述符P$D0F2.01例證，其具有共有序列 WAAAGC(SEQ ID NO:26)，見 Yanagisawa S.，等(1999)Plant J.17:209_214。P$AHPB元件類別通過P$ATHB9.01元件描述符例證，其具有共有序列GTAATGATTRC (SEQID NO:27)，且如圖 15 中“元件 11”所示，見 Sessa G.，等(1998)Plant Mol.Biol.38:609_622。
啟動子構(gòu)型I的啟動子是分離的核酸，其具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$MADS類元件、負(fù)鏈上的P$MYBS類元件和正鏈上的P$D0FF類元件，其中P$MADS類元件在P$MYBS類元件的約50個核苷酸之內(nèi)，P$MYBS類元件在P$D0FF類元件的約50個核苷酸之內(nèi)，P$MADS類元件在P$D0FF類元件的約100個核苷酸之內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供植物啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸，該核酸組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$MADS類元件、負(fù)鏈上的P$MYBS類元件和正鏈上的P$D0FF類元件，其中通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
啟動子構(gòu)型2的啟動子是分離的核酸，其具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$0PAQ類元件、負(fù)鏈上的第一 P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件，正鏈上的第二 P$AHPB類元件和正鏈上的P$TBPF類元件，其中P$0PAQ類元件在第一 P$AHPB類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，第一 P$AHPB類元件在P$MADS類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，P$MADS類元件在第二 P$AHPB類元件的約60個核苷酸之內(nèi)，第二 P$AHPB類元件在P$TBPF類元件的約60個核苷酸內(nèi)，以及P$0PAQ類元件在P$TBPF類元件的約240個核苷酸內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供植物啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸，該核酸組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$0PAQ類元件、負(fù)鏈上的第一P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件、正鏈上的第二 P$AHPB類元件和正鏈上的P$TBPF類元件，其中通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
啟動子構(gòu)型3的啟動子是分離的核酸，其具有正鏈和負(fù)鏈，且組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$TBPF類元件、正鏈上的第一 P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件、正鏈上的第一 P$D0FF類元件、負(fù)鏈上的第二 P$D0FF類元件，以及正鏈上的第二 P$AHPB類元件，其中P$TBPF類元件在第一 P$AHPB類元件的約60個核苷酸內(nèi)，第一 P$AHPB類元件在P$MADS類元件的約60個核苷酸內(nèi)，P$MADS類元件在第一 P$D0FF類元件的約60個核苷酸內(nèi)、第一 P$D0FF類元件在第二 P$D0FF類元件的約60個核苷酸內(nèi)，第二 P$D0FF類元件在第
二P$AHPB類元件的約60個核苷酸內(nèi)，以及P$TBPF類元件在第二 P$AHPB類元件的約300個核苷酸內(nèi)。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供植物啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸，該核酸組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$TBPF類元件、正鏈上的第一P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件、正鏈上的第一 P$DOFF類元件、負(fù)鏈上的第二 P$DOFF類元件和正鏈上的第二 P$AHPB類元件，其中通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸的植物啟動子，該核酸在相同鏈上組合地以Y至:V順序包含一個或多個P$MADS類元件和至少一個P$TBPF類元件，其中通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸的植物啟動子，該核酸在相同鏈上組合地以5'至3'順序包含P$MADS類元件，接著是P$TBPF類元件，接著是第二 P$MADS類元件，其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在還有另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸的植物啟動子，該核酸在相同鏈上組合地以5'至3'順序包含第一 P$MADS類元件，接著在約100個核苷酸之內(nèi)類元件，接著在約200個核苷酸之內(nèi)是第二 P$MADS類元件，第一 P$MADS類元件是在第二 P$MADS類元件的約300個核苷酸之內(nèi)，并且其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸的植物啟動子，該核酸在相同鏈上組合地以5'至3'順序包含具有元件描述符P$MADSB.01的第一 P$MADS類元件、具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF類元件和具有元件描述符P$AGL2.01的第二P$MADS類元件，其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在還有另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含具有正鏈和負(fù)鏈的核酸的植物啟動子，該核酸在相同鏈上組合地以Y至:V順序包含具有元件描述符P$MADSB.01的第一 P$MADS類元件，接著在約100個核苷酸之內(nèi)是具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF類元件，且接著在約200個核苷酸之內(nèi)是具有元件描述符P$AGL2.01的第二 P$MADS類元件，第一 P$MADS類元件在第二 P$MADS類元件的約300個核苷酸之內(nèi)，且其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
本發(fā)明也具體涉及包含本發(fā)明啟動子的表達(dá)盒。“表達(dá)盒”在本文中概括地理解為包含該盒中含有的所有序列，其可以影響感興趣的核酸的轉(zhuǎn)錄，以及若適當(dāng)?shù)脑挘浞g。除本發(fā)明的啟動子之外，本發(fā)明的表達(dá)盒還可以包含改善啟動子功能的調(diào)控元件、允許在原核和/或真核生物中轉(zhuǎn)錄和 /或翻譯的遺傳元件，和下游的(在3'-方向)調(diào)控元件比如轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列。本發(fā)明表達(dá)盒的各種元件是順序地且有效地連接在一起。
