專利名稱:含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白質(zhì)的遺傳編程表達(dá)的制作方法
含非天然氨基酸苯基砸代半胱氨酸的蛋白質(zhì)的遺傳編程表達(dá)[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用[0002]本申請(qǐng)要求以下申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)2006年3月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào) 60/783，272;2006年11月28日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/861，456 ;兩篇申請(qǐng)的內(nèi)容通過引用全文納入本文。[0003]聯(lián)邦資助研發(fā)下所作發(fā)明的權(quán)利的聲明[0004]本發(fā)明在政府的國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)基金號(hào) GM62159的支持下作出。政府對(duì)本發(fā)明享有一定權(quán)利。發(fā)明領(lǐng)域[0005]本發(fā)明涉及翻譯生物化學(xué)(translation biochemistry)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及制備和利用將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶及其配對(duì)的組合物和方法。[0006]發(fā)明背景[0007]在歷史上，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究依賴于利用天然氨基酸的反應(yīng)活性基團(tuán)的可用特性和反應(yīng)化學(xué)特性。不幸的是，從細(xì)菌到人類的每種已知生物編碼相同的二十種常見氨基酸。這20種氨基酸包含的官能團(tuán)數(shù)目出乎意料地少氮堿基、羧酸和酰胺、醇基團(tuán)和巰基。R-基團(tuán)的這種有限選擇性約束了對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究，即天然氨基酸的化學(xué)特性限制了這 些研究。例如，數(shù)量有限的天然反應(yīng)活性R-基團(tuán)限制了制備高度靶向的蛋白質(zhì)修飾而排除蛋白質(zhì)中其它氨基酸的能力。[0008]涉及蛋白質(zhì)的化學(xué)選擇性連接反應(yīng)對(duì)于各種目的至關(guān)重要，包括但不限于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及產(chǎn)生新型蛋白治療劑。本領(lǐng)域目前使用的大多數(shù)選擇性蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)涉及在親核和親電子反應(yīng)伴侶之間形成靶向蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈中天然親核殘基的共價(jià)鍵，例如，α-鹵代酮與組氨酸或半胱氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)。在這些情況中，選擇性由蛋白質(zhì)中親核殘基的數(shù)目和可接近性決定。不幸的是，天然蛋白質(zhì)通常含有定位不佳的(例如，不可接近的)反應(yīng)位點(diǎn)或多個(gè)反應(yīng)靶點(diǎn)(例如，賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基)，從而導(dǎo)致修飾反應(yīng)的選擇性不佳、難以利用親核/親電子試劑進(jìn)行高度靶向的蛋白質(zhì)修飾。此外，修飾位點(diǎn)通常局限于賴氨酸、組氨酸或半胱氨酸的天然親核側(cè)鏈。難以或不可能在其它位點(diǎn)進(jìn)行修飾。[0009]本領(lǐng)域需要為修飾和研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能而將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的新方案，其中所述非天然氨基酸具有新型反應(yīng)化學(xué)特性或其它特性，例如，未在天然氨基酸中發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)特性。本領(lǐng)域急需開發(fā)能以高度選擇性方式修飾蛋白質(zhì)而且能在生理?xiàng)l件下修飾蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)新方案。本領(lǐng)域需要產(chǎn)生蛋白質(zhì)修飾的新方法，其中所述修飾是高度特異性的，例如沒有天然氨基酸發(fā)生交叉反應(yīng)或副反應(yīng)的修飾。高度特異性蛋白質(zhì)修飾方案的新型化學(xué)方法可應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究以及制備治療性蛋白質(zhì)的各領(lǐng)域。[0010]蛋白質(zhì)脂化[0011]蛋白質(zhì)脂化是參與蛋白質(zhì)定位、正確胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵翻譯后修飾。蛋白質(zhì)脂化常是正確的生物學(xué)活性所需。該特征對(duì)于開發(fā)一些治療性蛋白質(zhì)而言至關(guān)重要。脂化對(duì)于研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)也至關(guān)重要。不幸的是，利用天然未脂化形式的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外化學(xué)選擇性連接以產(chǎn)生脂化蛋白質(zhì)極其困難，一般僅限于修飾獨(dú)特的表面暴露半胱氨酸殘基。[0012]許多細(xì)胞蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性需要與細(xì)胞膜結(jié)合，這取決于半胱氨酸通過脂質(zhì)殘基，例如法尼基、肉豆蘧?；妥貦磅；糠值姆g后修飾(Chernomordik和 Kozlov(2003), Annual Review of Biochemistry72 :175-207)。例如，許多 G-蛋白偶聯(lián)受體是棕櫚?；?。Ras蛋白是法尼基化和棕櫚酰化的(Chernomordik和Kozlov(2003), Annual Review of Biochemistry72 :175-207)。雖然蛋白質(zhì)法尼基化是穩(wěn)定而不可逆的修飾，但棕櫚?；强赡娴?，從而能動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能和特異性靶向細(xì)胞膜(Rocks等， (2005)，Science307 (5716) :1746-1752)。此外，Y -羧基谷氨酸是凝血連鎖中鈣依賴性膜附著至關(guān)重要的必需修飾(Davie 等，(1991), Biochemistry30 (43) : 10363-10370)。[0013]|H交翻譯系統(tǒng)[0014]克服遺傳密碼有限的局限性的一種方法是擴(kuò)大遺傳密碼并將具有新型反應(yīng)特性的氨基酸加入生物庫(biological repertoire)中?，F(xiàn)已開發(fā)了在原核和真核生物內(nèi)將各種非天然氨基酸體內(nèi)位點(diǎn)特異性地?fù)饺氲鞍踪|(zhì)的通用方法。這些方法依賴于在體內(nèi)多肽翻譯期間識(shí)別合適的選擇者密碼子而將所需非天然氨基酸插入規(guī)定位置的正交蛋白質(zhì)翻譯組分。這些方法利用識(shí)別選擇者密碼子的正交tRNA (Ο-tRNA)，進(jìn)而相應(yīng)的特異性正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)用非天然氨基酸加載該Ο-tRNA。這些組分不與宿主生物中任何內(nèi)源性tRNA、RS、氨基酸或密碼子交叉反應(yīng)(即，它必須是正交的)。利用這種正交tRNA-RS 配對(duì)能遺傳學(xué)編碼大量結(jié)構(gòu)上有差異的氨基酸。[0015]適于制備含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)的實(shí)施是本領(lǐng)域公知的，例如產(chǎn)生正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，參見國際公開號(hào)W02002/086075， 名為“產(chǎn)生正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和組合物”(METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION 0F0RTH0G0NAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS) ;W02002/085923，名為“非天然氨基酸的體內(nèi)摻入”(IN VIVO INC0RP0RATI0N0F UNNATURAL AMINO ACIDS) ;W02004/094593，名為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼” (EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE) ;W02005/019415，2004 年 7 月 7 日提交；W02005/007870，2004 年 7 月 7 日提交；W02005/007624，2004 年 7 月 7 日提交和 W02006/110182，2005 年 10 月 27日提交，名為“用于體內(nèi)摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分”(ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVOINCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS)。這些申請(qǐng)各自通過引用全文納入本文。摻入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)及其產(chǎn)生和使用方法的其 它討論還可參見 Wang 和 Schultz, “擴(kuò)展遺傳密碼”(Expanding theGenetic Code), Chem. Commun. (Camb. )1:1-11(2002) ;Wang和 Schultz,“擴(kuò)展遺傳密碼"(Expanding the Genetic Code), Angewandte Chemie Int. Ed, 44 (I) :34-66 (2005) ;Xie 和 Schultz, “擴(kuò)展遺傳密石馬，，(An Expanding GeneticCode)，Methods36 (3) :227-238(2005) ;Xie 和 Schultz,“擴(kuò)展的遺傳密碼”(An Expanding Genetic Code)，Methods36 (3) :227-238 (2005) ;Xie和 Schultz,“將氨基酸加入遺傳庫”(Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire) ,Curr. Opinion in Chemical Biology9 (6) :548-554(2005) ;Wang 等，“擴(kuò)展遺傳密碼子”(Expanding the Genetic Code),Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. ,35 :225-249(2006) ；Xie 和 Schultz, “蛋白質(zhì)的化學(xué)工具盒-擴(kuò)展的遺傳密碼”(A Chemical Toolkit for Proteins-an Expanded Genetic Code), Nat. Rev. Mol. Cell Biol. ,7(10) :775-782 (2006)。[0016]本領(lǐng)域需要開發(fā)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的正交翻譯組分，其中所述非天然氨基酸可摻入規(guī)定的位置，而所述非天然氨基酸具有的新化學(xué)特性能將該氨基酸作為特異性修飾(例如，脂化)的靶標(biāo)從而能排除與蛋白質(zhì)中其它位點(diǎn)的交叉反應(yīng)或副反應(yīng)。閱讀下文后可明白本文所述發(fā)明滿足了這些和其它需求。[0017]發(fā)明概述[0018]本發(fā)明提供在體內(nèi)(例如在宿主細(xì)胞內(nèi))對(duì)選擇者密碼子(selector codon)如琥拍終止密碼子起反應(yīng)而將非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸(phenylselenocysteine)摻入延伸中的多肽鏈的組合物和方法。這些組合物包含不與宿主細(xì)胞翻譯機(jī)制相互作用的正交-tRNA(Ο-tRNA)和正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)配對(duì)。即，宿主細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶不會(huì)用氨基酸(天然或非天然)加載Ο-tRNA。類似地，本發(fā)明提供的O-RS 不以顯著水平或者某些情況下不以可檢測水平地用氨基酸(天然或非天然)加載內(nèi)源性 tRNA。這些新組合物能夠產(chǎn)生含有翻譯摻入的非天然氨基酸的大量蛋白質(zhì)。苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸的化學(xué)特性還允許靶向修飾該殘基，從而能產(chǎn)生所需偶聯(lián)物，例如但不限于脂質(zhì)偶聯(lián)物。這些特異性修飾的蛋白質(zhì)可用作治療劑或用于生物醫(yī)學(xué)研究。