專(zhuān)利名稱(chēng):具有增加的賴(lài)氨酸的轉(zhuǎn)基因植物種子的制作方法
具有增加的賴(lài)氨酸的轉(zhuǎn)基因植物種子
優(yōu)先權(quán)聲明
本申請(qǐng)要求在本文中通過(guò)援引而完整引用的2005年10月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/723，178的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明背景
1.發(fā)明領(lǐng)域
本文中公開(kāi)了用于產(chǎn)生具有以下部分的轉(zhuǎn)基因植物的DNA構(gòu)建體，其中所述的部分具有增加的賴(lài)氨酸含量，和使用此類(lèi)DNA構(gòu)建體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物及種子的方法，來(lái)自所述植物的收獲材料和從此類(lèi)收獲材料制備的粗粉和食物產(chǎn)品。此類(lèi)DNA構(gòu)建體用于產(chǎn)生具有因種子中賴(lài)氨酸積累增加而得到的改良營(yíng)養(yǎng)益處的轉(zhuǎn)基因植物。還公開(kāi)用于產(chǎn)生在其種子中具有增加的賴(lài)氨酸含量的轉(zhuǎn)基因植物的多核苷酸分子和方法。
2.相關(guān)技術(shù)的描述
通常稱(chēng)作玉蜀黍(maize)或玉米(corn)的Zea mays是廣泛用作動(dòng)物飼料和人食物的一種谷物。谷粒，在本文中稱(chēng)作種仁或種子，是眾多低等動(dòng)物(包括豬、肉牛和奶牛、魚(yú)和家禽)的蛋白質(zhì)、淀粉和油的來(lái)源。在一些國(guó)家如墨西哥，超過(guò)70%的收獲玉米用于人消費(fèi)，并且玉米及玉米衍生產(chǎn)品如hominy和tortillas是主食(dietary staples)。在種仁中，大部分的氨基酸組成由多肽內(nèi)所含氨基酸的量和類(lèi)型決定。種仁中僅有相對(duì)小部分(至多到10% )的可獲得的氨基酸作為游離氨基酸匯集物存在；其余部分在多種蛋白質(zhì)中包含。在玉米，種仁內(nèi)找到的大部分多肽是種子忙藏蛋白或玉米醇溶蛋白(zeins)。這些種子貯藏蛋白在種仁發(fā)育時(shí)合成并在種仁萌發(fā)和開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)作為能量源使用。然而，種子貯藏蛋白含有少量賴(lài)氨酸，乃至不含賴(lài)氨酸。在混合谷物飼料內(nèi)認(rèn)定的十種必需氨基酸(精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、甲硫氨酸或半胱氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸)中，玉米尤`其缺乏賴(lài)氨酸和蘇氨酸及甲硫氨酸。這些必需氨基酸的缺乏，尤其賴(lài)氨酸的缺乏，需要飼用玉米應(yīng)當(dāng)以這些營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充，這經(jīng)常通過(guò)添加大豆粗粉或合成賴(lài)氨酸提供。有益于現(xiàn)有技術(shù)的是增加玉米種子中賴(lài)氨酸水平從而使種子作為食物或飼用谷物更有營(yíng)養(yǎng)。若谷粒需要很少或不需要用額外賴(lài)氨酸補(bǔ)充，則實(shí)現(xiàn)額外的益處。
在人營(yíng)養(yǎng)中，窮人傾向于消費(fèi)這樣的飲食，其中廉價(jià)淀粉食物的量相對(duì)高而高品質(zhì)蛋白質(zhì)的量相對(duì)低。惡性營(yíng)養(yǎng)不良病是在中等至優(yōu)異的能量(總熱量)攝入存在下因攝入品質(zhì)不夠好的蛋白質(zhì)所致的營(yíng)養(yǎng)不良形式。早期癥狀是很一般性的，并且包括疲勞、易怒和嗜睡。隨著蛋白質(zhì)缺乏繼續(xù)，出現(xiàn)生長(zhǎng)不足、肌肉質(zhì)量損失、廣泛腫脹(浮腫)和免疫力下降。常見(jiàn)大而突起的腹部。皮膚病(如皮炎、色素沉著改變、頭發(fā)稀薄和白癜風(fēng))頻繁見(jiàn)到。暈厥和昏迷進(jìn)展至死亡。一份政府評(píng)估表明在美國(guó)療養(yǎng)所中的50%老人患有蛋白質(zhì)-熱量營(yíng)養(yǎng)不良。因此，因更高賴(lài)氨酸水平而具有改良蛋白質(zhì)品質(zhì)的玉米產(chǎn)品不僅將明顯改善飲食的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，也明顯改善整體一般健康水平。