因此，本發(fā)明的表達(dá)盒可以包含選自以下的分離的核酸:具有如SEQ ID NO:1中所示序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:1中所示序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:1中所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:1中所示序列的第1554至1887位核苷酸的核酸雜交的核酸；具有如SEQ IDNO:2中所示序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:2中所示序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:2中所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:2中所示序列的第1569至1902位核苷酸的核酸雜交的核酸；具有如SEQ IDNO:3中所示序列的核酸；在嚴(yán)格條件下與具有如SEQ ID NO:3中所示序列的核酸雜交的核酸；包含如SEQ ID NO:3中所示序列的第364至697位核苷酸的核酸；在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:3中所示序列的第364至697位核苷酸的核酸雜交的核酸；啟動子構(gòu)型I的核酸；啟動子構(gòu)型2的核酸和啟動子構(gòu)型3的核酸。可選擇地，本發(fā)明的表達(dá)盒包含選自以下的啟動子:(a)具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$MADS類元件、負(fù)鏈上的P$MYBS類元件和正鏈上的P$DOFF類元件；(b)具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$OPAQ類元件、負(fù)鏈上的第一 P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件，正鏈上的第二 P$AHPB類元件和正鏈上的P$TBPF類元件；和(c)具有正鏈和負(fù)鏈的分離的植物啟動子，該啟動子組合地以5'至3'順序包含正鏈上的P$TBPF類元件、正鏈上的第一 P$AHPB類元件、正鏈上的P$MADS類元件、正鏈上的第一 P$DOFF類元件、負(fù)鏈上的第二 P$DOFF類元件，以及正鏈上的第二 P$AHPB類元件；其中通過植物寄生性線蟲在植物的根部誘導(dǎo)該啟動子。
可選擇地，本發(fā)明的表達(dá)盒包含啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸在相同鏈上組合地以Y至:V順序包含一個或多個P$MADS類元件和至少一個P$TBPF類元件，其中通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒包含啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸在相同鏈上組合地以5'至3'順序包含卩$祖03類元件，接著類元件，接著是第二 P$MADS類元件，其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在還有另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒包含啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸在相同鏈上組合地以Y至:V順序包含第一 P$MADS類元件，接著在約100個核苷酸之內(nèi)是P$TBPF類元件，接著在約200個核苷酸之內(nèi)是第二 P$MADS類元件，第一 P$MADS類元件是在第二 P$MADS類元件的約300個核苷酸之內(nèi)，并且其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒包含啟動子，其包含具有正鏈和負(fù)鏈的分離的核酸，該核酸在相同鏈上組合地以5'至3'順序包含具有元件描述符P$MADSB.01的P$MADS類元件、具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF類元件和具有元件描述符P$AGL2.01的？$祖05類元件，其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。在還有另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)盒包含啟動子，其包含分離的核酸，其在相同鏈上組合地以5'至:V順 序包含具有元件描述符P$MADSB.01的P$MADS類元件，接著在約100個核苷酸之內(nèi)是具有元件描述符P$TATA.01的P$TBPF類元件，且接著在約200個核苷酸之內(nèi)是具有元件描述符P$AGL2.01的P$MADS類元件，第一個P$MADS類元件在第二個P$MADS類元件的約300個核苷酸之內(nèi)，其中可能有其它元件插入且通過植物寄生性線蟲在植物根部中誘導(dǎo)該啟動子。
本發(fā)明的表達(dá)盒中可任選包括的特定的遺傳元件包括，但不限于，容許在細(xì)菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，例如，源自PBR322或P15A ori的ORI區(qū)域；或者土壤桿菌(Agrobacterium)TDNA轉(zhuǎn)移所需的元件，比如，例如，T-DNA的左邊界和/或右邊界。本發(fā)明的表達(dá)盒的其它組分可以包括，但不限于，額外的調(diào)控元件比如，例如，增強(qiáng)子、內(nèi)含子、多聚接頭、多克隆位點(diǎn)、操縱基因、阻遏物結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等等。示例性的的增強(qiáng)子包括源自CaMV35S啟動子、章魚堿合酶基因(Ellis等人，1987)、水稻肌動蛋白I基因、玉米醇脫氫酶基因(Callisl987)、玉米皺縮I基因(Vasi11989)、TMV Omega元件(Galliel989)的元件和源自非植物的真核生物(例如酵母；Mal988)的啟動子。示例性的植物內(nèi)含子序列包括源自Adhl、bronzel、肌動蛋白1、肌動蛋白2 (W000/760067)的內(nèi)含子或鹿糖合酶內(nèi)含子；MMaize Handbook,第 116 章,Freeling 和 Walbot,編著，Springer,紐約(1994)。
病毒的前導(dǎo)序列也可以通過本發(fā)明的表達(dá)盒增強(qiáng)感興趣的核酸的轉(zhuǎn)錄。例如，源自煙草花葉病毒(TMV)、玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列已經(jīng)證明在增強(qiáng)表達(dá)方面是有效的。本領(lǐng)域已知的其它前導(dǎo)序列包括但不限于:小RNA病毒前導(dǎo)序列，例如，腦心肌炎病毒(EMCV)前導(dǎo)序列；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，煙草蝕刻病毒(TEV)前導(dǎo)序列；MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮縮花葉病毒)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)前導(dǎo)序列，源自苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白mRNA的未翻譯的前導(dǎo)序列(AMV RNA4)。
本發(fā)明的表達(dá)盒也可以包含轉(zhuǎn)錄終止元件或聚腺苷酸化信號。示例性的轉(zhuǎn)錄終止元件包括源自根癌土壤桿菌的胭脂堿合酶基因(Bevanl983)的那些、用于根癌土壤桿菌的章魚堿合酶基因的T7轉(zhuǎn)錄物的終止子，和馬鈴薯或番茄的蛋白酶抑制劑I或II基因的3'末端。
待被轉(zhuǎn)錄成RNA且任選地表達(dá)成蛋白質(zhì)的另一核酸被插入到本發(fā)明的表達(dá)盒中用于轉(zhuǎn)化生物。根據(jù)本發(fā)明，另一核酸序列以與之共價連接地被置于本發(fā)明啟動子的下游(即以3'方向)和轉(zhuǎn)錄終止元件的上游。優(yōu)選地，本發(fā)明的另一核酸序列和啟動子之間的距離不多于200個堿基對,更優(yōu)選地不多于100個堿基對,最優(yōu)選地不多于50個堿基對。
本發(fā)明的表達(dá)盒也可以通過將本發(fā)明的啟動子插入到植物基因組中進(jìn)行裝配。這樣的插入將導(dǎo)致與對于基因組而言天然的感興趣的核酸序列的有效連接。由于本發(fā)明啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性，通過線蟲誘導(dǎo)后，這樣的插入使得感興趣的核酸優(yōu)先在根組織中表達(dá)或過量表達(dá)。該插入可以是被指導(dǎo)的或偶然的。優(yōu)選地該插入是被指導(dǎo)的且通過例如同源重組實(shí)現(xiàn)。通過這種方法，天然的啟動子可以被本發(fā)明的啟動子替代，由此修飾內(nèi)源基因的表達(dá)模式。該啟動子也可以以表達(dá)內(nèi)源基因的反義mRNA的方式被插入，由此誘導(dǎo)基因沉默。