在一些方面，本發(fā)明提供翻譯系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含第一正交氨酰-tRNA合成酶 (O-RS)、第一正交tRNA (Ο-tRNA)和第一非天然氨基酸，即苯基硒代半胱氨酸，其中所述第一 O-RS用所述第一非天然氨基酸，苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨酰化所述第一 Ο-tRNA。在一些方面，O-RS用所述苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨?；?tRNA的效率至少為含有相同Ο-tRNA、苯基硒代半胱氨酸和含有SEQ ID NO :4、6或8所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng)所觀察到的效率的50 %。[0020]該翻譯系統(tǒng)可使用衍生自各種來源的組分。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于該系統(tǒng)的 O-RS可包含SEQ ID NO :4、6或8所示氨基酸序列及該序列的保守變體。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA。在一些實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID NO 1所示(多核苷酸序列)或由其編碼。[0021]在一些方面，翻譯系統(tǒng)還包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸具有 Ο-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子。[0022]在一些方面，翻譯系統(tǒng)包含利用第二非天然氨基酸的第二正交對(duì)(即第二 O-RS和第二Ο-tRNA)，現(xiàn)在該系統(tǒng)能在多肽的不同所選位置摻入至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。在這種雙重系統(tǒng)中，第二 O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；诙?Ο-tRNA，而第二 Ο-tRNA識(shí)別不同于第一 Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。[0023]在一些實(shí)施方式中，翻譯系統(tǒng)位于宿主細(xì)胞中(包括該宿主細(xì)胞)。所用的宿主細(xì)胞不作具體限定，只要O-RS和Ο-tRNA在它們的宿主細(xì)胞環(huán)境中保留它們的正交性即可。所述宿主細(xì)胞可以是真細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌。所述宿主細(xì)胞可含有一種或多種編碼包括O-RS 或Ο-tRNA在內(nèi)的翻譯系統(tǒng)組分的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，編碼O-RS的多核苷酸包含SEQ IDNO :5、7或9所示核苷酸序列。[0024]本發(fā)明還提供產(chǎn)生在所選位置含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。這些方法通常始于提供含有以下組分的翻譯系統(tǒng)的步驟(i) 第一非天然氨基酸，即苯基硒代半胱氨酸；(ii)第一正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)； (iii)第一正交tRNA (Ο-tRNA),其中所述O-RS用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?Ο-tRNA;和(iv)編碼蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子(任選琥珀密碼子)。然后在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中該方法對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質(zhì)的所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含有所述非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。在這些方法的一些方面，所述O-RS用苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨?；?Ο-tRNA的效率至少為含有相同Ο-tRNA、苯基硒代半胱氨酸和含有SEQ ID N0:4、6或8所示氨基酸序列的氨酰基-tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng)所觀察到效率的50%。在一些方面，翻譯系統(tǒng)包含編碼O-RS的核酸。[0025]可利用各種試劑廣泛實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方式中，提供編碼O-RS的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述O-RS含有SEQ ID NO :4、6或8所示氨基酸序列或及其保守變體。這些方法所用的翻譯系統(tǒng)包含編碼O-RS的核酸，例如SEQ ID N0:5、7或9所示的核酸。[0026]在這些方法的一些實(shí)施方式中，提供翻譯系統(tǒng)的步驟包括通過定點(diǎn)誘變使野生型氨?；?tRNA合成酶的氨基酸結(jié)合口袋發(fā)生突變，選擇用所述非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化所述Ο-tRNA的所得0-RS。所述選擇步驟包括定點(diǎn)誘變后從得到的氨酰基-tRNA合成酶分子庫進(jìn)行所述O-RS的正選擇和負(fù)選擇。在一些實(shí)施方式中，提供步驟提供編碼Ο-tRNA的多核苷酸，例如，Ο-tRNA是琥珀抑制型tRNA，或者Ο-tRNA包含SEQ ID NO :1所示多核苷酸序列或由其編碼。在這些方法中，提供步驟還包括提供含有翻譯系統(tǒng)所用的琥珀選擇者密碼子的核酸。[0027]還可改進(jìn)這些方法以在蛋白質(zhì)中摻入一個(gè)以上非天然氨基酸。在那些方法中，聯(lián)用第二正交翻譯系統(tǒng)與第一翻譯系統(tǒng)，其中第二系統(tǒng)具有不同的氨基酸和選擇者密碼子特異性。例如，提供步驟可包括提供第二 O-RS和第二 Ο-tRNA，其中第二 O-RS用不同于第一非天然氨基酸的第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；诙?Ο-tRNA，且第二 Ο-tRNA識(shí)別核酸中不同于第一 Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子的選擇者密碼子。[0028]還可在宿主細(xì)胞內(nèi)實(shí)施產(chǎn)生含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。在這些情況中，提供的宿主細(xì)胞含有非天然氨基酸、0-RS、0-tRNA和含至少一個(gè)選擇者密碼子的核酸，而培養(yǎng)該宿主細(xì)胞可導(dǎo)致非天然氨基酸的摻入。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供真細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)。在一些實(shí)施方式中，提供步驟包括提供含有編碼O-RS的多核苷酸的宿主細(xì)胞。例如，編碼O-RS的多核苷酸可包含SEQ ID N0:5、7或9所示的核苷酸序列。[0029]在這些方法的一些改進(jìn)形式中，所述流程還包括將苯基硒代半胱氨酸摻入多肽后對(duì)其進(jìn)行修飾。例如，所述苯基硒代半胱氨酸可在某些條件下反應(yīng)從而導(dǎo)致在所選位置轉(zhuǎn)化成脫氫丙氨酸。該反應(yīng)可以通過氧化消除進(jìn)行?？赏ㄟ^使苯基硒代半胱氨酸與過氧化氫接觸進(jìn)行該反應(yīng)。[0030]本發(fā)明還提供產(chǎn)生脂化蛋白質(zhì)的方法，其中所述脂質(zhì)偶聯(lián)于指定的所選位置。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。這些方法通常始于提供含有以下組分的翻譯系統(tǒng)的步驟 (i)苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸；(ii)正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS) ；(iii)正交 tRNA (Ο-tRNA)，其中所述O-RS用所述苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA ;和(iv) 編碼蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸含有Ο-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子(任選琥珀密碼子)。然后在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中該方法對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而將所述苯基硒代半胱氨酸摻入所述蛋白質(zhì)的所選位置。然后該苯基硒代半胱氨酸經(jīng)反應(yīng)而在所選位置產(chǎn)生脫氫丙氨酸，其自身進(jìn)而與脂質(zhì)反應(yīng)以產(chǎn)生脂化氨基酸部分，從而產(chǎn)生在蛋白質(zhì)的所選位置含有脂質(zhì)的蛋白質(zhì)。[0031]在這些方法的一些方面，通過氧化消除或與過氧化氫接觸使得苯基硒代半胱氨酸反應(yīng)。在一些方面，與脫氫丙氨酸反應(yīng)的偶聯(lián)脂質(zhì)可以是硫代棕櫚酸、法尼基硫醇 (farnesyImercaptan)或1-十六燒硫醇(hexadecanethiol)。如此形成的脂化氨基酸是棕櫚?；腚装彼?、法尼基半胱氨酸和S-十六燒基半胱氨酸(hexadecylcysteine)。一般通過邁克爾加成反應(yīng)進(jìn)行脫氫丙氨酸的修飾。[0032]本發(fā)明還提供產(chǎn)生在所選位置具有脫氫丙氨酸的蛋白質(zhì)的方法。這些方法利用上述翻譯系統(tǒng)。這些方法通常始于提供含有以下組分的翻譯系統(tǒng)的步驟(i)苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸；( )正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS) ; (iii)正交tRNA (Ο-tRNA)，其中所述O-RS用所述苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨?；靓?tRNA ;和(iv)編碼蛋白質(zhì)的核酸， 其中所述核酸含有Ο-tRNA識(shí)別的至少一個(gè)選擇者密碼子(任選琥珀密碼子)。然后在所述蛋白質(zhì)的翻譯過程中該方法對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而將所述苯基硒代半胱氨酸摻入所述蛋白質(zhì)的所選位置。然后該苯基硒代半胱氨酸經(jīng)反應(yīng)而在所選位置產(chǎn)生脫氫丙氨酸。在這些方法的一些方面，通過氧化消除或與過氧化氫接觸使得苯基硒代半胱氨酸反應(yīng)。[0033]本發(fā)明還提供各種包含核酸和蛋白質(zhì)的各種組合物。除了組合物含有所述核酸或蛋白質(zhì)外，對(duì)該組合物的性質(zhì)不作具體限制。本發(fā)明組合物可含有任何數(shù)量的任何性質(zhì)的其它組分。例如，本發(fā)明提供含有O-RS多肽的組合物，其中所述多肽含有SEQ IDNO :4、6或 8所示氨基酸序列或其保守變體。在一些方面，所述保守變體多肽用非天然氨基酸氨酰化關(guān)聯(lián)(cognate)正交tRNA(0_tRNA)的效率至少為含有該Ο-tRNA、該非天然氨基酸和含有 SEQ ID NO :4、6或8所示氨基酸序列的氨?；?tRNA合成酶的翻譯系統(tǒng)所觀察到的效率的 50%。本發(fā)明還提供編碼上述任何多肽的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，這些多核苷酸可含有SEQ ID NO :5、7或9所示核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，多肽在細(xì)胞中。[0035]本發(fā)明還提供含有SEQ ID NO :5、7或9所示核苷酸序列的多核苷酸組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有所述多核苷酸的載體，如表達(dá)載體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有上述載體的細(xì)胞。[0036]定義[0037]在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)該知道本發(fā)明不局限于具體的生物系統(tǒng)，本發(fā)明當(dāng)然可以有各種變化。還應(yīng)知道本文所用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施方式，而非限制性的。除非另有明確指出，本說明書和隨附的權(quán)利要求