增加賴(lài)氨酸水平的植物分子生物學(xué)方法涉及鑒定并向玉米導(dǎo)入基因以影響種仁中的賴(lài)氨酸水平，而未不利地影響農(nóng)藝特性。賴(lài)氨酸衍生自天冬氨酸，其代謝與涉及蘇氨酸、甲硫氨酸和異亮氨酸的途徑交匯。賴(lài)氨酸本身作為終產(chǎn)物起到修飾和調(diào)節(jié)賴(lài)氨酸自身產(chǎn)生途徑中酶的作用。賴(lài)氨酸代謝中所涉及的關(guān)鍵酶是天冬氨酸激酶(AK)和二氫吡啶二羧酸合酶(DHDPS)，而賴(lài)氨酸-酮戊二酸還原酶(LKR，又稱(chēng)作酵母氨酸脫氫酶SDH的雙功能酶)似乎在賴(lài)氨酸異化中發(fā)揮重要作用。AK和DHDPS受賴(lài)氨酸反饋調(diào)節(jié)；當(dāng)賴(lài)氨酸水平增加時(shí)，該氨基酸下調(diào)這些酶的活性。
因此，為了增加賴(lài)氨酸水平，有益的是擁有AK或DHDPS的反饋不敏感性形式。已經(jīng)描述細(xì)菌AK基因的賴(lài)氨酸不敏感性變體以及來(lái)自植物的幾種變體(見(jiàn)Falco等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，773，691,在本文中通過(guò)援引并入)。已經(jīng)從大麥(barley)、玉米和煙草(tobacco)中鑒定幾種AK的賴(lài)氨酸不敏感性形式。從大腸桿菌(E.coli)中分離的細(xì)菌DHDPS基因已經(jīng)證實(shí)對(duì)賴(lài)氨酸水平增加的敏感性降低為至少20分之一(Glassman等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，258，300 ；Galili等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，367，110)。
Falco等(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，773，691和6，459，019、美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)U.S.2003/0056242)和Dizigan等(美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2005/0132437)描述了分離并使用來(lái)自大腸桿菌的賴(lài)氨酸反饋不敏感性天冬氨酸激酶(AK，基因稱(chēng)作IysC)、來(lái)自大腸桿菌的DHDPS和來(lái)自棒狀桿菌(Corynebacterium)的DHDPS (本文中稱(chēng)作C( gl.dapA)以產(chǎn)生在種子中具有增加的賴(lài)氨酸水平的轉(zhuǎn)基因油菜(rapeseed)、煙草、玉米和大豆植物，其中所述每一文獻(xiàn)均完整地通過(guò)援弓I并入。
本發(fā)明提供這樣的DNA構(gòu)建體，其在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)提供植物種子中增加的植物產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)成分，尤其增加的賴(lài)氨酸。
發(fā)明簡(jiǎn)述
本文中提供DNA構(gòu)建體，當(dāng)其在轉(zhuǎn)基因植的物基因組內(nèi)生效時(shí)賦予植物種子中增加的賴(lài)氨酸水平。收獲的高賴(lài)氨酸種子用于產(chǎn)生食物和飼料產(chǎn)品，如需要少量或不需要賴(lài)氨酸補(bǔ)充的玉米粉(也稱(chēng)作"masaharina")、玉米粗粉和粗粉產(chǎn)品。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因植物及種子是作物植物及種子，優(yōu)選地是單子葉植物及種子并且最優(yōu)選地是玉米植物及種子。
本發(fā)明提供包含DNA構(gòu)建體并具有種子中增加的賴(lài)氨酸水平的轉(zhuǎn)基因植物及種子。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含在玉米細(xì)胞中表達(dá)時(shí)抑制賴(lài)氨酸降解多肽產(chǎn)生的分子和在玉米細(xì)胞中表達(dá)時(shí)提供賴(lài)氨酸不敏感性二氫吡啶二羧酸合酶多肽或賴(lài)氨酸不敏感性天冬氨酸激酶產(chǎn)生的分子。