本發(fā)明的表達(dá)盒可被插入到重組載體、質(zhì)粒、黏粒、YAC(酵母人工染色體)、BAC (細(xì)菌人工染色體)或者適于轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的任何其它載體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時，該表達(dá)盒或載體可被插入到轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的基因組中?？蛇x擇地，該表達(dá)盒或載體可在染色體外維持。本發(fā)明的表達(dá)盒或載體可以存在于植物細(xì)胞的細(xì)胞核、葉綠體、線粒體和/或質(zhì)體中。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)盒或載體被插入到植物細(xì)胞的細(xì)胞核的染色體DNA中。
本發(fā)明的表達(dá)盒可被轉(zhuǎn)化入植物中以提供轉(zhuǎn)基因植物，其包含與本發(fā)明植物啟動子有效聯(lián)結(jié)的另一核酸。該實(shí)施方案的轉(zhuǎn)基因植物包含啟動子，其包含如SEQ ID NO=USEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核酸序列，SEQ ID NO:1的最小啟動子片段、SEQ ID NO:2的最小啟動子片段或SEQID NO:3的最小啟動子片段?？蛇x擇地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物包含核酸，其在嚴(yán)格條件下與包含如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示核酸序列，SEQID NO:1的最小啟動子片段、SEQ ID NO:2的最小啟動子片段或SEQ ID NO:3的最小啟動子片段的啟動子雜交。在另一個實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物包含啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2或啟動子構(gòu)型3的啟動子。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是利用植物生物工程領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)化方法制造的。任何方法都可以用來將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞中以生產(chǎn)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包括植物細(xì)胞的宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)姆椒稍诶鏢ambrook等,見上、和其它實(shí)驗(yàn)室手冊比如分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology), 1995,44卷、土壤桿菌規(guī)程(Agrobacterium protocols),編著:Gartland 和 Davey, Humana Press, Totowa,新澤西州中找到。
用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的一般方法也公開了，例如在美國專利號4，940，838、5，464，763中等等。用于轉(zhuǎn)化特定的雙子葉植物例如棉的方法在美國專利號5，004, 863、5，159，135和5，846，797中提出了。大豆轉(zhuǎn)化方法在美國專利號4，992，375、5，416，011、5，569，834,5, 824,877,6, 384，301和在EP0301749B1中提出了。其它的植物轉(zhuǎn)化方法在例如美國專利號 4，945，050,5, 188，958,5, 596，131,5, 981，840 等中公開了。
利用 已知的植物育種方法，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以與相似的轉(zhuǎn)基因植物或與缺乏本發(fā)明的啟動子和另一核酸的植物雜交，以制備種子。然后種植該種子以獲得包含感興趣的核酸和本發(fā)明啟動子的雜交的能育的轉(zhuǎn)基因植物。該植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。該雜交的能育的轉(zhuǎn)基因植物可具有通過母本或通過父本遺傳的特定的表達(dá)盒。第二種植物可以是近交植物。該雜交的能育的轉(zhuǎn)基因可以是雜種。任何這些雜交的可繁殖的轉(zhuǎn)基因植物的種子也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明還具體涉及包含大多數(shù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物(一起種植在農(nóng)田中)的農(nóng)作物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可以用于控制由植物寄生性線蟲侵襲農(nóng)作物的方法，其包含從種子生長成所述農(nóng)作物的步驟，該種子包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含本發(fā)明的植物啟動子與另一核酸有效聯(lián)結(jié)，所述另一核酸編碼破壞所述植物寄生性線蟲的生長、發(fā)育和/或繁殖的物質(zhì)，其中該表達(dá)盒穩(wěn)定地整合到該種子的基因組中。這樣的線蟲毒性的破壞物質(zhì)包括，但不限于，與寄生性植物線蟲的靶基因(對于線蟲的生長、變態(tài)或繁殖至關(guān)重要)充分同一的雙鏈RNA ;與維持線蟲覓食部位所需的植物基因充分同一的雙鏈RNA ;微生物毒素；源自昆蟲的毒素等等。
以下實(shí)施例不是想要限制本發(fā)明權(quán)利要求
的范圍，而是意指某些實(shí)施方案的示例。在該舉例說明的方法中任何對于熟練的技術(shù)人員來說能夠想到的變化都屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例1:源自擬南芥的植物藥物/代謝物輸出基因啟動子的克隆
利用Qiagen DNAeasy Plant Minikit (強(qiáng)基因公司(Qiagen))提取擬南芥(Columbia生態(tài)型)基因組DNA。利用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增方案克隆1，967bp (SEQ ID NO:1)和l，950bp(SEQ ID NO:2)基因組DNA區(qū)域(推定的啟動子序列)，其正好位于ATG密碼子的上游，包括5'-非翻譯區(qū)，分別對應(yīng)于具有基因座識別符Atlg21890和At4g08290的擬南芥植物代謝物輸出基因。為此，在PCR反應(yīng)中將大約0.1 μ g擬南芥基因組DNA用作DNA模板。用于擬南芥啟動子序列的PCR擴(kuò)增的引物示于圖11，且是根據(jù)擬南芥基因組序列數(shù)據(jù)庫(TAIR)設(shè)計(jì)的。由SEQ ID NOjPSEQ ID NO:9所述的引物序列包含PstI限制性位點(diǎn)以便于克隆。由SEQ ID NO:8和SEQ ID NO: 10所述的引物序列包含AscI位點(diǎn)以便于克隆。由SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所述的引物序列用于擴(kuò)增擬南芥基因座Atlg21890的啟動子區(qū)域。由SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所述的引物序列用于擴(kuò)增擬南芥基因座At4g08290的啟動子區(qū)域。[0102]擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含如下:2.5μ IlOXHot Start緩沖液；0.15 μ I HotStart TaqDNA 聚合酶；0.5μ IlOmM dNTP ;0.5 μ 110 μ M 引物 A ;0.5 μ 110 μ M 引物 B ; 1.0 μ I 擬南芥基因組 DNA(大約 IOOng) ；19.85 μ I 水。熱循環(huán)儀:T3Thermocycler Biometra,德國，用于擴(kuò)增，利用以下設(shè)置:以94°C 900秒進(jìn)行I個循環(huán)；以94°C 30秒、52°C 30秒和72°C 120秒進(jìn)行5個循環(huán)；以94°C 30秒、62°C 30秒和72 °C 120秒進(jìn)行30個循環(huán)；以72°C 300秒進(jìn)行I個循環(huán)。