書中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該” 也包括復(fù)數(shù)對(duì)象。因此，例如述及“一個(gè)細(xì)胞”包括兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的組合；“一個(gè)多核苷酸”實(shí)際上包括該多核苷酸的多份拷貝。[0038]除了此處和說明書以下其余部分所定義的，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員常規(guī)理解的意義相同。[0039]正交:本文所用的術(shù)語“正交”指與某細(xì)胞或翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性相應(yīng)分子相比，某分子(例如，正交tRNA (Ο-tRNA)和/或正交氨酰tRNA合成酶(O-RS))與該細(xì)胞內(nèi)源性組分起作用的效率降低，或不能與該細(xì)胞的內(nèi)源性組分起作用。就tRNA和氨酰-tRNA合成酶而言，正交指與和內(nèi)源性tRNA合成酶起作用的內(nèi)源性tRNA相比，正交tRNA不能與內(nèi)源性 tRNA合成酶起作用或起作用的效率降低；或者與和內(nèi)源性tRNA起作用的內(nèi)源性tRNA合成酶相比，正交氨酰tRNA合成酶與內(nèi)源性tRNA不起作用或起作用的效率降低，所述效率降低例如，小于20%的效率，小于10%的效率，小于5%的效率，或小于I %的效率。正交分子缺乏細(xì)胞中功能正常的內(nèi)源性互補(bǔ)分子。例如，與內(nèi)源性RS氨酰化內(nèi)源性tRNA相比，細(xì)胞的任何內(nèi)源性RS氨?；?xì)胞中正交tRNA的效率降低或者甚至為O。在另一例子中，與內(nèi)源性RS氨?；瘍?nèi)源性tRNA相比，正交RS氨酰化感興趣細(xì)胞中任何內(nèi)源性tRNA的效率降低或者降為O?？蓪⒛芘c第一正交分子起作用的第二正交分子引入細(xì)胞。例如，正交tRNA/RS 配對(duì)包括引入的互補(bǔ)組份，與對(duì)照，例如相應(yīng)的tRNA/RS內(nèi)源性配對(duì)或活性正交配對(duì)(如酪氨酰正交tRNA/RS配對(duì))相比，它們?cè)诩?xì)胞中共同起作用的效率是，例如45%效率、50%效率、60%效率、70%效率、75%效率、80%效率、90%效率、95%效率或99%效率,或更高。[0040][H交酪氨酰-tRNA :本文所用的正交酪氨酰-tRNA (酪氨酰_0_tRNA)是與感興趣翻譯系統(tǒng)正交的tRNA，其中所述tRNA是(I)與天然酪氨酰-tRNA相同或基本類似；(2)通過天然或人工誘變衍生自天然酪氨酰tRNA; (3)由考慮了(I)或(2)的野生型或突變型酪氨酰tRNA序列的任何方法產(chǎn)生；(4)與野生型或突變型酪氨酰tRNA同源；(5)與圖2中稱為酪氨酰tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA同源；或￠)圖2中稱為酪氨酰tRNA合成酶底物的任何示例性tRNA的保守變體。酪氨酰tRNA可加載有氨基酸，或處于非負(fù)載狀態(tài)。 還應(yīng)知道“酪氨酰-Ο-tRNA”任選被關(guān)聯(lián)(cognate)合成酶分別加載(氨?；?除酪氨酸以外的氨基酸，例如非天然氨基酸。應(yīng)該知道，實(shí)際上優(yōu)選利用本發(fā)明酪氨酰-Ο-tRNA在翻譯期間對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而基本上可將任何氨基酸(無論天然或人工的)摻入延伸的多肽內(nèi)。[0041]ιΗ交酪氨酰氨基酸合成酶:本文所用的正交酪氨酰氨基酸合成酶(酪氨酰-0-RS) 是在感興趣翻譯系統(tǒng)內(nèi)用氨基酸優(yōu)先氨酰化酪氨酰-Ο-tRNA的合成酶。酪氨酰-O-RS加載到酪氨酰-Ο-tRNA上的氨基酸可以是任何氨基酸，無論是天然的還是人工的，并且不限于本文所述的。該合成酶任選與天然酪氨酰氨基酸合成酶相同或同源，或者與圖2中稱為 O-RS的合成酶相同或同源。例如，所述O-RS可以是圖2的酪氨酰-O-RS的保守變體，和/ 或與圖2中O-RS的序列至少有50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或以上相同。[0042]關(guān)聯(lián)(CORnate):術(shù)語“關(guān)聯(lián)”指共同起作用的組分，例如正交tRNA和正交氨酰基-tRNA合成酶。這些組分也可互稱為“互補(bǔ)的”。[0043]優(yōu)先氨釀化:對(duì)于本文所用正交翻譯系統(tǒng)而言，當(dāng)某表達(dá)系統(tǒng)中O-RS使Ο-tRNA帶上氨基酸的效率高于其使任何內(nèi)源性tRNA帶上氨基酸的效率時(shí)，該O-RS “優(yōu)先氨?；标P(guān)聯(lián)Ο-tRNA。即，當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在摩爾比大致相等的Ο-tRNA與任何給定的內(nèi)源性tRNA時(shí)， O-RS使Ο-tRNA帶上氨基酸的頻率高于它使內(nèi)源性tRNA帶上氨基酸的頻率。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的Ο-tRNA與內(nèi)源性tRNA時(shí)，由O-RS加載的Ο-tRNA與由O-RS加載的內(nèi)源性tRNA的相對(duì)比例優(yōu)選較高，最好導(dǎo)致O-RS僅加載或幾乎僅加載Ο-tRNA。當(dāng)存在等摩爾濃度的Ο-tRNA與O-RS時(shí)，由O-RS加載的Ο-tRNA與由O-RS加載的內(nèi)源性tRNA的相對(duì)比例大于1:1，優(yōu)選至少約2:1,更優(yōu)選5:1,更優(yōu)選10:1,更優(yōu)選20:1,更優(yōu)選50:1,更優(yōu)選 75:1，更優(yōu)選95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1，000:1、5，000:1 或更高。[0044]當(dāng)(a)與內(nèi)源性tRNA相比，O-RS優(yōu)先氨?；?tRNA，和(b)與O-RS用任何天然氨基酸氨酰化Ο-tRNA相比，氨?；瘜?duì)非天然氨基酸特異時(shí)，O-RS “用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?tRNA”。即，當(dāng)包含O-RS和Ο-tRNA的翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾量的非天然和天然氨基酸時(shí)，O-RS用非天然氨基酸加載Ο-tRNA的頻率高于加載天然氨基酸的頻率。加載有非天然氨基酸的Ο-tRNA與加載有天然氨基酸的Ο-tRNA的相對(duì)比例優(yōu)選較高。O-RS最好使0-tRNA 僅僅加載，或者幾乎僅僅加載有非天然氨基酸。當(dāng)翻譯系統(tǒng)中存在等摩爾濃度的天然和非天然氨基酸時(shí)，使Ο-tRNA帶上非天然氨基酸與使Ο-tRNA帶上天然氨基酸的相對(duì)比例大于 1:1，優(yōu)選至少約2:1，更優(yōu)選5:1，更優(yōu)選10:1，更優(yōu)選20:1，更優(yōu)選50:1，更優(yōu)選75:1，更優(yōu)選95:1、98:1、99:1、100:1、500:1、1，000:1、5，000:1 或更高。[0045]選擇者密碼子:術(shù)語“選擇者密碼子”指翻譯過程中為Ο-tRNA所識(shí)別而不為內(nèi)源性tRNA所識(shí)別的密碼子。Ο-tRNA反密碼子環(huán)識(shí)別mRNA上的選擇者密碼子并在多肽的此位置摻入其氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇者密碼子可包括，例如無義密碼子，如終止密碼子(如，琥拍、赭石和乳白密碼子)；四堿基或四堿基以上密碼子；罕用密碼子；衍生自天然或非天然堿基對(duì)的密碼子，等等。[0046]抑制型tRNA :抑制型tRNA是在多肽翻譯期間通常對(duì)終止密碼子起反應(yīng)而摻入氨基酸(即，“連讀”)來改變給定的翻譯系統(tǒng)中信使RNA (mRNA)閱讀的tRNA。在一些方面，本發(fā)明的選擇者密碼子是抑制型密碼子，例如，終止密碼子(如，琥珀、赭石和乳白密碼子)、 四堿基密碼子、罕用密碼子等。[0047]抑制活件:本文所用的術(shù)語“抑制活性”總體上指tRNA(例如，抑制型tRNA)能翻譯連讀在其它情況中可導(dǎo)致翻譯終止或錯(cuò)譯(例如，移碼)的密碼子(例如，作為選擇者密碼子的琥珀密碼子或四個(gè)或以上個(gè)堿基的密碼子)的能力。抑制型tRNA的抑制活性可表示為與第二抑制型tRNA，或與對(duì)照系統(tǒng)，例如缺乏O-RS的對(duì)照系統(tǒng)相比，觀察到的翻譯連讀活性的百分比。[0048]本發(fā)明提供定量測定抑制活性的各種方法。具體Ο-tRNA和O-RS對(duì)感興趣選擇者密碼子(例如，琥珀密碼子)的抑制百分比指，在感興趣的翻譯系統(tǒng)中，在編碼表達(dá)測試標(biāo)記的核酸中含有選擇者密碼子的給定表達(dá)測試標(biāo)記(例如，LacZ)的活性與陽性對(duì)照構(gòu)建物相比的百分比，所述感興趣的翻譯系統(tǒng)包含O-RS和Ο-tRNA，所述陽性對(duì)照沒有0-tRNA、 O-RS和選擇者密碼子。因此，例如，如果在給定翻譯系統(tǒng)中觀察到不含選擇者密碼子的活性陽性對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建物的活性為X (其單位與所述標(biāo)記試驗(yàn)相關(guān))，則含有選擇者密碼子的測試構(gòu)建物的抑制百分比是在與陽性對(duì)照標(biāo)記的表達(dá)基本相同的環(huán)境條件下(除了該測試標(biāo)記構(gòu)建物在也含有Ο-tRNA和O-RS的翻譯系統(tǒng)中表達(dá)外)，該測試標(biāo)記構(gòu)建物顯示的X百分比。表達(dá)該測試標(biāo)記的翻譯系統(tǒng)一般也包含O-RS和Ο-tRNA識(shí)別的氨基酸?？扇芜x通過將測試標(biāo)記與“背景”或“陰性”對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建物比較來校正抑制百分比的測量值，所述“背景”或“陰性”對(duì)照標(biāo)記構(gòu)建物含有與測試標(biāo)記相同的選擇者密碼子，但其所在的系統(tǒng)不含 0-tRNA,0-RS和/或Ο-tRNA和/或O-RS識(shí)別的相關(guān)氨基酸。該陰性對(duì)照可用于標(biāo)準(zhǔn)化抑制百分比測定值以補(bǔ)償感興趣的翻譯系統(tǒng)中標(biāo)記的背景信號(hào)的影響。[0049]可通過本領(lǐng)域已知的許多試驗(yàn)測定抑制效率。例如，可采用半乳糖苷酶報(bào)道試驗(yàn)，如可將衍生的IacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物在IacZ核酸序列中含有選擇者密碼子)連同含有本發(fā)明的Ο-tRNA的質(zhì)粒引入合適生物(例如，可利用正交組分的生物)的細(xì)胞。還可引入關(guān)聯(lián)合成酶(可以是多肽或表達(dá)時(shí)能編碼該關(guān)聯(lián)合成酶的多核苷酸)。細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長至所需密度，例如至0D_約為O. 5，進(jìn)行β -半乳糖苷酶試驗(yàn)，例如用諾瓦金公司 (Novagen)的BetaFluor β -半乳糖苷酶試驗(yàn)試劑盒?？蓪⒁种瓢俜直扔?jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照，例如，衍生的IacZ構(gòu)建物的觀察值的活性百分比，該衍生的IacZ構(gòu)建物在所需位置具有相應(yīng)的有義密碼子而非選擇者密碼子。[0050]翻譯系統(tǒng):術(shù)語“翻譯系統(tǒng)”指將氨基酸摻入延伸中的多肽鏈(蛋白質(zhì))的各組分。 翻譯系統(tǒng)的組分可包括，例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA等。本發(fā)明的Ο-tRNA和/或O-RS 可加入體外或體內(nèi)翻譯系統(tǒng)或是其一部分，例如存在于非真核細(xì)胞，如細(xì)菌(如大腸桿菌) 中，或存在于真核細(xì)胞中，如酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。[0051]非天然氨基酸:本文所用的術(shù)語“非天然氨基酸”指不在20種常見天然氨基酸之列的任何氨基酸，修飾的氨基酸和/或氨基酸類似物。例如，本發(fā)明可使用非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸(參見