收獲的谷物，即便在無(wú)活性并且因此不用作種子時(shí)，仍提供由本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的較高賴(lài)氨酸水平和較高蛋白質(zhì)品質(zhì)。此類(lèi)收獲的谷物能夠以常規(guī)谷物那樣的相同方式加工。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)培育本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物并收獲含有高賴(lài)氨酸的種子，或通過(guò)加工本發(fā)明的種子或其部分而制備的高賴(lài)氨酸動(dòng)物飼料產(chǎn)品。在又一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過(guò)培育本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物并收獲含有高賴(lài)氨酸的種子，或通過(guò)加工本發(fā)明的種子或其部分而制備的粗粉或粗粉產(chǎn)品。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，DNA構(gòu)建體包含針對(duì)在植物細(xì)胞、尤其玉米細(xì)胞中表達(dá)而增強(qiáng)的新穎多核苷酸組合物。一種新穎多核苷酸(SEQ ID NO:5)編碼二氫吡啶二羧酸合酶多肽并且另一種新多核苷酸(SEQ ID NO:9)與賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶的多核苷酸編碼序列的一部分同源及互補(bǔ)。在植物細(xì)胞、尤其是玉米植物細(xì)胞并且優(yōu)選在玉米種子細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，該DNA構(gòu)建體引起玉米種子中賴(lài)氨酸增加。該DNA構(gòu)建體包含多核苷酸例如編碼賴(lài)氨酸不敏感性二氫吡 啶二羧酸合酶的序列如SEQ ID NO:1，和編碼賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶的序列如SEQ ID NO:2，其中所述序列用作模板以設(shè)計(jì)抑制性RNA，或編碼天冬氨酸激酶的序列如SEQ ID N0:3。DNA構(gòu)建體優(yōu)選地包含得到增強(qiáng)以指導(dǎo)玉米種子中可操作連接的多核苷酸轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子分子。此外，新DNA分子(SEQ IDNO:10)包含具有賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶基因靶的基因抑制分子，其中基因抑制分子鑲嵌在DNA構(gòu)建體的內(nèi)含子內(nèi)。
在另一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供通過(guò)使近交親代雜交以提供雜交種子而產(chǎn)生高賴(lài)氨酸玉米種子的方法，其中每種親代在其基因組中含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的一種或多種植物表達(dá)盒并且該表達(dá)盒在每種親代 中彼此相異并且兩個(gè)親代均不含有全部三種植物表達(dá)盒，并且收獲了比兩種親代中的任一親代具有更高賴(lài)氨酸含量的種子。
在另一種實(shí)施方案，本發(fā)明提供產(chǎn)生高賴(lài)氨酸性人食物或動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，包括步驟:加工來(lái)自具有如此基因組的轉(zhuǎn)基因植物的種子或其部分，其中所述的基因組包含外源性DNA構(gòu)建體或本發(fā)明構(gòu)建體集合。另外，本發(fā)明提供產(chǎn)生高賴(lài)氨酸性人食物或動(dòng)物飼料產(chǎn)品的方法，包括培育轉(zhuǎn)基因植物以產(chǎn)生種子和收獲種子的步驟，其中所述種子具有包含本發(fā)明的外源性DNA構(gòu)建體的基因組。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.顯示pM0N66649的質(zhì)粒圖