每個PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增的DNA片段大小，通過標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳和通過Qiagen凝膠提取試劑盒(強(qiáng)基因公司(Qiagen)，Hilden，德國)從凝膠中提取的DNA來檢驗(yàn)。將純化的片段按照廠商說明(英杰生命技術(shù)公司(InvitiOgen))利用TOPO TA克隆試劑盒TOPO克隆入pCR2.1中。將該克隆片段利用Applied Biosystem373A (ABI)自動測序儀進(jìn)行測序，并通過利用來自序列分析工具Vector NTI的序列比對clustalW來檢驗(yàn)預(yù)期的序列。對應(yīng)于 Atlg21890 和 At4g08290 的啟動子區(qū)域的 I, 967bp 和 I, 950bp DNA 片段如 SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。為利于克隆而在引物中引入的限制性位點(diǎn)不包括在該序列中。
實(shí)施例2:源自大豆的MtN21_樣代謝物輸出基因啟動子的克隆
如在此處以其整體引入本文作為參考的共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請USSN60/743, 340中更加充分的描述的，利用生物信息學(xué)方法，兩種編碼大豆MtN21同源物即 GmMtN21-l(GM50862200，SEQ ID NO:5)和 GmMtN21_2 (GM50444087，SEQ ID NO:4)的多核苷酸在SCN感染的大豆根部的合胞體中被鑒定為上調(diào)。圖4描述了 GmMtN21-l和GmMtN21-2的序列。GmMtN21-2cDNA序列(SEQ ID NO:4)被確定為全長，因?yàn)橛幸粋€起始于bp59上游的TAG終止密碼子，以及在相同的讀框中開始于堿基對74的編碼的Mtn21可讀框的ATG起始密碼子。GmMtN21-2(被稱為 GM50444087，SEQ ID NO:4)和 GmMtN21_l (被稱為 GM50862200，SEQID NO:5)的序列比對示于圖12，表明GmMtN21_l可能是在N-末端缺失大約200個氨基酸的部分序列。
克隆GmMtN21的啟動子序列，根據(jù)廠商說明使用Universal GenomeffalkingKit (克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)室公司(Clontech Laboratories Inc.), PaloAlto,加利福尼亞州)。為此，利用 Qiagen DNAeasy Plant Minikit (強(qiáng)基因公司(Qiagen))提取大豆(大豆,Resnik)基因組DNA。該方法由兩個PCR擴(kuò)增組成，利用銜接引物和基因的引物用于每一個擴(kuò)增反應(yīng)。用于分離本發(fā)明啟動子的引物序列示于圖11。靶向GmMtN21-2(SEQ ID NO:4)的基因特異性引物是初級引物GmMtN21-2GW(SEQ ID NO: 11)和嵌套引物GmMtN21_2GWnest (SEQ IDNO:12) ο 使用的銜接引物是 GmMtN21-2GW API (SEQ ID NO: 13)和 GmMtN21_2GW AP2 (SEQIDNO:14)。利用這個方案，分離和測序一些克隆。
最長的克隆產(chǎn)物被鑒定為pAW121 (SEQ ID NO:6)。PAW121與GmMtN21_2的序列比對表明該克隆與如圖5所示的GmMtN21-2(SEQ IDNO:4)高度同源但不是一致的。因此，PAW121序列可能源自于GmMtN21-2的同源物，因而命名為GmMtN21_3。該比對也顯示了PAW121包含編碼區(qū)中第1101至1223位核苷酸的122個堿基對的內(nèi)含子和ATG的上游第126至916位核苷酸的791bp的啟動子序列(參見圖13)。該啟動子區(qū)域是利用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)和引物 GmMtN21-3promFor(SEQ IDNO:15)和 GmMtN21-3promRev (SEQ ID NO:16)從pAW121 中克隆的。GmMtN21-3promFor 和 GmMtN21-3promRev 分別攜帶有 PstI 和 AscI 的限制性酶切位點(diǎn)以便于定向克隆。不帶有用于克隆的限制性位點(diǎn)的GmMtN21-3啟動子和5' UTR序列如SEQ ID NO:3所示。核苷酸序列1_697代表整個啟動子序列，其具有跨度為第364-697位核苷酸的核心啟動子區(qū)域。TATA信號跨越第664-670位核苷酸并且mRNA的5’未翻譯前導(dǎo)序列是從核苷酸697-791。
實(shí)施例3:用于轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因發(fā)根的二元載體的構(gòu)建
為評價該克隆的啟動子的表達(dá)活性，在⑶S報(bào)道基因(細(xì)菌葡糖醛酸糖苷酶或⑶ S 基因(Jefferson (1987) EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了對應(yīng)于 SEQ ID NO:1的第1-1967位核苷酸、SEQ ID NO:2的第1-1947位核苷酸和SEQ ID NO:3的第1-791位核苷酸的基因片段，以分別產(chǎn)生二元載體pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz，如圖6至8所示。二元載體中植物選擇標(biāo)記是源自擬南芥的突變的AHAS基因，其賦予針對除草劑ARSENAL(滅草煙，BASF公司，F(xiàn)lorham Park，NJ)的耐受性。該選擇性標(biāo)記——突變的AHAS是由擬南芥AHAS啟動子驅(qū)動的。
大豆胞囊線蟲可以在正常的大豆根部外植體上繁殖。然而，該技術(shù)要求持續(xù)建立根部外植體，因?yàn)檫@些器官在培養(yǎng)中具有限定性的生長期。相反，通過用發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)侵染大豆子葉而產(chǎn)生的大豆發(fā)根顯示出在組織培養(yǎng)中無限生長，這給用于單種繁殖和大豆胞囊線蟲的研究的正常根部外植體提供了替代(Cho等，(1998)PlantSc1.138，53-65)。發(fā)根土壤桿菌可以反向轉(zhuǎn)移二元載體的T-DNA，由此能產(chǎn)生包含在T-DNA質(zhì)粒中插入的外源基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。該方法已經(jīng)被用于生產(chǎn)一些植物種中的轉(zhuǎn)基因根部(Christey, (1997)Doran, P.Μ.(編著)發(fā)根:培養(yǎng)和應(yīng)用(Hairyroots:culture andapplication), Harwood,阿姆斯特丹,第99-111頁)。然后轉(zhuǎn)基因發(fā)根可以用于研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)對于任何給定的表型的影響。
在本實(shí)施例中，通過電穿孔將二元載體pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz轉(zhuǎn)化到發(fā)根土壤桿菌K599株中(Cho等，見上)。轉(zhuǎn)化的土壤桿菌利用以下方案用于誘導(dǎo)大豆發(fā)根形成。在發(fā)根土壤桿菌接種前約五天，將大豆栽培種Williams82(SCN易感染的)的種子用10%漂白劑滅菌10分鐘，并在1%瓊脂上在25°C每天16小時光照下發(fā)芽。在發(fā)根土壤桿菌接種前約三天，將包含二元載體的發(fā)根土壤桿菌菌株K599的冷凍原種在LB+卡那霉素(50yg/ml)平板上劃線并在28°C下在黑暗中培養(yǎng)。在發(fā)根土壤桿菌接種前約一天，從平板中挑取菌落并接種到液體LB+卡那霉素(50yg/ml)中。在28°C下?lián)u動培養(yǎng)物約16小時。將液體培養(yǎng)物中發(fā)根土壤桿菌的濃度調(diào)至0D_ = 1.0。