圖1，結(jié)構(gòu)I)。[0052]衍生自:本文所用的術(shù)語“衍生自”指分離自特定分子或生物，或是用特定分子或生物的信息制得的某組份。例如，衍生自第二多肽的多肽含有與該第二多肽的氨基酸序列相同或基本上類似的氨基酸序列。以多肽為例，可通過，例如天然產(chǎn)生的誘變、人工定向誘變 或人工隨機(jī)誘變獲得衍生的種類。用于衍生多肽的誘變可以是有意定向或有意隨機(jī)的， 或混用兩種方法。誘變多肽以產(chǎn)生衍生自第一(多肽)的不同多肽可以是隨機(jī)的(例如， 聚合酶失真所致)，看通過合適的篩選方法，例如本文所述的方法鑒定衍生的多肽。誘變多肽通常需要對(duì)編碼該多肽的多核苷酸進(jìn)行操作。[0053]IH選擇或篩選標(biāo)記:本文所用的術(shù)語“正選擇或篩選標(biāo)記”指當(dāng)存在該標(biāo)記時(shí)(例如被表達(dá)或激活等)可從不具有特征的細(xì)胞中鑒定出具有特征的細(xì)胞，例如具有正選擇標(biāo)記的細(xì)胞。[0054]負(fù)選擇或篩選標(biāo)記:本文所用的術(shù)語“負(fù)選擇或篩選標(biāo)記”指當(dāng)存在該標(biāo)記時(shí)(例如被表達(dá)或激活等)可鑒定不含有所選特性或特征的細(xì)胞(例如，與確實(shí)具有該特性或特征的細(xì)胞相比)。[0055]報(bào)道分子:本文所用的術(shù)語“報(bào)道分子”是指可用于鑒定和/或選擇感興趣系統(tǒng)的靶組分的組分。例如，報(bào)道分子可以包括蛋白質(zhì)，如能賦予抗生素抗性或敏感性的酶(如 β -內(nèi)酰胺酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)等)、熒光篩選標(biāo)記(如綠色熒光蛋白(如GFP)、 YFP、EGFP, RFP等)、冷光標(biāo)記(如螢火蟲螢光素酶蛋白)、親和力篩選標(biāo)記，或者可選擇的正或負(fù)標(biāo)記基因如lacZ、β -gal/lacZ ( β -半乳糖苷酶)、ADH(乙醇脫氫酶)、his3、ura3、 leu2、lys2 等。[0056]真核生物本文所用的術(shù)語“真核生物”指屬于真核生物界(KingdomEucarya)的生物。真核生物通常因其以下特征而區(qū)別于原核生物典型的多細(xì)胞組織(但不都是多細(xì)胞，例如酵母)，存在膜限制的核與其它膜限制的細(xì)胞器，線形遺傳物質(zhì)(即，線形染色體)，不存在操縱子，存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和poly-A mRNA，以及其它生物化學(xué)特征，如不同的核糖體結(jié)構(gòu)。真核生物包括，例如動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物、昆蟲、爬行動(dòng)物、鳥等)，纖毛蟲·， 植物(如單子葉植物、雙子葉植物、藻類等)、真菌、酵母菌、鞭毛蟲類、微孢子蟲、原生動(dòng)物坐寸ο[0057]原核生物本文所用的術(shù)語“原核生物”指屬于原核生物界(也稱為原核生物 (Procarya))的生物。原核生物通常因其以下特征而區(qū)別于真核生物單細(xì)胞組織，通過出芽或分裂的無性生殖，缺乏膜限制的核與其它膜限制的細(xì)胞器，環(huán)狀染色體，存在操縱子， 不存在內(nèi)含子、信使(RNA)加帽和poly-A mRNA，以及其它生物化學(xué)特征，如不同的核糖體結(jié)構(gòu)。原核生物包括真細(xì)菌和古細(xì)菌(Archaea)(有時(shí)稱為“古細(xì)菌(Archaebacteria) ”) 亞界。在原核生物界有時(shí)將藍(lán)細(xì)菌(藍(lán)綠藻)與支原體分為不同類別。[0058]迦童:本文所用的術(shù)語“細(xì)菌”和“真細(xì)菌”指不同于古細(xì)菌的原核生物。類似地， 古細(xì)菌指不同于真細(xì)菌的原核生物?？筛鶕?jù)許多形態(tài)和生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分真細(xì)菌和古細(xì)菌。例如，可采用核糖體RNA序列、RNA聚合酶結(jié)構(gòu)的差異，存在或不存在內(nèi)含子，抗生素敏感性，存在或不存在細(xì)胞壁肽聚糖和其它細(xì)胞壁組分，膜脂質(zhì)的分枝與不分枝結(jié)構(gòu)，存在/ 不存在組蛋白和組蛋白樣蛋白而將某生物指定為真細(xì)菌或古細(xì)菌。[0059]真細(xì)菌的例子包括大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜熱棲熱菌 (Thermusthermophilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)和嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillusstearothermophilus)等)。古細(xì)菌的例子包括詹氏甲燒球菌 (Methanococcusjannaschii)(Mj)> 梅氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei) (Mm)、嗜熱喊甲燒桿菌(Methanobacteriurn thermoautotrophicum) (Mt)、海沼甲燒球菌(Methanococcus maripaludis)、甲燒嗜熱菌(Methanopyrus kandleri)、鹽細(xì)菌 (Halobacterium)(例如沃氏富鹽菌(Haloferax volcanii)和鹽細(xì)菌種NRC-1)、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus) (Af)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus) (Pf)、極端嗜熱古菌(Pyrococcus horikoshii) (Ph)、好氧火球菌(Pyrobaculum aerophilum)、Pyrococcus abyss1、硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus) (Ss)、Sulfolobustokodai1、嗜熱泉生古細(xì)菌(Aeuropyrum pernix) (Ap)、嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)和火山熱原體(Thermoplasma volcanium)。[0060]保守性變體就翻譯組分而言，本文所用的術(shù)語“保守性變體”指在功能上類似于和該保守性變體相似的基本組分，例如Ο-tRNA或0-RS，但與參比Ο-tRNA或O-RS相比，序列中有變異的某翻譯組份，例如保守性變體Ο-tRNA或保守性變體Ο-RS。例如，O-RS或該O-RS 的保守性變體可用苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸氨?；P(guān)聯(lián)Ο-tRNA。在該例子中，所述 O-RS及保守性變體O-RS的氨基酸序列不相同。所述保守性變體在序列中可具有例如一處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或五處或更多處變異，只要該保守性變體仍與關(guān)聯(lián)的相應(yīng)Ο-tRNA或O-RS互補(bǔ)(例如，與之起作用)。[0061 ] 在一些實(shí)施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代。在一些實(shí)施方式中，保守性變體O-RS與衍生其的O-RS相比，含有一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代，此外還保留了 O-RS的生物學(xué)活性；例如，保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少10%，或者至少20%，至少30%，或至少40%的生物學(xué)活性。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述保守性變體O-RS保留了衍生其的親本O-RS分子至少50%的生物學(xué)活性。保守性變體O-RS的保守性氨基酸取代可出現(xiàn)在該O-RS的任何結(jié)構(gòu)域內(nèi)，包括氨基酸結(jié)合口袋。[0062]選擇或篩選試劑:本文所用的術(shù)語“選擇或篩選試劑”指當(dāng)其存在時(shí)可從某群體中選擇/篩選某些組分的試劑。例如，選擇或篩選試劑可以是但不限于，如營養(yǎng)物、抗生素、某波長的光、抗體、表達(dá)的多核苷酸等。選擇試劑可根據(jù)例如濃度、強(qiáng)度等而不同。[0063]起反應(yīng):本文所用的術(shù)語“起反應(yīng)”指本發(fā)明的Ο-tRNA識(shí)別選擇者密碼子并介導(dǎo)與該tRNA偶聯(lián)的非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈的過程。[0064]編遇:本文所用的術(shù)語“編碼”指用多聚大分子或序列鏈中的信息來指導(dǎo)不同于該第一分子或序列鏈的第二種分子或序列鏈產(chǎn)生的任何過程。本文所用的該術(shù)語應(yīng)用廣泛， 可用于各領(lǐng)域。在一些方面，術(shù)語“編碼”描述了半保留DNA復(fù)制的過程，其中雙鏈DNA分子的一條鏈用作模板通過依賴DNA的DNA合成酶來編碼新合成的互補(bǔ)姊妹鏈。[0065]在另一方面，術(shù)語“編過”指用一種分子的信息來指導(dǎo)產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)不同于該第一分子的第二種分子的任何過程。例如，DNA分子可編碼RNA分子(例如，通過依賴DNA的 RNA聚合酶參與的轉(zhuǎn)錄過程)。RNA分子也可編碼多肽，例如翻譯過程。當(dāng)術(shù)語“編碼”用于描述翻譯過程時(shí)，其含義也延伸至編碼氨基酸的三聯(lián)密碼子。在一些方面，RNA分子可編碼 DNA分子，例如通過依賴RNA的DNA合成酶參與的逆轉(zhuǎn)錄過程。在另一方面，DNA分子可編碼多肽，應(yīng)該知道該情況用“編碼”同時(shí)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯過程。[0066]附圖簡述圖1提供非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)(結(jié)構(gòu)I)以及可從苯基硒代半胱氨酸衍生的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)包括脫氫丙氨酸(2)、棕櫚酰基半胱氨酸(3)、法尼基半胱氨酸(4)、S-十六烷基半胱氨酸(5)和Y -羧基谷氨酸(6)。[0068]圖2提供本發(fā)明可用的各種核苷酸好氨基酸序列。[0069]發(fā)明詳述[0070]本發(fā)明提供因20種天然氨基酸而受限的使用翻譯系統(tǒng)固有局限性的解決方案。 所述解決方案包括涉及利用正交翻譯系統(tǒng)將非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸(圖1，結(jié)構(gòu) I)編程性、位點(diǎn)特異性生物合成摻入蛋白質(zhì)的組合物和方法。通過工程改造編碼感興趣蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，使之含有選擇者密碼子從而將苯基硒代半胱氨酸編程性摻入蛋白質(zhì)的任何所需位置，而所述選擇者密碼子能發(fā)出將非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈的信號(hào)。[0071]本發(fā)明提供包含新型氨?；?tRNA合成酶(O-RS)的新組合物，所述合成酶能用苯基硒代半胱氨酸加載合適的關(guān)聯(lián)抑制型Ο-tRNA (例如，SEQ IDNO :1所示的Ο-tRNA)。這些 O-RS是能在細(xì)菌宿主細(xì)胞中用非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸選擇性加載Ο-tRNA的詹氏甲燒球菌(Methanococcusjannaschii)酪氨酰-tRNA合成酶新型突變體。這些正交組分最優(yōu)選不與宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌細(xì)胞)翻譯機(jī)制的內(nèi)源性宿主組分交叉反應(yīng)。[0072]本發(fā)明O-RS可包括SEQ ID NO :4、6或8所示0-RS。本發(fā)明提供編碼這些O-RS多肽的多核苷酸。本文還描述了開發(fā)能在真細(xì)菌中起作用而對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)起作用， 從而位點(diǎn)特異性地?fù)饺氡交腚装彼岱翘烊话被岬男滦?-tRNA/0-RS配對(duì)的方法。[0073]本發(fā)明還提供對(duì)選擇者密碼子(例如，琥珀無義密碼子，TAG)起反應(yīng)而高度有效且位點(diǎn)特異性地將苯基硒代半胱氨酸(圖1，結(jié)構(gòu)I)摻入蛋白質(zhì)(優(yōu)選體內(nèi))的方法。這些新方法和組合物可用于，例如細(xì)菌宿主系統(tǒng)中。[0074]在一些情況中，在將苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸摻入多肽后，可對(duì)其進(jìn)行特異性且區(qū)域選擇性的修飾，如本文所述。由于苯基硒代基團(tuán)的反應(yīng)化學(xué)特性，可以極高選擇性地修飾其所摻入的蛋白質(zhì)。在一些情況中，苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸反應(yīng)基團(tuán)的優(yōu)點(diǎn)是其對(duì)于體內(nèi)系統(tǒng)完全是外來的，從而能提高反應(yīng)選擇性。在一些方面，可采用能在體外和體內(nèi)進(jìn)行涉及蛋白質(zhì)的偶連反應(yīng)并保留宿主細(xì)胞活力和/或蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的相對(duì)溫和反應(yīng)條件進(jìn)行修飾反應(yīng)。[0075]在一些方面，摻入的苯基硒代半胱氨酸部分經(jīng)修飾，然后，例如通過偶連反應(yīng)再次修飾該修飾產(chǎn)物。[0076]最終偶連于蛋白質(zhì)中所選位置(對(duì)應(yīng)于編碼蛋白質(zhì)的開放讀框中的選擇者密碼子)的材料的性質(zhì)不作具體限定，其可以使任何所需的實(shí)體，例如脂質(zhì)、染料、熒光團(tuán)、交聯(lián)劑、糖衍生物、聚合物(例如，聚乙二醇的衍生物)、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒性化合物、親和力標(biāo)記、生物素衍生物、樹脂、小珠、第二蛋白質(zhì)或多肽(或更多的)、一種或多種多核苷酸(例如，DNA、RNA等)、金屬螯合劑、輔助因子、脂肪酸、碳水化合物等。[0077] 在一些方面，為演示(但不限于)本發(fā)明，本文內(nèi)容描述了摻入模型蛋白質(zhì)，例如肌紅蛋白、人生長激素好GFP中的苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸部分。不是要將苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸的摻入局限于任何特定蛋白質(zhì)。應(yīng)該知道，可利用本發(fā)明的指導(dǎo)將苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸摻入感興趣的任何所需蛋白質(zhì)。產(chǎn)生包含一個(gè)好多個(gè)苯基硒代半胱氨酸非天然氨基酸(單獨(dú)或與其它不同的非天然氨基酸組合)的蛋白質(zhì)對(duì)于各種目的，例如用于治療性蛋白質(zhì)和研究目的是有利的。[0078]苯基砸代半胱氨酸的修飾[0079]在一些方面，本發(fā)明提供在將苯基硒代半胱氨酸氨基酸殘基摻入多肽后對(duì)其進(jìn)行修飾的方法。一種這樣的修飾，例如氧化切割可有利地將苯基硒代半胱氨酸氨基酸殘基轉(zhuǎn)化成α，β -不飽和氨基酸脫氫丙氨酸(參見圖1，結(jié)構(gòu)2)。該脫氫丙氨酸非天然氨基酸也具有反應(yīng)性，隨后可對(duì)其進(jìn)行修飾。