圖2.顯示pM0N80003的質(zhì)粒圖
圖3.顯示pM0N79465的質(zhì)粒圖
圖4.顯示pM0N93092的質(zhì)粒圖
圖5.顯示pM0N93093的質(zhì)粒圖
圖6.顯示pM0N80378的質(zhì)粒圖
圖7.來(lái)自包含pM0N93092的事件中R2種仁的游離賴(lài)氨酸含量
圖8.來(lái)自包含pM0N93093的事件中R2種仁的游離賴(lài)氨酸含量
發(fā)明詳述
顯示期望性狀(例如本發(fā)明增加的賴(lài)氨酸)的轉(zhuǎn)基因植物或種子包含插入該轉(zhuǎn)基因植物基因組的給予所述期望性狀的特定外源性DNA。性狀表現(xiàn)為在對(duì)照植物(例如，缺乏這種特定外源性DNA的基因型基本上相同的植物或種子)中相對(duì)于天然存在性狀的可測(cè)量變化。優(yōu)選地，變化通過(guò)比較具有同期望性狀相關(guān)的特定外源性DNA的轉(zhuǎn)基因植物或種子中該性狀的表現(xiàn)與對(duì)照植物或種子中相同性狀的表現(xiàn)而測(cè)量。"高賴(lài)氨酸玉蜀黍"因此是在任何植物部分、優(yōu)選在種子中具有增加的賴(lài)氨酸的玉米(玉蜀黍)植物，其中所述的種子也可以在本文中稱(chēng)作種仁或作為集合物稱(chēng)為谷粒。本發(fā)明提供在其基因組中含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的至少一種植物表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體和種子，其中所述的種子比不含該構(gòu)建體的種子具有更高賴(lài)氨酸含量。
增加的賴(lài)氨酸可以由植物通過(guò)在種仁中增加量的氨基酸積累而表現(xiàn)，并且可以通過(guò)任何合適方法如對(duì)已適度提取組織的質(zhì)譜法(massspectrophotometry)或高效液相色譜而測(cè)量。具有增加的賴(lài)氨酸的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因玉米種仁尤其可用作飼料或食物產(chǎn)品、粗粉或粗粉產(chǎn)品、純化的玉米蛋白質(zhì)產(chǎn)品的來(lái)源或從種仁中加工出來(lái)的其它產(chǎn)品的來(lái)源，其中所述的種仁比相似品種的非轉(zhuǎn)基因種仁具有更高的賴(lài)氨酸含量。
含有總賴(lài)氨酸水平大約4000份每百萬(wàn)份(ppm)的玉米谷粒具有充足量的賴(lài)氨酸以至于從這種谷粒中產(chǎn)生的家畜飼料或食物產(chǎn)品不需要來(lái)自其它氨基酸源的補(bǔ)充。本發(fā)明的高賴(lài)氨酸玉米實(shí)現(xiàn)了玉米種仁中這種水平的賴(lài)氨酸產(chǎn)生和積累。本發(fā)明是勝過(guò)先前所述用于增加玉米種仁中賴(lài)氨酸的方法和組合物(例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，773，691)的巨大改進(jìn)。
增加轉(zhuǎn)基因植物中氨基酸水平的努力包括表達(dá)這樣的重組DNA分子，其編碼比天然基因更高水平的氨基酸合成途徑中的蛋白質(zhì)。用于在玉米中產(chǎn)生提高的賴(lài)氨酸水平的一種方法是通過(guò)表達(dá)如美國(guó)專(zhuān)利5，288，300,6, 459，019和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/0056242Al中公開(kāi)的細(xì)菌二氫吡啶二羧酸合酶(DHDPS)并抑制內(nèi)源性L(fǎng)KR(美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2005/0193444)，其中所述每份文獻(xiàn)均在本文中完整地通過(guò)援弓I并入。
本發(fā)明的任何植物或其部分可以得到加工以產(chǎn)生飼料、粉、粗粉，蛋白質(zhì)或油制品。特別優(yōu)選用于這個(gè)目的的植物部分是種子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，飼料、粉、粗粉、蛋白質(zhì)或油制品設(shè)計(jì)用于飼養(yǎng)農(nóng)畜(家畜)。產(chǎn)生飼料、粉、粗粉、蛋白質(zhì)和油制品的方法是現(xiàn)有技術(shù)例如美國(guó)專(zhuān)利 4,957, 748 ;5，100,679 ;5，219，596 ;5，936，069 ;6，005，076 ；6，146，669和6，156，227中已知的，其中所述文獻(xiàn)在本文中完整地通過(guò)援弓I并入。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)制品是高含量蛋白質(zhì)制品，如濃縮物或分離物。高含量蛋白質(zhì)制品優(yōu)選地具有大于5% w/v的蛋白質(zhì)含量、更優(yōu)選地是10% w/v并且甚至更優(yōu)選地是15% w/vo