從大豆幼苗中切除子葉并將近軸側(cè)用解剖刀割幾次。將15μ I發(fā)根土壤桿菌懸液接種在創(chuàng)傷的表面上，并將子葉以近軸側(cè)向上放在1%瓊脂平板上3天(在25°C每天16小時光照下)。然后將子葉轉(zhuǎn)移到包含500 μ g/ml羧芐青霉素(以抑制發(fā)根土壤桿菌)和I μ M ARSENAL的MS平板上。在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)子葉2星期之后，發(fā)根從創(chuàng)傷部位被誘導(dǎo)。收獲抗ARSENAL且在選擇培養(yǎng)基上生長的根部并將其轉(zhuǎn)移到新鮮的同樣成分的選擇培養(yǎng)基上，并在25°C下在黑暗中培養(yǎng)。在收獲發(fā)根并在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)它們兩周后，將發(fā)根在包含羧芐青霉素500 μ g/ml而沒有ARSENAL的MS培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例4:在大豆發(fā)根中啟動子活性的檢測
如實(shí)施例3中所示， 將本發(fā)明的啟動子與GUS報(bào)道基因有效聯(lián)結(jié)以測定它們的表達(dá)活性。在植物中借助于顯色物質(zhì)比如5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-葡糖醛酸(X-Gluc)在活性染色反應(yīng)中，可以檢測GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(Jefferson，見上)。[0115]為研究在存在和缺少線蟲感染中SEQ ID NO:1_3的啟動子活性，從用pAW134qCZ、pAW219qcz和pAW223qcz轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生了一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系。在傳代培養(yǎng)約三周后，將MS上的轉(zhuǎn)基因發(fā)根品系用表面凈化的SCN品種3的J2以每平板2000個J2水平接種。在接種后7和12天(DAI)，通過從瓊脂平板中移除來收獲根部，并將其在水中隨著變化溫和清洗，并在包含X-Gluc(2mg/1)的⑶S染色溶液中在37°C下染色16小時。在接種后每一時間點(diǎn)，每個品系的非接種的對照平板也在GUS染色溶液中染色。在GUS染色之后，在酸性品紅中染色根部，然后脫色以顯現(xiàn)線蟲，其被染成紅色。然后在顯微鏡下觀察根部以檢測GUS表達(dá)。
對于每個轉(zhuǎn)基因品系，在感染后7和12天(DAI)觀察10個隨機(jī)挑取的合胞體并對GUS表達(dá)的強(qiáng)度計(jì)分。使用以下計(jì)分指標(biāo)為沒有GUS染色，“ + ”為弱的GUS染色，和“++”為強(qiáng)的GUS染色。10個計(jì)數(shù)的大概平均值用于測定該品系的合胞體中的GUS表達(dá)水平。此外，在相同品系中對于其它的根部組織比如愈傷組織、根尖、維管結(jié)構(gòu)、皮層和原基，⑶S表達(dá)水平也用相同的⑶S計(jì)分指標(biāo)記錄即”和“++”。用pAW134qcz、pAW219qcz和pAW223qcz轉(zhuǎn)化的品系的結(jié)果顯示于圖9中。
為了更精確地定義Atlg21890(SEQ ID NO:1)的啟動子區(qū)域，測試上游序列的更短片段。約IOOObp和500bp的序列都能在合胞體中賦予線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，表明在起始密碼子的上游500bp區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了所有需要的調(diào)控元件。這些結(jié)果與利用實(shí)施例6中所示的Genomatix分析啟動子的結(jié)果是一致的。
⑶S染色的結(jié)果表明對于測試的大多數(shù)品系，PAW134中的啟動子片段在7DAI和12DAI的合胞體中顯示出中 間到強(qiáng)的GUS表達(dá)。相反，在其它根部部分比如根尖和根部皮層中，GUS表達(dá)未被檢測到或是非常弱的。然而，在線蟲接種的和對照非接種樣品中，在維管組織中都存在一些啟動子的表達(dá)。
實(shí)施例5:啟動子的PLACE分析
PLACE分析結(jié)果表明TATA框位于如圖1所示的SEQ ID NO:1的第1854位堿基對至第1860位堿基對。結(jié)果，5'非翻譯區(qū)開始于約第1887位堿基對。TAIR網(wǎng)址也預(yù)測5'非翻譯區(qū)開始于第1887位堿基對。由SEQ IDNO:1描述的序列終止于ATG起始密碼子之前的第O個堿基對。由SEQID NO:1描述的啟動子的潛在核心區(qū)域是從第1554位至1887位喊基。
PLACE分析結(jié)果表明TATA框位于如圖2所示的SEQ ID NO: 2的第1869位堿基對至第1875位堿基對。結(jié)果，5'非翻譯區(qū)開始于約第1902位堿基對。TAIR網(wǎng)址預(yù)測5'非翻譯區(qū)開始于第1766位堿基對。由SEQ IDNO:2描述的序列終止于ATG起始密碼子之前的第O個堿基對。由SEQID NO:2描述的啟動子的潛在核心區(qū)域是從第1569位至1902位堿基。
PLACE結(jié)果表明TATA框位于如圖3所示的SEQ ID NO:3的第664位堿基對至第670位堿基對。結(jié)果，5'非翻譯區(qū)開始于約第697位堿基對。由SEQ ID NO:3描述的啟動子的潛在核心區(qū)域是從第364至697位堿基。
實(shí)施例6:啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3的鑒定
Genomatix 是包含 DiAlign 和 FrameWorker (基諾麥替克斯公司(Genomatrix),慕尼黑，德國)算法的啟動子序列分析軟件應(yīng)用。DiAlign是多重序列對比工具，而FrameWorker可以針對方向和距離相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(啟動子元件類別)掃描一組DNA序列。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 的:V 端的 650bp 用于兩次上述Genomatix分析。這對應(yīng)于SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基、SEQ ID NO:2的第1298至1947位堿基和SEQ ID NO:3的第142至791位堿基。
使用Genomatix DiAlign 程序以測定 SEQ ID NO:1 的第 1318 至 1967 位堿基、SEQ ID NO:2的第1298至1947位堿基和SEQ ID NO:3的第142至791位堿基之間是否存在序列同源性。該分析的結(jié)果顯示于圖14中。該分析顯示了 SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基與SEQ ID NO:3的第142至791位堿基最類似(24%序列同一性)。因此，利用 GenomatixFrameWorker 算法將 SEQ ID NO:1 的第 1318 至 1967 位堿基與 SEQ IDNO:3 的第142至791位堿基相比較，以利用默認(rèn)參數(shù)確定植物啟動子元件類別的共同結(jié)構(gòu)。在該分析中鑒定了多個啟動子構(gòu)型模型。
進(jìn)行額外的分析，將啟動子元件之間的距離從50bp (默認(rèn))擴(kuò)展到60bp。這一第二種分析也產(chǎn)生多個啟動子構(gòu)型模型。如圖10中所總結(jié)的，產(chǎn)生了啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3，其分別包含3個、5個和6個啟動子元件。包含3個啟動子元件類別的模型被指定為啟動子構(gòu)型I。包含5個啟動子元件類別的模型被指定為啟動子構(gòu)型2。包含6個啟動子元件類別的模型被指定為啟動子構(gòu)型3。包含在SEQ ID NO:1和SEQID NO:3的啟動子序列中的啟動子元件類別的位置分別顯示在圖1和圖3中。此外，圖15顯示了在所有三個啟動子構(gòu)型中啟動子元件類別的共同空間定向。
實(shí)施例7:克隆Atlg21890(SEQ ID NO:1)啟動子的缺失