[0080]本發(fā)明不應(yīng)局限于苯基硒代半胱氨酸轉(zhuǎn)化成脫氫丙氨酸的任何具體機(jī)制(例如， 氧化消除)或特定反應(yīng)條件(例如，與過氧化氫接觸)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道可等效用于本發(fā)明將苯基硒代半胱氨酸殘基轉(zhuǎn)化成脫氫丙氨酸的各種其它合適的機(jī)制和反應(yīng)條件。[0081]脫氡丙氨酸的修飾[0082]在一些方面，本發(fā)明提供進(jìn)一步修飾多肽中脫氫丙氨酸非天然氨基酸殘基的方法。所述脫氫丙氨酸殘基具有反應(yīng)性，可在高度特異性修飾反應(yīng)中作為靶標(biāo)。這些方法尤其可用于形成脂質(zhì)偶連物以產(chǎn)生脂化蛋白質(zhì)。[0083]如本文所述，非天然氨基酸脫氫丙氨酸的邁克爾加成反應(yīng)可產(chǎn)生具有編程性、位點(diǎn)特異性翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。例如，脫氫丙氨酸與巰基-脂質(zhì)反應(yīng)可產(chǎn)生脂化蛋白質(zhì)。例如，與硫代棕櫚酸反應(yīng)可產(chǎn)生棕櫚?；腚装彼?參見圖1，結(jié)構(gòu)3)、與法尼基硫醇反應(yīng)可產(chǎn)生法尼基半胱氨酸(參見圖1，結(jié)構(gòu)4)、而與丙二酸(鹽或酯)反應(yīng)可產(chǎn)生Y-羧基谷氨酸(參見圖1，結(jié)構(gòu)6)。此外，與1-十六烷基硫醇反應(yīng)看產(chǎn)生S-十六烷基半胱氨酸(參見圖1，結(jié)構(gòu)5)。[0084]雖然本說明書提供了這些實(shí)例，但應(yīng)該知道本發(fā)明不限于修飾(偶連)脫氫丙氨酸的任何具體機(jī)制(例如，邁克爾加成途徑)或特定試劑(巰基-脂質(zhì))。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道其它各種合適的機(jī)制、反應(yīng)條件好試劑可等效地用于本發(fā)明來修飾脫氫丙氨酸殘基。實(shí)際上，修飾脫氫丙氨酸殘基不限于脂質(zhì)偶連，采用該偶連機(jī)制可將任何所需部分偶連于脫氫丙氨酸的位置。
IH交tRNA/氨?；?tRNA合成酶技術(shù)[0086]理解與正交tRNA和正交氨酰-tRNA合成酶配對(duì)有關(guān)的活性有助于理解本發(fā)明的新型組合物和方法。為在遺傳密碼中加入額外的非天然氨基酸，需要含有氨?；?tRNA合成酶和適當(dāng)tRNA的新正交配對(duì)，它們可在宿主翻譯機(jī)制中有效起作用，但對(duì)于所述翻譯系統(tǒng)是“正交”的，這意味著它可不依賴于翻譯系統(tǒng)的內(nèi)源性合成酶和tRNA而起作用。正交配對(duì)的所需特征包括能解碼或識(shí)別不由任何內(nèi)源性tRNA解碼的僅一種特定密碼子(例如選擇者密碼子)的tRNA，和只能用一種特定非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化其關(guān)聯(lián)tRNA(或“使之負(fù)載”)的氨?；?tRNA合成酶。內(nèi)源性合成酶通常不氨?；?tRNA。例如，在大腸桿菌宿主系統(tǒng)中，正交配對(duì)包括不與任何內(nèi)源性tRNA(例如，大腸桿菌中有40種)交叉反應(yīng)的氨?；?tRNA合成酶和不被任何內(nèi)源性合成酶(例如，大腸桿菌中有21種)氨?；恼?tRNA ο[0087]本領(lǐng)域已知適于制備含有一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的正交翻譯系統(tǒng)，例如制備正交翻譯系統(tǒng)的通用方法。例如，可參見國際公開號(hào)W02002/086075，名為“產(chǎn)生正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和組合物”(METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION 0F0RTH0G0NAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS) ；W02002/085923, 名為“非天然氨基酸的體內(nèi)摻入”(IN VIVO INC0RP0RATI0N0F UNNATURAL AMINO ACIDS)； W02004/094593，名為“擴(kuò)展真核遺傳密碼”(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)； 2004 年 7 月 7 日提交的 W02005/019415 ；2004 年 7 月 7 日提交的 W02005/007870 ；2004 年7月7日提交的W02005/007624 ;和2005年10月27日提交的W02006/110182，名為 “用于體內(nèi)摻入非天然氨基酸的正交翻譯組分”(ORTHOGONAL TRANSLATI ON COMPONENTS FOR THE IN VIV0INC0RP0RATI0N OF UNNATURAL AMINO ACIDS)。這些出版物各自通過引用全文納入本文。摻入非天然氨基酸的正交翻譯系統(tǒng)和它們的產(chǎn)生及使用方法的討論還可參見 Wang 和 Schultz, “擴(kuò)展遺傳密碼”(Expanding theGenetic Code), Angewandte Chemie Int. Ed. ,44(I) :34-66(2005) ;Xie 和 Schultz, “擴(kuò)展的遺傳密碼”(An Expanding Genetic Code)，Methods36 (3) :227-238 (2005) ；Xie 和 Schultz，“將氨基酸加入遺傳庫，，(AddingAmino Acids to the Genetic Repertoire), Curr. Opinion in Chemical Biology9 (6) :548-554 ;Wang 等，“擴(kuò)展遺傳密碼”(Expanding the Genetic Code), Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. ,35 :225-249(2006) ;Ryu 和 Schultz，“在大腸桿菌中有效摻入非天然氨基酸，，(Efficient Incorporation of UnnaturalAmino Acids into Proteins in Escherichia coli), Nat. Methods (4) :263-265 (2006);這些文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用全文納入本文。[0088]ιΗ交翻譯系統(tǒng)[0089]正交翻譯系統(tǒng)一般包括含有正交tRNA (Ο-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS) 和非天然氨基酸的細(xì)胞(可以是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌)，其中所述O-RS用非天然氨基酸氨酰化所述Ο-tRNA。本發(fā)明的正交配對(duì)可以包括Ο-tRNA，例如抑制型tRNA、移碼tRNA等和關(guān)聯(lián)0-RS。本發(fā)明的正交系統(tǒng)通常包含處于宿主細(xì)胞環(huán)境中或無宿主細(xì)胞的0-tRNA/0-RS 配對(duì)。除多組分系統(tǒng)外，本發(fā)明還提供各種新型組分，例如，新型正交氨酰基-tRNA合成酶多肽(例如，SEQ ID N0:4、6或8)和編碼那些多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO :5、7或 9)。[0090]當(dāng)正交配對(duì)識(shí)別選擇者密碼子并對(duì)該選擇者密碼子起反應(yīng)而加載氨基酸時(shí)，通常稱該正交配對(duì)“抑制”該選擇者密碼子。即，翻譯系統(tǒng)的(即，細(xì)胞的)內(nèi)源性機(jī)制不識(shí)別的選擇者密碼子通常不被加載，從而阻斷了多肽產(chǎn)生，否則可自核酸翻譯該多肽。在正交配對(duì)系統(tǒng)中，O-RS用特定的非天然氨基酸氨?；?tRNA。加載的Ο-tRNA識(shí)別選擇者密碼子并抑制選擇者密碼子所致的翻譯阻斷。[0091]在一些方面，與包含本文序列表所示多核苷酸序列或由其編碼的Ο-tRNA的抑制效率相比，本發(fā)明的Ο-tRNA識(shí)別選擇者密碼子并在有關(guān)聯(lián)合成酶存在下對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而具有至少約，例如，45 %、50 %、60 %、75 %、80 %或90 %或更高的抑制效率。[0092]在一些實(shí)施方式中，聯(lián)用O-RS和Ο-tRNA的抑制效率是缺乏O-RS的Ο-tRNA的抑制效率的約，例如5倍、10倍、15倍、20倍或25倍或更高。在一些方面，聯(lián)用O-RS和Ο-tRNA的抑制效率是本文序列表所示正交合成酶配對(duì)的抑制效率的至少約，例如35%、40%、45%、 50%、60%、75%、80%或 90%或更高。[0093]宿主細(xì)胞利用0-tRNA/0-RS配對(duì)將非天然氨基酸摻入延伸中的多肽鏈，例如經(jīng)由包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。在某些優(yōu)選方面，細(xì)胞 可包含一種或多種其它0-tRNA/0-RS配對(duì)，其中所述其它 O-RS用不同的非天然氨基酸加載所述其它Ο-tRNA。例如，Ο-tRNA之一可識(shí)別四堿基密碼子，其它Ο-tRNA可識(shí)別終止密碼子?；蛘撸鄠€(gè)不同的終止密碼子或多個(gè)不同的四堿基密碼子可用于同一編碼核酸。[0094]應(yīng)注意，在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞或其它翻譯系統(tǒng)中可存在多個(gè)0-tRNA/0-RS配對(duì)，從而能將多個(gè)非天然氨基酸摻入多肽。例如，細(xì)胞還可包含額外的不同0-tRNA/0-RS配對(duì)和第二非天然氨基酸，其中該額外的Ο-tRNA識(shí)別第二選擇者密碼子，該額外的O-RS用該第二非天然氨基酸優(yōu)先氨?；擃~外的0-RS。例如，包含0-tRNA/0-RS配對(duì)的細(xì)胞(其中所述Ο-tRNA識(shí)別，例如琥珀選擇者密碼子)還可包含第二正交配對(duì)，其中該第二 Ο-tRNA識(shí)別不同的選擇者密碼子，例如乳白密碼子、四堿基密碼子等。不同的正交配對(duì)優(yōu)選衍生自不同來源，從而有助于識(shí)別不同的選擇者密碼子。[0095]在某些實(shí)施方式中，系統(tǒng)包含例如大腸桿菌細(xì)胞等細(xì)胞，這些細(xì)胞含有正交 tRNA (Ο-tRNA)、正交氨?；鵷RNA合成酶(O-RS)、非天然氨基酸和包含編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸包含所述Ο-tRNA識(shí)別的選擇者密碼子。翻譯系統(tǒng)還可以是無細(xì)胞系統(tǒng)，例如與本文所述0-tRNA/0-RS配對(duì)和非天然氨基酸組合的各種市售可得 “體外”轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)。[0096]Ο-tRNA和/或O-RS可以是天然產(chǎn)生的，或者可以是，例如天然tRNA和/或RS經(jīng)突變衍生，例如，通過產(chǎn)生各種生物的tRNA文庫和/或RS文庫和/或采用各種可用的突變方案。例如，產(chǎn)生正交tRNA/氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的一種方案包括將，例如除宿主細(xì)胞外來源的異源(對(duì)宿主細(xì)胞而言)tRNA/合成酶配對(duì)輸入宿主細(xì)胞。候選異源合成酶的特性包括，例如不加載任何宿主細(xì)胞tRNA，候選異源tRNA的特性包括，例如不被任何宿主細(xì)胞合成酶所氨?；?。此外，異源tRNA對(duì)于所有宿主細(xì)胞合成酶是正交的。產(chǎn)生正交配對(duì)的第二種方案包括產(chǎn)生用于篩選和/或選擇Ο-tRNA或O-RS的突變體文庫。也可聯(lián)用這些方案。[0097]if 奪 tRNA (0-tRNA)[0098]本發(fā)明的正交tRNA (Ο-tRNA)優(yōu)選在例如體內(nèi)或體外介導(dǎo)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)內(nèi)，所述蛋白質(zhì)由含選擇者密碼子的多核苷酸編碼，而這種選擇者密碼子可被0-tRNA 識(shí)別。在某些實(shí)施方式中，與包含本文序列表中Ο-tRNA序列所示多核苷酸序列或由其編碼的Ο-tRNA相比，本發(fā)明的Ο-tRNA在相關(guān)合成酶存在下，對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而具有至少 45%、50%、60%、75%、80%、90%或更高的抑制效率。[0099]可通過本領(lǐng)域已知的多種試驗(yàn)測定抑制效率。例如，可采用β半乳糖苷酶報(bào)道分子試驗(yàn)，例如，將衍生的IacZ質(zhì)粒(該構(gòu)建物含有選擇者密碼子和IacZ核酸序列)和含有本發(fā)明Ο-tRNA的質(zhì)粒一起導(dǎo)入合適生物(如可利用正交組分的生物)的細(xì)胞內(nèi)。還可導(dǎo)入關(guān)聯(lián)合成酶(或者多肽或表達(dá)時(shí)可編碼關(guān)聯(lián)合成酶的多核苷酸)。將細(xì)胞在培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)到所需密度，如0D600約O. 5時(shí),米用例如諾瓦金公司(Novagen)的BetaFluor 0 -半乳糖苷酶檢測試劑盒進(jìn)行β半乳糖苷酶試驗(yàn)。抑制百分率可以計(jì)算為樣品相對(duì)于可比較對(duì)照(如衍生的IacZ構(gòu)建物的觀察值)的活性百分?jǐn)?shù)，所述構(gòu)建物在所需位置上含有有義密碼子而不是選擇者密碼子。本發(fā)明ο-tRNA的例子見本文序列表，例如參見圖2和SEQ ID NO :1。