在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的粗粉可以與其它粗粉混合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，從本發(fā)明的植物或種子中產(chǎn)生或通過(guò)本發(fā)明方法生成的粗粉構(gòu)成任何產(chǎn)品中大于約
0.5 %、約I %、約5 %、約10 %、約25 %、約50 %、約75 %或約90 %體積或重量的粗粉成分。在另一種實(shí)施方案，粗粉制品可以加以混合并且可以構(gòu)成混合物大于約10%、約25%、約35%、約50%或約75%的體積。本發(fā)明還提供增強(qiáng)人或低等動(dòng)物生長(zhǎng)的方法，包括供給人或低等動(dòng)物這樣的飲食，其中該飲食的至少一部分是包含本發(fā)明的一種或多種植物表達(dá)盒的高賴(lài)氨酸玉米。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"低等動(dòng)物"意圖包括飼養(yǎng)鳥(niǎo)和魚(yú)以及哺乳動(dòng)物。
重鉬DNA構(gòu)律體
本發(fā)明提供DNA構(gòu)建體，其包含有效在玉米種仁中賦予增加的賴(lài)氨酸的可操作連接的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"DNA構(gòu)建體"包括，但不限于指導(dǎo)植物細(xì)胞中已連接的多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子。在轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法中使用本發(fā)明DNA構(gòu)建體的至少一部分，即穩(wěn)定插入細(xì)胞基因組的部分。該部分提供玉米種仁或從這些種仁中產(chǎn)生的粗粉中的高賴(lài)氨酸表型，并且是本發(fā)明的一方面。Monsanto Technology LLC的DNA構(gòu)建體pM0N93092和PM0N09093的保藏物已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏，登錄號(hào)分別是PTA-6733和PTA-6734。這些保藏物形成本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的一部分，并且盡管相信在本發(fā)明中以書(shū)面內(nèi)容提供的序列是精確的，包含調(diào)節(jié)元件、編碼分子和非編碼分子的DNA分子的多核苷酸序列可以根據(jù)需要從保藏物中測(cè)定并且用于校正本文中所公開(kāi)的那些序列。
重組DNA構(gòu)建體中的多核苷酸分子使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法連接。用于構(gòu)建DNA構(gòu)建體的有用技術(shù)實(shí)例是GATEWAY 克隆技術(shù)(Invitrogen LifeTechnologies, Carlsbad, California),其中所述的克隆技術(shù)使用來(lái)自卩遼菌體λ的整合酶/att系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組酶LR克隆反應(yīng)用于載體構(gòu)建替代限制性?xún)?nèi)切核酸酶和連接酶。由Invitrogen提供的GATEWAY 克隆技術(shù)說(shuō)明手冊(cè)也提供簡(jiǎn)潔描述以常規(guī)地克隆任何期望的多核苷酸至包含可操作(operable)植物表達(dá)元件的載體中。其它方法在MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版第 1、2 和 3 卷.J.F.Sambrook> D.ff.Russell 和N.1rwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000 (本文中稱(chēng)作 Sambrook 等)中公開(kāi)。