為了進(jìn)一步定義Atlg21890(SEQ ID NO:1)的啟動子區(qū)域，產(chǎn)生了總共八個包含擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的啟動子缺失片段的構(gòu)建體。所有啟動子缺失構(gòu)建體被包含在相同的載體主鏈中如圖6中所示的pAW134qcz。這些構(gòu)建體的結(jié)果被用于確定啟動子構(gòu)型1、啟動子構(gòu)型2和啟動子構(gòu)型3中描述的元件(參見圖15)是否對在SCN覓食部位中驅(qū)動表達(dá)是必需的。啟動子缺失構(gòu)建體的概述描述于圖16中。產(chǎn)生了包含擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的第1318至1967位堿基的650bp的啟動子片段(含有圖15中描述的啟動子元件I到11)，并通過構(gòu)建體RTJ137來表示。利用Genomatix軟件，該啟動子區(qū)域用于產(chǎn)生圖15中描述的啟動子構(gòu)型。產(chǎn)生了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ IDNO:1)的第1318至1637位堿基和第1653至1967位堿基(包含啟動子元件1、2、3、4、5、6、7、9、10和11)的635bp啟動子片段，并通過構(gòu)建體RTJ141表示。產(chǎn)生了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的第1318至1713位堿基和第1735至1967位堿基(包含啟動子元件2、3、4、5、6、7、8、9、10和11)的629bp啟動子片段，并通過構(gòu)建體RTJ142表示。產(chǎn)生了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ IDNO:1)的第1526至1967位堿基和含有圖15中描述的啟動子元件1、2、3、5、6、7、8、9、10和11的442bp啟動子片段，并通過構(gòu)建體PAW329表示。通過構(gòu)建體RTJ133表示了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的第1556至1967位堿基和含有啟動子元件
1、2、3、6、7、8、9、10和11的412bp的啟動子片段。通過構(gòu)建體RTJ134表示了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的第1603至1967位堿基和含有啟動子元件1、2、3、8、9、10和11的365bp的啟動子片段。通過構(gòu)建體RTJ135表示了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的第1653至1967位堿基和含有啟動子元件1、2、3、9、10和11的315bp的啟動子片段。通過構(gòu)建體RTJ136表示了包括擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQID NO:1)的第1710至1967位堿基和含有啟動子元件1、2、3、10和11的258bp的啟動子片段。總之，構(gòu)建體RTJ141和RTJ142中包含的兩個啟動子缺失片段是通過在每一構(gòu)建體中除去單一元件而獲得的，以確定任何一個元件對在SCN覓食部位中啟動子的活性是否是必需的。六個啟動子缺失構(gòu)建體(RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135和RTJ136)是通過生成所述擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的5'截短而獲得的。
利用DNA合成以產(chǎn)生包含在RTJ141和RTJ142中的兩個啟動子缺失片段。啟動子缺失片段與RTJ137除了它們?nèi)笔缟纤龅膯我粏幼釉馐窍嗤?。將PstI和AscI引入到合成的片段中以便于克隆。
為產(chǎn)生六個擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID N0:1)的5'截短，利用Qiagen質(zhì)粒miniprep 試劑盒(強(qiáng)基因公司(Qiagen))從大腸桿菌(E.coli)中提取pAW134qcz的質(zhì)粒DNA。利用標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增方案擴(kuò)增包含在pAW134qCZ中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQ ID NO:1)的啟動子缺失片段。為此，在PCR反應(yīng)中用約0.1 μ g的pAW134qCZ質(zhì)粒DNA(圖6中描述的)作為DNA模板。用于PCR擴(kuò)增擬南芥啟動子序列的引物顯示于圖11中，且是基于包含在pAW134qcz中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子(SEQID NO:1)的啟動子序列而設(shè)計(jì)的。由 SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:3U SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33描述的引物序列包含PstI限制性位點(diǎn)以便于克隆。由SEQ ID N0:34描述的引物序列在pAW134qcz中AscI位點(diǎn)的下游退火，使得在擴(kuò)增的片段中將包含AscI位點(diǎn)以便于克隆。由SEQ IDN0:28和SEQ ID N0:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qcz中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的650bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生RTJ137。由SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qcz中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的442bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生pAW3290由SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qcz中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的412bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生RTJ133。由SEQID NO:31和SEQ ID NO:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qCZ中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的365bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生RTJ134。由SEQ ID NO:32和SEQID NO:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qCZ中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的315bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生RTJ135。由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34描述的引物序列用于擴(kuò)增包含在pAW134qcz中的擬南芥基因座Atlg21890啟動子的258bp的啟動子缺失區(qū)域，用于產(chǎn)生RTJ136。
擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含如下:2.5 μ IlOXPfu Turbo緩沖液;0.5 μ I PfuTurbo DNA聚合酶；0.5μ IlOmM dNTP ；0.5 μ 110 μ M 弓丨物 A ；0.5μ 110 μ M 弓丨物 B ；1.0μ I pAW134qcz 質(zhì)粒 DNA(約 IOOng) ;19.50μ1 水。熱循環(huán)儀(Thermocycler):T3Thermocycler Biometra,德國，用于擴(kuò)增，利用以下設(shè)置:在94°C下60秒循環(huán)I次；在94°C下30秒、在52°C下30秒和在72°C下120秒循環(huán)32次；在72°C下300秒循環(huán)I次。