本文內(nèi)容還提供了設(shè)計(jì)其它等價(jià)Ο-tRNA的指導(dǎo)。在RNA分子(例如O-RSmRNA或Ο-tRNA分子)中，與給定序列(或?qū)幋aDNA而言反之亦然)或其互補(bǔ)序列相比，胸腺嘧啶(T)被尿嘧啶(U) 取代。還可存在堿基的其它修飾以大量產(chǎn)生功能等價(jià)分子。[0101]本發(fā)明還包括對(duì)應(yīng)于本文具體ο-tRNA的ο-tRNA保守性變體。例如，Ο-tRNA保守性變體包括功能與具體(例如本文序列表中的)Ο-tRNA相似的，和因合適的自身互補(bǔ)性而保留了 tRNA的L-形結(jié)構(gòu)但不具有與例如序列表或圖2所示那些(序列)相同的序列并且最好也不是野生型tRNA分子的那些分子。[0102]含Ο-tRNA的組合物還可包含正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，其中所述O-RS用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?tRNA。在某些實(shí)施方式中，含有Ο-tRNA的組合物還可包含(例如體外或體內(nèi))翻譯系統(tǒng)。細(xì)胞中也可存在含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸或這些物質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)的組合，其中所述多核苷酸含有Ο-tRNA能識(shí)別的選擇者密碼子。[0103]產(chǎn)生正交tRNA (Ο-tRNA)的方法也是本發(fā)明的特征之一。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，可通過構(gòu)建突變體文庫來產(chǎn)生Ο-tRNA。突變體tRNA文庫可用本領(lǐng)域已知的各種誘變技術(shù)構(gòu)建。例如，可通過位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)位點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變(recursive mutagenesis)方法、嵌合體構(gòu)建、或者這些技術(shù)的任何組合產(chǎn)生突變體 tRNA，例如 SEQID NO 1 所示 0-tRNA。[0104]也可將其它突變引入特定位置，例如tRNA的所需環(huán)或區(qū)域中一個(gè)或多個(gè)非保守位置、保守位置、一個(gè)或多個(gè)隨機(jī)位置或者二者的組合位置，如反密碼子環(huán)、接納莖、D臂或環(huán)、可變環(huán)、TPC臂或環(huán)、tRNA分子的其它區(qū)域或其組合。tRNA中的突變通常包括使突變型tRNA文庫內(nèi)各成員的反密碼子環(huán)突變以使其能識(shí)別選擇者密碼子。該方法還可包括給Ο-tRNA加上額外序列。與起始材料(例如多種tRNA序列)相比，Ο-tRNA通常提高了對(duì)所需生物的正交性，同時(shí)保留其對(duì)所需RS的親和力。[0105]這些方法任選包括分析tRNA和/或氨酰基-tRNA合成酶序列的相似性(和/或所推斷的同源性)以確定顯示與特定生物正交的潛在候選0-tRNA、0-RS和/或其配對(duì)?？衫帽绢I(lǐng)域已知和本文所述的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行這種分析，例如可用BLAST和pileup程序。 在一個(gè)實(shí)施例中，為篩選用于大腸桿菌的可能的正交翻譯組分，可選擇與真細(xì)菌生物不顯示接近的序列相似性的合成酶和/或tRNA。[0106]通常可通過，例如負(fù)選擇第一物種的細(xì)胞群以獲得Ο-tRNA，其中所述細(xì)胞含有多種潛在Ο-tRNA的某成員。負(fù)選擇可去除含有被細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨?；臐撛讦?tRNA文庫某成員的細(xì)胞。這樣就可以得到第一物種細(xì)胞的正交tRNA庫。[0107]某些實(shí)施方式在負(fù)選擇中將選擇者密碼子引入編碼負(fù)選擇標(biāo)記(例如能賦予抗生素抗性的酶如β內(nèi)酰胺酶；能得到可檢測產(chǎn)物的酶如β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶 (CAT)，所述產(chǎn)物例如是毒性產(chǎn)物，如芽孢桿菌RNA酶)的多核苷酸的非必須位置(例如，仍能產(chǎn)生功能性芽孢桿菌RNA酶)等。還任選在有選擇性試劑(比如抗生素，如氨芐青霉素) 存在下培養(yǎng)細(xì)胞群來進(jìn)行篩選/選擇。在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇性試劑的濃度不同。[0108]例如，為檢測抑制型tRNA的活性，可利用基于選擇者密碼子的體內(nèi)抑制的選擇系統(tǒng)，例如將無義(如終止)或移碼突變引入編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸(如編碼β半乳糖苷酶的基因(bla))中。例如，構(gòu)建在某位置(如，A184)含有選擇者密碼子的多核苷酸變體，如bla變體。用這些多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如細(xì)菌。以不能被內(nèi)源性大腸桿菌合成酶有效加載的正交tRNA為例，抗生素抗性，例如氨芐青霉素抗性應(yīng)約為或小于未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。如果tRNA不是正交的，或者能加載tRNA的異源合成酶在此系統(tǒng)內(nèi)共同表達(dá)，應(yīng)可觀察到更高水平的抗生素(如氨芐青霉素)抗性。選出那些在抗生素濃度與未用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大致相等的LB瓊脂平板上不能生長的細(xì)胞，如細(xì)菌。以毒性產(chǎn)物(如核糖核酸酶或芽孢桿菌RNA酶)為例，當(dāng)多種潛在的tRNA成員被內(nèi)源性宿主(如大腸桿菌)合成酶(即與宿主如大腸桿菌合成酶不是正交的)氨?；瘯r(shí), 選擇者密碼子被抑制，所產(chǎn)生的毒性多核苷酸產(chǎn)物導(dǎo)致細(xì)胞死亡。而含有正交tRNA或非功能性tRNA的細(xì)胞可存活。[0110]然后，在一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)與所需生物正交的tRNA庫進(jìn)行正選擇，其中將選擇者密碼子置于正選擇標(biāo)記中(例如抗藥性基因(如β內(nèi)酰胺酶基因)編碼的標(biāo)記)。對(duì)以下細(xì)胞進(jìn)行正選擇含有編碼與該細(xì)胞正交的tRNA庫某成員的多核苷酸或包含該成員的多核苷酸、含有編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸和含有編碼關(guān)聯(lián)RS的多核苷酸。在某些實(shí)施方式中，第二群細(xì)胞含有不能通過負(fù)選擇除去的細(xì)胞。該多核苷酸在胞內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞在有選擇試劑(如氨芐青霉素)存在下生長。然后選擇能被共同表達(dá)的關(guān)聯(lián)合成酶氨酰化以及對(duì)此選擇者密碼子起反應(yīng)而插入氨基酸的tRNA。與一種或多種含有非功能性tRNA或不能被感興趣合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞相比，這些細(xì)胞通常顯示抑制效率升高。含有非功能性 tRNA或不能被感興趣合成酶有效識(shí)別的tRNA的細(xì)胞對(duì)該抗生素敏感。因此在兩次選擇中能保留下的tRNA是⑴不是內(nèi)源性宿主(如大腸桿菌)合成酶的底物；(ii)能被感興趣的合成酶氨?；?；以及(iii)能在翻譯過程中起作用。[0111]因此，取決于篩選所處的環(huán)境，同一標(biāo)記可以是正或負(fù)標(biāo)記。即，如果為了篩選該標(biāo)記，則它是正標(biāo)記，但如果為了抵御該標(biāo)記則它是負(fù)標(biāo)記。[0112]上述方法中，篩選，如正選擇、負(fù)選擇或者正負(fù)選擇的嚴(yán)格性任選包括改變選擇的嚴(yán)格性。例如，由于芽孢桿菌RNA酶是毒性極高的蛋白質(zhì)，可通過將不同數(shù)目的選擇者密碼子引入到芽孢桿菌RNA酶基因內(nèi)和/或使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子來控制負(fù)選擇的嚴(yán)格性。在另一實(shí)施例中，選擇或篩選試劑的濃度(如氨芐青霉素的濃度)可以不同。在本發(fā)明的一些方面，因?yàn)樵谇皫纵喼兴杌钚暂^低，嚴(yán)格性可以不同。因此，前幾輪適用較低的嚴(yán)格性標(biāo)準(zhǔn)， 而后幾輪選擇適用更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。在某些實(shí)施方式中，負(fù)選擇、正選擇或者正負(fù)選擇可重復(fù)多次。也可使用多個(gè)不同的負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中， 正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記可以相同。[0113]其他類型的選擇/篩選方法也可用于本發(fā)明以制備正交翻譯組分，如O -1RNA、 O-RS和能對(duì)選擇者密碼子起反應(yīng)而加載非天然氨基酸的0-tRNA/0-RS配對(duì)。例如，負(fù)選擇標(biāo)記、正選擇標(biāo)記或正負(fù)選擇標(biāo)記可包括發(fā)熒光的或在合適反應(yīng)物存在下能催化發(fā)光反應(yīng)的標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中，可通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或發(fā)光檢測標(biāo)記的產(chǎn)物。標(biāo)記任選可包括親和篩選標(biāo)記。也參見Francisco，J.A.等，(1993)，“在外表面表達(dá)功能性抗體片段的大腸桿菌的制備與突光激活細(xì)胞分選”(Production and fluorescence-activatedcell sorting of Escherichia coli expressing afunctional antibody fragement on theexternal surface),Proc Natl Acad Sci USA. ,90 10444-8 制備重組正交tRNA的其它方法可見，例如名為“制備正交tRNA-氨酰-tRNA合成酶配對(duì)的方法和組合物”(METHODS AND C0MP0SITI0NSF0R THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNASYNTHETASE PAIRS)的國際專利公布W02002/086075 ;名為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)的 W02004/094593 ;與 2004 年 7 月 7 日提交的W02005/019415。也參見Forster等，(2003)，“通過翻譯從頭設(shè)計(jì)的遺傳密碼來編程月太模擬合成酶，，(Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codesdesigned dg novo), PNAS, 100 (11) :6353-6357 ;和 Feng 等,(2003), “通過單氛基酸改變擴(kuò)大 tRNA 合成酶的 tRNA 識(shí)別” (Expanding tRNArecognition of a tRNA synthetase by asingle amino acid change), PNAS,100(10) :5676-5681。[0114]iH交氨釀基-tRNA合成酶(O-RS)[0115]本發(fā)明的O-RS在體外或體內(nèi)能用非天然氨基酸優(yōu)先氨酰化Ο-tRNA?？赏ㄟ^含 O-RS的多肽和/或編碼O-RS或其部分的多核苷酸將本發(fā)明的O-RS提供給翻譯系統(tǒng)(如細(xì)胞)。例如，示例性O(shè)-RS包含SEQ ID NO :4、6或8所示氨基酸序列或其保守變體。在另一實(shí)施例中，O-RS或其部分是由多核苷酸序列或其互補(bǔ)多核苷酸序列編碼，該多核苷酸序列編碼含有本文序列表和實(shí)施例所示的氨基酸序列?？蓞⒁姡鏢EQ ID N0:5、7或9所示多核苷酸。[0116]鑒定可與Ο-tRNA —起應(yīng)用的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法也是本發(fā)明的特征之一。例如，該方法包括選擇(如正選擇)第一物種的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞各自含有1) 多種氨?；?tRNA合成酶(RS)的成員之一(例如，所述多種RS可包括突變型RS、衍生自第一物種之外物種的RS，或二者)；2)正交tRNA (Ο-tRNA)(例如，一個(gè)或多個(gè)物種的)； 以及3)編碼選擇(例如正選擇)標(biāo)記并含有至少一個(gè)選擇者密碼子的多核苷酸。與缺乏所述多種RS的成員或成員數(shù)目少的細(xì)胞相比，選擇或篩選出顯示抑制效率提高的那些細(xì)胞?？捎帽绢I(lǐng)域已知和本文所述的方法測定抑制效率。抑制效率提高的細(xì)胞包含能氨?；?Ο-tRNA的活性RS。將第一物種的第一組tRNA被活性RS氨?；乃?體外或體內(nèi))與第二物種的第二組tRNA被活性RS氨酰化的水平作比較。通過可檢測物質(zhì)(例如，標(biāo)記的非天然氨基酸)測定氨?；?。通常選擇與第一組tRNA相比更有效地氨?；诙MtRNA 的活性RS，從而獲得能與Ο-tRNA聯(lián)用的有效(優(yōu)化)正交氨?；?tRNA合成酶。采用這種方法鑒定的O-RS也是本發(fā)明的特征之一。[0117]可用許多試驗(yàn)來測定氨?；?。這些試驗(yàn)可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。