如本文中所用"外源性DNA或分離的DNA"指通常不存在于宿主細(xì)胞基因組中的DNA分子，或通常不存在于宿主基因組中相同環(huán)境下的DNA，或在正?；蛱烊磺闆r下彼此不接近的任何彼此靠近的兩個(gè)序列。外源性DNA可以包括對(duì)宿主基因組為天然的DNA或RNA多核苷酸分子或可以包含因添加或缺失一個(gè)或多個(gè)多核苷酸或?qū)ο嚓P(guān)的多核苷酸調(diào)節(jié)元件或如本文中討論的其它多核苷酸序列的修飾而改變的天然多核苷酸。除了調(diào)節(jié)元件外，外源性DNA可以含有編碼蛋白質(zhì)或多肽的編碼序列或產(chǎn)生非蛋白質(zhì)產(chǎn)物(如影響另一種DNA序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯的RNA分子)的非編碼序列。本發(fā)明DNA構(gòu)建體包含編碼序列和非編碼序列。
用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的外源性DNA構(gòu)建體將包含感興趣編碼序列和通常包含如本文中討論的其它調(diào)節(jié)元件，例如但不限于啟動(dòng)子、內(nèi)含子、5'和3'非翻譯區(qū)、前導(dǎo)序列、定位和運(yùn)輸序列和增強(qiáng)子、本文中稱(chēng)作異源植物表達(dá)盒的在植物細(xì)胞中表達(dá)RNA的這些調(diào)節(jié)元件的可操作連接。在表I中所列的DNA構(gòu)建體顯示出調(diào)節(jié)元件在表達(dá)編碼序列和非編碼序列的表達(dá)盒中的連接，以及在包含每種構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因玉蜀黍種子中所測(cè)量的平均賴(lài)氨酸水平。本發(fā)明外源性DNA構(gòu)建體的啟動(dòng)子DNA分子由種子增強(qiáng)性或種子特異性啟動(dòng)子示例，包括例如用于單子葉作物植物中的那些啟動(dòng)子，如玉蜀黍L3啟動(dòng)子(在本文中通過(guò)援引并入的美國(guó)專(zhuān)利6，433，252或其同源物，并且在本發(fā)明中稱(chēng)作P_Zm.L3)、玉蜀黍B32啟動(dòng)子(SEQ ID NO:4或其同源物，本文中稱(chēng)作P-Zm.B32)、玉蜀黍、薏苡醇溶蛋白啟動(dòng)子(maize gamma coixin promoter本文中通過(guò)援引并入的美國(guó)專(zhuān)利6，635，806或其同源物，本文中稱(chēng)作P-Zm.Gcx)，或者將用于本發(fā)明DNA構(gòu)建體中的任一啟動(dòng)子或提供玉米種子中增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的其它已知啟動(dòng)子在本文中稱(chēng)作P-Zm.種子。在種子中有功能的其它啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于驅(qū)動(dòng)種子貯藏蛋白(如稻的麥谷蛋白和麥(Triticeae)物種的谷醇溶蛋白)表達(dá)的啟動(dòng)子，以及控制參與種子中淀粉合成的酶的表達(dá)的啟動(dòng)子，如驅(qū)動(dòng)單子葉植物ADP葡萄糖淀粉糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的啟動(dòng)子。所選擇的種子啟動(dòng)子與DHDPS編碼區(qū)(例如，SEQ ID NO:1，本文中 稱(chēng)作CORgl.dapA)或天冬氨酸激酶編碼區(qū)(例如，SEQ ID NO:3)可操作連接。其它的種子增強(qiáng)性和種子特異性啟動(dòng)子是現(xiàn)有技術(shù)中已知的并且可以通過(guò)本發(fā)明中所述的方法或植物分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的相似方法在與本發(fā)明的DNA編碼分子和非編碼分子可操作連接的情況下選擇并試驗(yàn)。種子增強(qiáng)性啟動(dòng)子主要在種子的全部或部分中表達(dá)，不過(guò)該啟動(dòng)子可以次要地在植物的其它植物細(xì)胞、組織或器官中表達(dá)。