針對每個PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的DNA片段大小，通過標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳和通過Qiagen凝膠提取試劑盒(強(qiáng)基因公司(Qiagen), Hilden,德國)從凝膠中提取的DNA來檢驗(yàn)。根據(jù)廠商說明(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)公司(NewEngland Biolabs))用PstI和AscI來消化純化的片段。利用QiagenPCR純化試劑盒(強(qiáng)基因公司(Qiagen))純化消化的片段。利用引物SEQ ID N0:28和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的650bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1318至1967位堿基表示。利用引物SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的442bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1526至1967位堿基表示。利用引物SEQ ID N0:30和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的412bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1556至1967位堿基表示。利用引物SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的365bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1603至1967位堿基表示。利用引物SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的315bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1653至1967位堿基表示。利用引物SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34擴(kuò)增的Atlg21890啟動子的258bp的啟動子缺失區(qū)域由SEQ ID NO:1的第1710至1967位堿基表示。為利于克隆而在引物中引入的限制性位點(diǎn)不包括在該指定的序列中。
實(shí)施例8:用于轉(zhuǎn)化和產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因發(fā)根的二元載體構(gòu)建體Atlg21890啟動子缺失
為評價源自pAW134qCZ的克隆的啟動子缺失的表達(dá)活性，在⑶S報(bào)道基因(細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶或⑶S基因(Jefferson (1987) EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了對應(yīng)于SEQ ID NO:1的第1318至1967位、第1526至1967位、第1556至1967位、第1603至1967位、第1653至1967位和第1710至1967位核苷酸的基因片段，以分別產(chǎn)生二元載體RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136。為評價源自 pAW134qcz 的克隆的啟動子缺失的表達(dá)活性，在⑶S報(bào)道基因(細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶或⑶S基因(Jefferson(1987)EMBO J.6,3901-3907)的上游，克隆了對應(yīng)于SEQ ID NO:1的第1318至1637位核苷酸和第1653至1967位堿基的合成基因片段，以產(chǎn)生二元載體RTJ141。為評價源自pAW134qCZ的克隆的啟動子缺失的表達(dá)活性，在⑶S報(bào)道基因(細(xì)菌β-葡糖醛酸糖苷酶或⑶S基因(Jefferson (1987) EMBO J.6，3901-3907)的上游，克隆了對應(yīng)于 SEQ ID N0:1 的第 1318 至1713位核苷酸和第1735至1967位堿基的合成基因片段，以產(chǎn)生二元載體RTJ142。二元載體中植物選擇標(biāo)記是源自擬南芥的突變的AHAS基因，其賦予對除草劑ARSENAL (滅草煙，BASF公司，F(xiàn)lorham Park，NJ)的耐受性。該選擇性標(biāo)記突變的AHAS是由擬南芥AHAS啟動子驅(qū)動的。
大豆胞囊線蟲可以在正常的大豆根部外植體上繁殖。然而，該技術(shù)要求持續(xù)建立根部外植體，因?yàn)檫@些器官在培養(yǎng)中具有限定性的生長期。相反，通過用發(fā)根土壤桿菌侵染大豆子葉而產(chǎn)生的大豆發(fā)根顯示出在組織培養(yǎng)中無限生長，這給用于單種繁殖和大豆胞囊線蟲的研究的正常根部外植體提供了替代(Cho等，(1998)Plant Sc1.138，53-65)。發(fā)根土壤桿菌可以反向轉(zhuǎn)移二元載體的T-DNA，由此能產(chǎn)生包含在T-DNA質(zhì)粒中插入的外源基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)根。該方法已經(jīng)被用于生產(chǎn)一些植物種中的轉(zhuǎn)基因根部(Christey，(1997)Doran,P.Μ.(編著)發(fā)根:培養(yǎng)和應(yīng)用(Hairy roots:cultureand application) ,Harwood,阿姆斯特丹，第99-111頁)。然后轉(zhuǎn)基因發(fā)根可以用于研究轉(zhuǎn)基因表達(dá)對于任何給定的表型的影響。
在本實(shí)施例中，通過電穿孔將二元載體RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141和RTJ142轉(zhuǎn)化到發(fā)根土壤桿菌K599株中(Cho等，見上)。轉(zhuǎn)化的土壤桿菌利用以下方案用于誘導(dǎo)大豆發(fā)根形成。在發(fā)根土壤桿菌接種前約五天，將大豆栽培種Williams82(SCN易感染的)的種子用10%漂白劑滅菌10分鐘，并在I %瓊脂上在25°C每天16小時光照下發(fā)芽。在發(fā)根土壤桿菌接種前約三天，將包含二元載體的發(fā)根土壤桿菌菌株K599的冷凍原種在LB+卡那霉素(SOyg/ml)平板上劃線并在28°C下在黑暗中培養(yǎng)。在發(fā)根土壤桿菌接種前約一天，從平板中挑取菌落并接種到液體LB+卡那霉素(50yg/ml)中。在28°C下?lián)u動培養(yǎng)物約16小時。將液體培養(yǎng)物中發(fā)根土壤桿菌的濃度調(diào)至OD6tltl = 1.0。
從大豆幼苗中切除子葉并將近軸側(cè)用解剖刀割幾次。將15 μ I發(fā)根土壤桿菌懸液接種在創(chuàng)傷的表面上，并將子葉以近軸側(cè)向上放在1%瓊脂平板上3天(在25°C每天16小時光照下)。然后將子葉轉(zhuǎn)移到包含500 μ g/ml羧芐青霉素(以抑制發(fā)根土壤桿菌)和I μ M ARSENAL的MS平板上。在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)子葉2星期之后，發(fā)根從創(chuàng)傷部位被誘導(dǎo)。收獲抗ARSENAL且在選擇培養(yǎng)基上生長的根部并將其轉(zhuǎn)移到新鮮的同樣成分的選擇培養(yǎng)基上，并在25°C下在黑暗中培養(yǎng)。在收獲發(fā)根并在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)它們兩周后，將發(fā)根在包含羧芐青霉素5 00 μ g/ml而沒有ARSENAL的MS培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)。
實(shí)施例9:在大豆發(fā)根中啟動子缺失活性的檢測