例如，體外氨?；囼?yàn)可見例如Hoben和Soil, (1985)，Methods Enzymo1.，113 :55-59 也可聯(lián)用報(bào)道分子和正交翻譯組分并檢測細(xì)胞中的報(bào)道分子來測定氨酰化，所述細(xì)胞表達(dá)含有至少一個(gè)選擇者密碼子并編碼某蛋白質(zhì)的多核苷酸。也參見名為“非天然氨基酸的體內(nèi)摻入”(IN VIVO INC0RP0RATI0N0F UNNATURAL AMINO ACIDS)的 W02002/085923 和名為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)的 W02004/094593。[0118]還可進(jìn)一步改造所鑒定的O-RS以改變?cè)摵铣擅傅牡孜锾禺愋裕瑥亩沟?-tRNA 只加載上所需的非天然氨基酸，而不是任何常見的20種氨基酸。產(chǎn)生對(duì)非天然氨基酸具有底物特異性的正交氨?；鵷RNA-合成酶的方法包括，例如通過組合合成酶不同的結(jié)構(gòu)域而使合成酶在其活性位點(diǎn)、在其編輯機(jī)理位點(diǎn)、在不同位點(diǎn)發(fā)生突變等，并應(yīng)用選擇方法。也可以采用先正選擇再負(fù)選擇的方案。在正選擇中，抑制引入陽性標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)非重要位置的選擇者密碼子使得細(xì)胞在正選擇壓力下存活。在同時(shí)有天然和非天然氨基酸存在時(shí)，如此存活的細(xì)胞編碼使正交抑制型tRNA帶有天然或非天然氨基酸的活性合成酶。在負(fù)選擇中，抑制引入陰性標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)非重要位置的選擇者密碼子使合成酶失去天然氨基酸特異性。經(jīng)正、負(fù)選擇而 存活的細(xì)胞編碼只用非天然氨基酸氨?；?加載)正交抑制型tRNA的合成酶。然后通過例如DNA改組或其它遞歸誘變方法進(jìn)一步誘變這些合成酶。[0119]可采用本領(lǐng)域已知的各種誘變技術(shù)產(chǎn)生突變型O-RS文庫。例如，可用位點(diǎn)特異性突變、隨機(jī)點(diǎn)突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸誘變方法，嵌合構(gòu)建或它們的組合來制備突變型RS。例如，可從兩種或更多種其它如較小、多樣性較低的“亞文庫”來制備突變型RS 文庫。本發(fā)明也包括RS的嵌合文庫。應(yīng)注意，可以構(gòu)建各種生物(例如微生物，如真細(xì)菌或古細(xì)菌)的tRNA合成酶文庫，例如具有天然多樣性的文庫(參見，例如授予Short等的美國專利號(hào)6, 238, 884 ;授予Schallenberger等的美國專利號(hào)5, 756, 316 ;授予Petersen 等的美國專利號(hào)5，783,431 ;授予Thompson等的美國專利號(hào)5，824，485 ;授予Short等的美國專利號(hào)5，958，672)，并任選構(gòu)建和篩選正交配對(duì)。[0120]一旦合成酶經(jīng)歷正和負(fù)選擇/篩選方法，就可進(jìn)一步誘變這些合成酶。例如可分離編碼O-RS的核酸；從該核酸制備編碼突變O-RS的一組多核苷酸(例如通過隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、重組或它們的任何組合)；可重復(fù)各步驟或各步驟的組合直至獲得用非天然氨基酸優(yōu)先氨?；?tRNA的突變0-RS。在本發(fā)明的一些方面，這些步驟可進(jìn)行多次，例如至少兩次。[0121]本發(fā)明方法也可采用其它水平的選擇/篩選嚴(yán)格性來產(chǎn)生0-tRNA、O-RS或其配對(duì)?？筛淖僌-RS產(chǎn)生方法中一個(gè)或兩個(gè)步驟的選擇或篩選嚴(yán)格性。這包括，例如，改變選擇/篩選試劑的用量等。也可額外進(jìn)行幾輪正和/或負(fù)選擇。選擇或篩選也可包括以下一種或多種改變氨基酸滲透性、翻譯效率、翻譯保真度(translational fidelity)等。一種或多種改變通常依據(jù)用正交tRNA-tRNA合成酶配對(duì)來產(chǎn)生蛋白質(zhì)的生物中一種或多種基因突變。[0122]產(chǎn)生O-RS并改變合成酶底物特異性的其它常規(guī)細(xì)節(jié)見名為“產(chǎn)生正交tRNA-氨?；?tRNA合成酶配對(duì)的方法和組合物”(METHODS ANDC0MP0SITI0NS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNAAMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS)的 W02002/086075 和名為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”(EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)的 W02004/094593。也可參見 Wang 和 Schultz, “擴(kuò)展遺傳密碼”(Expandingthe Genetic Code), Angewandte Chemie Int. Ed. ,44(1) :34-66(2005),其內(nèi)容以引用方式全文納入。[0123]來源和宿豐牛物[0124]本發(fā)明可用的正交翻譯組分(Ο-tRNA和0-RS)可衍生自任何生物(或生物的組合)從而可用于任何其它物種的宿主翻譯系統(tǒng)，只要所述0-tRNA/0-RS組分與宿主系統(tǒng)能以正交方式起作用。某正交配對(duì)中的Ο-tRNA和O-RS無需衍生自同一生物。在一些方面， 正交組分衍生自用于真細(xì)菌宿主系統(tǒng)的古菌(即，古細(xì)菌)基因。[0125]例如，正交Ο-tRNA可衍生自古菌生物，例如古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、嗜熱堿甲烷桿菌；鹽細(xì)菌，如沃氏富鹽菌和鹽細(xì)菌種NRC-1 ;閃爍古生球菌、激烈火球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌、海沼甲燒球菌、甲燒嗜高熱菌(Methanopyrus ka ndleri)、梅氏甲燒八疊球菌(Mm)、耐超高溫?zé)岚艟?Pyrobaculum aerophilum) > Pyrococcus abyss1、硫橫礦硫化葉菌(Ss)、超嗜熱古菌(Sulfolobus tokodaii)、嗜酸熱原體、火山熱原體等；或真細(xì)菌，如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌等； 而正交O-RS可衍生自以下生物(或生物的組合)，例如古細(xì)菌，如詹氏甲烷球菌、嗜熱堿甲烷桿菌；鹽細(xì)菌，如沃氏富鹽菌和鹽細(xì)菌種NRC-1 ;閃爍古生球菌、激烈火球菌、極端嗜熱古菌、嗜熱泉生古細(xì)菌、海沼甲烷球菌、甲烷嗜高熱菌、梅氏甲烷八疊球菌、耐超高溫?zé)岚艟?Pyrococcus abyss1、硫磺礦硫化葉菌、超嗜熱古菌、嗜酸熱原體、火山熱原體等；或真細(xì)菌， 如大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、枯草芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。在一個(gè)實(shí)施方式中，真核生物來源，例如植物、藻類、原生動(dòng)物、真菌、酵母菌、動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物等) 等也可用作Ο-tRNA和O-RS的來源。[0126]0-tRNA/0-RS配對(duì)的各組分可衍生自同一生物或不同生物。在一個(gè)實(shí)施方式中， 0-tRNA/0-RS配對(duì)可來自同一生物?；蛘撸?-tRNA/0-RS配對(duì)的Ο-tRNA和O-RS可來自不同生物。[0127]ο-tRNA、O-RS或0-tRNA/0-RS配對(duì)可在體內(nèi)或體外選擇或篩選和/或可用于細(xì)胞， 例如真細(xì)菌細(xì)胞，從而產(chǎn)生含有非天然氨基酸的多肽。所述真細(xì)菌細(xì)胞例如但不限于大腸桿菌、嗜熱棲熱菌、枯草芽胞桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等。含本發(fā)明翻譯組分的真細(xì)菌細(xì)胞組合物也是本發(fā)明特征之一。[0128]為在一種生物中篩選Ο-tRNA和/或O-RS以用于另一種生物，也可參見2004年4 月16日提交的名為“擴(kuò)展真核生物遺傳密碼”(EXPANDINGTHE EUKARYOTIC GENETIC CODE) 的國際申請(qǐng)公布號(hào)W02004/094593。[0129]雖然正交翻譯系統(tǒng)(例如，含有0-RS、Ο-tRNA和非天然氨基酸)可利用培養(yǎng)的宿主細(xì)胞產(chǎn)生含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)，但并非要求本發(fā)明的正交翻譯系統(tǒng)需要完整的、有活力的宿主細(xì)胞。例如，在有細(xì)胞提取物存在下，正交翻譯系統(tǒng)可利用無細(xì)胞系統(tǒng)。實(shí)際上，使用無細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生蛋白質(zhì)是公認(rèn)的技術(shù)。利用本文所述的正交翻譯系統(tǒng)組分，使這些體外系統(tǒng)適用于產(chǎn)生含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明的范圍。[0130] 詵擇者密碼子[0131 ] 本發(fā)明的選擇者密碼子擴(kuò)大了蛋白質(zhì)生物合成機(jī)理的遺傳密碼子框架。例如，選擇者密碼子包括，獨(dú)特的三堿基密碼子、無義密碼子(如終止密碼子(如琥珀密碼子(UAG) 或乳白密碼子(UGA)))、非天然密碼子、至少四堿基的密碼子、罕用密碼子等?？蓪⒃S多選擇者密碼子引入所需基因，例如一個(gè)以上、兩個(gè)以上、三個(gè)以上等。利用不同的選擇者密碼子， 可采用多對(duì)正交tRNA/合成酶配對(duì)，從而能利用這些不同的選擇者密碼子同時(shí)位點(diǎn)特異性地?fù)饺攵鄠€(gè)不同的非天然氨基酸，例如包含至少一個(gè)非天然氨基酸。[0132]在一個(gè)實(shí)施方式中，這些方法包括利用作為終止密碼子的選擇者密碼子，在體內(nèi)即細(xì)胞中摻入非天然氨基酸。例如，制備能識(shí)別終止密碼子的Ο-tRNA，并由O-RS用非天然氨基酸氨?；摝?tRNA。宿主的天然氨?；?tRNA合成酶不識(shí)別該Ο-tRNA。可采用常規(guī)的定點(diǎn)誘變將終止密碼子引入編碼感興趣多肽的多核苷酸中感興趣的位點(diǎn)。可參見，例如Sayers，J.R.等，(1988)，“硫代磷酸酯寡核苷酸定向誘變中的5’，3’核酸外切酶，，(5' , 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis) ,Nucleic Acids Res,791-802。當(dāng)例如在體內(nèi)聯(lián)用 0-RS、0_tRNA和編碼感興趣多肽的核酸時(shí)，可對(duì)終止密碼子起反應(yīng)而摻入非天然氨基酸，從而獲得在特定位點(diǎn)含有非天然氨基酸的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用作選擇者密碼子的終止密碼子是琥珀密碼子UAG和/或乳白密碼子UGA。在一實(shí)施例中，UAG和UGA都用作選擇者密碼子的遺傳密碼可編碼22個(gè)氨基酸，同時(shí)保留赭石無義密碼子，UAA，其是最豐富的終止信號(hào)。體內(nèi)摻入非天然氨基酸不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞有顯著干擾。例如，在非真核細(xì)胞，如大腸桿菌中，由于UAG密碼子的抑制效率依賴于Ο-tRNA(如琥珀抑制型tRNA)與釋放因子 I(RFl)(其可結(jié)合UAG密碼子，進(jìn)而引起延伸中的肽鏈從核糖體釋放)之間的競爭，因此通過，例如提高Ο-tRNA (如抑制型tRNA)的表達(dá)水平，或利用RFl缺陷型菌株可以調(diào)節(jié)抑制效率。在真核細(xì)胞中，由于UAG密碼子的抑制效率依賴于Ο-tRNA(如琥珀抑制型tRNA)和真核釋放因子(如eRF)(其可結(jié)合終止密碼子，進(jìn)而引起延伸中的肽鏈從核糖體釋放)之間的競爭，因此通過，例如提高Ο-tRNA(如抑制型tRNA)的表達(dá)水平可以調(diào)節(jié)抑制效率。此外， 也可存在其它化合物，例如還原劑，如二硫蘇糖醇(DTT)。[0134]非天然氨基酸也可由罕用密碼子編碼。例如，當(dāng)體外蛋白合成反應(yīng)中的精氨酸濃度下降時(shí)，證實(shí)罕用的精氨酸密碼子AGG可利用丙氨酸?；暮铣蓆RNA而有效插入ala。 可參見Ma等，Biochemistry, 32 :7939(1993)。在此情況中，合成tRNA可與大腸桿菌中作為次要成分存在的天然tRNAArg競爭。此外，一些生物不能利用所有的三聯(lián)密碼子。藤黃微球菌(Micrococcusluteus)的未指定密碼子AGA可用于在體外將氨基酸插入轉(zhuǎn)錄/翻譯提取物中?？蓞⒁姡鏚owal和Oliver, Nucl. Acid. Res. ,25 :4685 (1997)。體內(nèi)利用這些罕用密碼子可以產(chǎn)生本發(fā)明的各組分。[0135]選擇者密碼子也可包括延伸密碼子，例如四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子，如四個(gè)、 五個(gè)、六個(gè)或更多堿基的密碼子。四堿基密碼子的例子包括，例如AGGA、CUAG, UAGA, CCCU 等。五堿基密碼子的例子包括,例如AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA, CUACU、UAGGC等。本發(fā)明方法可包括使用基于移碼抑制的延伸密碼子。四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子可將例如一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸插入同一蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施方式中，反密碼子環(huán)可解碼例如至少一種四堿基密碼子、至少一種五堿基密碼子或至少一種六堿基密碼子或更多。由于可能的四堿基密碼子有256種，所以同一細(xì)胞中可用四個(gè)或四個(gè)以上堿基的密碼子編碼多種非天然氨基酸。也可參見，Anderson等，(2002), “密碼子和反密碼子大小極限的研究，，(Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size),Chemistry and Biology,9 237-244和Magliery，(2001)，“擴(kuò)增遺傳密碼在大腸桿菌中選擇有效的四堿基密碼子抑制劑并用文庫方法鑒定“變化的”四堿基密碼子"(Expanding the Genetic Code Selection of Efficient Suppressors of Four-baseCodons and Identification of " Shifty " Four-base Codons with a LibraryApproach in Escherichia coli), J. Mol. Biol. ,307 755-769。[0136]例如，已采用體外生物合成方法利用四堿基密碼子將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)。 參見，例如 Ma 等,(1993), Biochemistry, 32 :7939 和 Hohsaka 等,(1999), J. Am. Chem. Soc.， 121 :34。聯(lián)用CGGG和AGGU及兩種化學(xué)?；囊拼a抑制型tRNA在體外將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物摻入鏈霉親和素。可參見，例如Hohsaka等，(1999)，J. Am. Chem. Soc.， 121 :12194。在體內(nèi)研究中，Moore等檢測了含NCUA反密碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子(N可以是U、A、G或C)的能力，發(fā)現(xiàn)含UCUA反密碼子的tRNA^解碼四聯(lián)UAGA的效率為13到26%，而在O或-1讀框中幾乎不解碼?？蓞⒁奙oore等，(2000), J. Mol. Biol.，298 195。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明可利用基于罕用密碼子或無義密碼子的延伸密碼子，它們能降低在其它不期望位點(diǎn)的錯(cuò)義連讀(missense readthrough)和移碼抑制。四堿基密碼子已在各種正交系統(tǒng)中用作選擇者密碼子?？蓞⒁?，例如，W02005/019415 ；W02005/007870 和 W02005/07624。也可參見 Wang 和 Schultz, “擴(kuò)展遺傳密碼”(Expanding the Genetic Code), Angewandte Chemielnt. Ed. , 44 (I) :34-66 (2005),其內(nèi)容通過引用的方式全文納入。雖然以下例子利用琥珀選擇者密碼子，但通過改進(jìn)本文的實(shí)例使之包含四堿基0-tRNA 和經(jīng)修飾的合成酶，從而能包含與之前描述的各非天然氨基酸O-RS相似的突變，四堿基或更多堿基的密碼子也可使用。[0137]對(duì)于給定系統(tǒng)，選擇者密碼子還可包括天然三堿基密碼子中內(nèi)源性系統(tǒng)不用(或很少用)的那個(gè)天然堿基密碼子。例如，這包括缺乏能識(shí)別該天然三堿基密碼子的tRNA的系統(tǒng)，和/或該三堿基密碼子是罕用密碼子的系統(tǒng)。[0138]選擇者密碼子任選包含非天然堿基對(duì)。這些非天然堿基對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大了現(xiàn)有的遺傳字符集(genetic alphabet)。一種額外的堿基對(duì)可將三聯(lián)密碼子的數(shù)目從64增加至125。第三堿基對(duì)的特性包括穩(wěn)定和選擇性的堿基配對(duì)，利用聚合酶高保真地有效酶促摻入DNA，新生非天然堿基對(duì)合成后引物繼續(xù)有效延伸。適用于這些方法和組合物的非天然堿基對(duì)的描述包括例如Hirao等，(2002)，“將氨基酸類似物摻入蛋白質(zhì)的非天然堿基對(duì)，，(Anunnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein), Nature Biotechnology, 20 :177-182。也可參見 Wu, Y.等，(2002), J. Am. Chem. Soc. , 124 14626-14630。下文列出了其它的相關(guān)出版物。[0139]對(duì)于體內(nèi)使用，非天然核苷是膜可滲透的，并可磷酸化形成相應(yīng)的磷酸三酯。此外，增加的遺傳信息穩(wěn)定且不為細(xì) 胞酶所破壞。Benner與他人先前的工作利用了不同于經(jīng)典Watson-Crick配對(duì)的氫鍵模式,其中最值得注意的例子是異-C :異-G配對(duì)(iso_C iso-G pair)。參見，例如 Switzer 等，(1989), J. Am. Chem. Soc. ,111 :8322 ；Piccirilli 等，(1990), Nature, 343 33 ；Kool, (2000), Curr. Opin. Chem. Biol. ,4 602o 這些喊基通常與天然堿基有一定程度的錯(cuò)配，因而不能酶促復(fù)制。Kool和同事證明，堿基間的疏水包裝相互作用(hydrophobic packing interaction)可替代氫鍵以驅(qū)動(dòng)堿基對(duì)形成。參見 Kool, (2000)，Curr. Opin. Chem. Biol. ,4 602 ；Guckian 和 Kool, (1998)，Angew. Chem. hit. Ed. Engl. ,36 :2825。在致力于開發(fā)符合以上所有要求的非天然堿基對(duì)的過程中，Schultz、 Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成并研究了一系列非天然疏水堿基。發(fā)現(xiàn)PICS:PICS自·身配對(duì)比天然堿基對(duì)更穩(wěn)定，并可用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段(KF)有效地?fù)饺?DNA0 可參見，例如 McMinn 等，(1999)，J. Am. Chem. Soc.，121 :11586 ;和 Ogawa 等，(2000)， J. Am. Chem. Soc.，122 :3274。就生物學(xué)功能而言，KF合成3MN 3MN自身配對(duì)的效率和選擇性足夠。可參見，例如Ogawa等，(2000)，J. Am. Chem. Soc.，122 :8803。然而,這兩種堿基均起到進(jìn)一步復(fù)制的鏈終止子的作用。近來開發(fā)了可用于復(fù)制PICS自身配對(duì)的突變型DNA 聚合酶。此外，可復(fù)制7AI自身配對(duì)?？蓞⒁?，例如Tae等，(2001), J. Am. Chem. Soc. ,123 7439。還已開發(fā)了與Cu(II)結(jié)合后可形成穩(wěn)定配對(duì)的金屬堿基(metallobase)對(duì)Dipis Py?？蓞⒁?，Meggers等，(2000), J. Am. Chem. Soc. , 122 :10714。因?yàn)檠由烀艽a子和非天然密碼子在本質(zhì)上與天然密碼子正交，所以本發(fā)明方法可利用該特性產(chǎn)生它們的正交tRNA。[0140]還可利用一種翻譯旁路系統(tǒng)將非天然氨基酸摻入所需多肽。在翻譯旁路系統(tǒng)中， 可將一個(gè)大序列插入基因，但該序列不翻譯成蛋白質(zhì)。該序列含有可作為提示的結(jié)構(gòu)，從而能誘導(dǎo)核糖體跳過該序列然后恢復(fù)該插入序列的下游翻譯。[0141]非天然氨基酸[0142]本文所用的非天然氨基酸指除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下20種遺傳編碼的α-氨基酸以外的任何氨基酸、修飾的氨基酸或氨基酸類似物丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。α -氨基酸的通用結(jié)構(gòu)如式I所示[0143]
權(quán)利要求
1.一種翻譯系統(tǒng)，所述系統(tǒng)是大腸桿菌細(xì)胞，且包含 (a)第一非天然氨基酸，其為苯基硒代半胱氨酸； (b)第一正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，選自SEQID NO :4、6或8 ;和 (c)如SEQ ID NO :1 所示的第一正交 tRNA (Ο-tRNA)； 其中所述第一 O-RS用所述苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨?；龅谝?0-tRNA。
2.如權(quán)利要求
1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)還包含編碼感興趣蛋白質(zhì)的核酸，所述核酸含有琥珀選擇者密碼子UAG，其中所述第一 Ο-tRNA識(shí)別所述琥珀選擇者密碼子UAG。
3.如權(quán)利要求
1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述大腸桿菌細(xì)胞包含編碼所述第一O-RS的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求
3所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述多核苷酸如SEQID N0:5、7或9所/Jn ο
5.如權(quán)利要求
1所述的翻譯系統(tǒng)，其特征在于，所述大腸桿菌細(xì)胞包含編碼所述第一Ο-tRNA的多核苷酸。
6.一種在翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生在所選位置含非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括 (a)提供翻譯系統(tǒng)，該系統(tǒng)是大腸桿菌細(xì)胞，且包含 (i)第一非天然氨基酸，其為苯基硒代半胱氨酸； (ii)第一正交氨?；?tRNA合成酶(O-RS)，選自SEQID N0:4、6或8; (iii)如SEQID NO :1所示的第一正交tRNA (Ο-tRNA);其中所述第一 O-RS用所述苯基硒代半胱氨酸優(yōu)先氨酰化所述第一 Ο-tRNA ;和 (iv)編碼所述蛋白質(zhì)的核酸，其中所述核酸包含所述第一Ο-tRNA識(shí)別的琥珀選擇者密碼子UAG ;和 (b)在所述蛋白質(zhì)的翻譯期間對(duì)所述選擇者密碼子起反應(yīng)而將所述非天然氨基酸摻入所述蛋白質(zhì)的所述所選位置，從而產(chǎn)生在所選位置含所述非天然氨基酸的所述蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述翻譯系統(tǒng)包含編碼所述O-RS的多核苷酸。
8.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述提供翻譯系統(tǒng)包括提供編碼所述Ο-tRNA的多核苷酸。
9.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述提供翻譯系統(tǒng)包括提供編碼所述O-RS的核酸，其中所述核酸的多核苷酸序列如SEQ ID N0:5、7或9所示。
10.如權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于，所述摻入步驟包括培養(yǎng)所述大腸桿菌細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求
10所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌細(xì)胞包含編碼所述O-RS的核酸。
12.如權(quán)利要求
11所述的方法，其特征在于，編碼所述O-RS的所述核酸的核苷酸序列如 SEQ ID N0:5、7 或 9 所示。
13.一種多肽，選自SEQ ID N0:4、6或8。
14.一種編碼權(quán)利要求
13所述多肽的多核苷酸。
15.如權(quán)利要求
14所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸如SEQID N0:5、7或9所示。
16.—種包含權(quán)利要求
14所述多核苷酸的載體。
17.—種包含權(quán)利要求
14所述多核苷酸的表達(dá)載體。
18.—種包含載體的細(xì)胞，所述載體含有權(quán)利要求
14所述的多核苷酸。
專利摘要
本發(fā)明涉及tRNA和氨?；?tRNA合成酶的正交配對(duì)，所述配對(duì)能將非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸摻入真細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)中。本發(fā)明提供，例如但不限于新型正交氨?；?tRNA合成酶、編碼該新型合成酶分子的多核苷酸、鑒定和制備該新型合成酶的方法、產(chǎn)生含非天然氨基酸苯基硒代半胱氨酸的蛋白質(zhì)和翻譯系統(tǒng)的方法。本發(fā)明還包括通過靶向修飾蛋白質(zhì)中的苯基硒代半胱氨酸而產(chǎn)生經(jīng)修飾蛋白質(zhì)(例如，脂化蛋白質(zhì))的方法。
文檔編號(hào)C12P21/00GKCN101405401 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200780009252
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2007年3月13日
發(fā)明者王江云, P·G·舒爾茨 申請(qǐng)人:斯克利普斯研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (1),