如實(shí)施例8中所示，將本發(fā)明的啟動子與⑶S報(bào)道基因有效連接以確定它們的表達(dá)活性。在植物中借助于顯色物質(zhì)比如5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-葡糖醛酸(X-Gluc)在活性染色反應(yīng)中，可以檢測GUS基因的β-葡糖醛酸糖苷酶活性(Jefferson，見上)。
為研究在存在和缺少線蟲感染中SEQ ID NO:1的缺失的啟動子活性，從用pAW134qcz、RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141 和 RTJ142 轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生了一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因品系。在傳代培養(yǎng)約三周之后，將MS上的轉(zhuǎn)基因發(fā)根品系用表面凈化的SCN品種3的J2以每平板2000個J2水平接種。在接種后12天(DAI)，通過從瓊脂平板中移除來收獲根部，將其在水中隨著變化溫和清洗，并且在包含X-Gluc (2mg/l)的GUS染色溶液中在37°C下染色16小時。在接種后每一時間點(diǎn)，每個品系的非接種的對照平板也在⑶S染色溶液中染色。然后在顯微鏡下觀察根部以檢測⑶S表達(dá)。
對于每個轉(zhuǎn)基因品系，在感染后12天(DAI)觀察10個隨機(jī)挑取的合胞體并對GUS表達(dá)的強(qiáng)度計(jì)分。使用以下計(jì)分指標(biāo)“為沒有染色，“ + ”為弱的染色，“++”為強(qiáng)的染色。使用以下計(jì)分指標(biāo)“為沒有染色，“ + ”為弱的染色，“++”為強(qiáng)的染色。此外，表明在12個品系中的I個品系在少于或等于10個觀察的覓食部位中的7個中顯示出覓食部位中的GUS染色。因?yàn)橹挥蠭個品系在覓食部位中顯示出活性，得分與真陽性表達(dá)模式不一致，可能是位置效應(yīng)的結(jié)果。10個計(jì)數(shù)的大概平均值用于測定在合胞體中GUS表達(dá)水平。
此外，對于用pAW134qcz、RTJ137、pAW329、RTJ133、RTJ134、RTJ135、RTJ136、RTJ141和RTJ142轉(zhuǎn)化的品系，在相同品系中就其它的根部組織比如愈傷組織、根尖、維管結(jié)構(gòu)、皮層和原基，也進(jìn)行了 GUS表達(dá)水平。在所有的啟動子缺失構(gòu)建體中，在根尖、維管和皮層組織中的表達(dá)與包含在pAW134qcz中且由SEQ ID NO:1表示的“全長”啟動子是一致的。
在考慮合胞體表達(dá)方面，分別包含在RTJ137、pAW329和RTJ133中的650bp、442bp和412bp的啟動子序列與包含在pAW134qCZ中的1967bp的啟動子相當(dāng)，能在合胞體中賦予線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)。這表明包含在RTJ133中的412bp的啟動子之內(nèi)發(fā)現(xiàn)了所有需要的調(diào)控元件，包括如圖16中所述的啟動子元件1、2、3、6、7、8、9、10和11。特別地，分別包含在RTJ141和RTJ142中的635bp和639bp的啟動子序列，不能在合胞體中賦予線蟲誘導(dǎo)的表達(dá)，表明啟動子元件8和啟動子元件I對于在覓食部位中SCN誘導(dǎo)的表達(dá)是必需的。此外,分別包含在RTJ134、RTJ135和RTJ136中的365bp、315bp和258bp的啟動子序列，與包含在RTJ133中的全功能的412bp的啟動子相比較，顯示出沒有覓食部位的表達(dá)(RTJ134)或極其減少的覓食部位的表達(dá)(RTJ135和RTJ136)。這些結(jié)果表明啟動子元件6對于啟動子活性是必需的?？傊?，這些結(jié)果表明實(shí)施例6中所述的Genomatix分析鑒定了對于該啟動子在覓食部位中驅(qū)動線蟲誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄所必需的多個`元件。
權(quán)利要求
1.啟動子，其由能驅(qū)動另一個核酸的根部特異性和/或線蟲可誘導(dǎo)的表達(dá)的分離的核酸組成，所述分離的核酸選自: 1)由如SEQID NO:1所示序列組成的核酸； 2)由如SEQID NO:1中所示序列的第1318至1967位核苷酸組成的核酸； 3)由如SEQID NO:1中所示序列的第1526至1967位核苷酸組成的核酸； 4)由如SEQID NO:1中所示序列的第1556至1967位核苷酸組成的核酸； 5)由如SEQID NO:2中所示序列組成的核酸； 6)由如SEQID NO:3所示序列組成的核酸。
2.包含權(quán)利要求
1的核酸的表達(dá)盒。
3.權(quán)利要求
2的表達(dá)盒，其進(jìn)一步包含編碼物質(zhì)的核酸，所述物質(zhì)破壞植物寄生性線蟲的代謝、生長和/或繁殖，賦予或改善植物對植物寄生性線蟲的抗性，或?qū)χ参锛纳跃€蟲是有毒的。
4.包含權(quán)利要求
1的分離的核酸的載體。
5.權(quán)利要求
4的載體，其進(jìn)一步包含編碼這樣的物質(zhì)的核酸，所述物質(zhì)破壞植物寄生性線蟲的代謝、生長和/或繁殖,賦予或改善植物對植物寄生性線蟲的抗性,或?qū)χ参锛纳跃€蟲是有毒的。
6.控制在植物中寄生性線蟲侵染的方法，其包括從種子生長所述植物的步驟，所述種子包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有與另一核酸有效聯(lián)結(jié)的權(quán)利要求
1中或權(quán)利要求
3中所述的分離的核酸，所述另一核酸編碼這樣的物質(zhì)，所述物質(zhì)破壞所述植物寄生性線蟲的代謝、生長和/或繁殖，賦予或改善植物對所述植物寄生性線蟲的抗性，或?qū)λ鲋参锛纳跃€蟲是有毒的，其中所述表達(dá)盒被穩(wěn)定地整合到所述種子的基因組中。
7.在植物中賦予或改善抗線蟲性的方法，其包括a)制備構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含與第二個核酸有效連接的含有權(quán)利要求
1中或如權(quán)利要求
3所述的核酸序列的第一個核酸，b)用a)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中在植物細(xì)胞中響應(yīng)線蟲刺激第一個核苷酸序列誘導(dǎo)第二個核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄；和c)再生該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生具有抗線蟲性或改善抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
8.權(quán)利要求
7的方法，其中第二個核酸編碼這樣的物質(zhì)，所述物質(zhì)破壞植物寄生性線蟲的代謝、生長和/或繁殖，賦予或改善植物對植物寄生性線蟲的抗性，或?qū)χ参锛纳跃€蟲是有毒的。
9.權(quán)利要求
6-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉植物。
10.權(quán)利要求
6-8中任一項(xiàng)的方法，其中該植物選自:大豆、馬鈴薯、番茄、落花生、棉、木薯、咖啡屬、椰子、鳳梨、柑桔樹、芭蕉屬、玉米、油菜、甜菜、向日葵、高粱、小麥、燕麥、黑麥、大麥、稻、青豆、皇帝豆、豌豆和煙草。
11.權(quán)利要求
1的啟動子或權(quán)利要求
2或3的表達(dá)盒或權(quán)利要求
4的載體用于生產(chǎn)抗植物寄生性線蟲的轉(zhuǎn)基因植物的用途。
12.權(quán)利要求
1的啟動子或權(quán)利要求
2或3的表達(dá)盒或權(quán)利要求
4的載體用于在植物寄生性線蟲感染之后賦予基因表達(dá)的用途。
專利摘要
本發(fā)明提供了植物基因啟動子，和必需的啟動子元件，其是根部特異性的和/或通過寄生性線蟲誘導(dǎo)的。本發(fā)明的啟動子對于在植物根部中控制感興趣的核酸的表達(dá)是有用的。
文檔編號A01H5/00GKCN101421407 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請?zhí)朇N 200780013690
公開日2013年7月17日 申請日期2007年2月13日
發(fā)明者A·威格, R·阿申齊, S·喬杜里, 黃翔, R-G·甄, Y·韓 申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (4), 非專利引用 (3),