種子的部分包括但不限于胚、胚乳、種衣、胚芽鞘、子葉、下胚軸、粉糊層、果皮或小盾片。在DNA構(gòu)建體中提供的其它調(diào)節(jié)區(qū)可以包括，但不限于內(nèi)含子(1-)、運(yùn)輸信號(hào)(TS-)、5,非翻譯前導(dǎo)序列(L_)、3'多腺苷酸化區(qū)(T-)或非編碼反義區(qū)。也可以包括選擇性或可計(jì)分的標(biāo)記表達(dá)盒以輔助選擇或鑒定已轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和組織。本發(fā)明的構(gòu)建體任選地含有向玉米植物提供草甘膦耐受性并且可以用作選擇標(biāo)記的表達(dá)盒。如本文中所用，"轉(zhuǎn)基因"意指并入宿主基因組中或能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制并能夠引起一種或多種細(xì)胞產(chǎn)物表達(dá)的外源性DNA。示例性轉(zhuǎn)基因?qū)樗拗骷?xì)胞、從宿主細(xì)胞中再生的植物或這些植物的部分提供相對(duì)于對(duì)應(yīng)的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞或植物的新表型，例如玉米種仁中增加的賴(lài)氨酸。轉(zhuǎn)基因可以通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化直接導(dǎo)入植物，并且優(yōu)選地是穩(wěn)定及可遺傳的以至于它們可以從用該外源性DNA轉(zhuǎn)化的任何先前世代的植物中繼承。
如本文中所用，"基因"或"編碼序列"意指從其中轉(zhuǎn)錄RNA分子的DNA分子。DNA分子為編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的mRNA或?yàn)榘l(fā)揮基因抑制分子作用的RNA或結(jié)構(gòu)性RNA分子如tRNA、rRNA、snRNA或其它RNA提供編碼區(qū)(CR-)。如本文中所用，"表達(dá)"指胞內(nèi)過(guò)程的組合，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯，其中DNA分子如基因通過(guò)所述過(guò)程產(chǎn)生多肽或RNA分子。示例性編碼序列是用于產(chǎn)生具有增加的賴(lài)氨酸的玉米種仁的棒狀桿菌(Corynebacterium) 二氫批啶二羧酸合酶基因(DHDPS;Bonnassie等，1990;Richaud等，1986)。受到轉(zhuǎn)化以含有并表達(dá)棒狀桿菌DHDPS基因或含有并表達(dá)導(dǎo)致種仁組織中賴(lài)氨酸增加的任何其它基因的玉米植物也稱(chēng)作高賴(lài)氨酸玉米植物。本發(fā)明的棒狀桿菌DHDPS編碼區(qū)額外地受到修飾以便在植物細(xì)胞、優(yōu)選在單子葉植物細(xì)胞并且最優(yōu)選在玉米細(xì)胞中提供增強(qiáng)的表達(dá)。用于本發(fā)明中的修飾棒狀桿菌DHDPS編碼區(qū)公開(kāi)為SEQ ID NO:5，本文中稱(chēng)作CORgl.dapA.nno。
如本文中所用，"啟動(dòng)子"意指啟動(dòng)RNA從DNA中轉(zhuǎn)錄的DNA序列區(qū)域。啟動(dòng)子位于待轉(zhuǎn)錄DNA的上游,具有起到RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)作用的區(qū)域(canonical regions),并且具有與其它因子一起工作以促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。更具體地，植物中的基礎(chǔ)啟動(dòng)子包含與轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)相關(guān)的正則區(qū)域，如CAAT盒和TATA盒。在本發(fā)明中，優(yōu)選的啟動(dòng)子分子和5' UTR分子允許在種子細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)錄處在比植物其它細(xì)胞和組織中更高的速率或水平上。啟動(dòng)子分子可以從本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子中選擇，例如所述啟動(dòng)子在美國(guó)專(zhuān)利6，437，217(玉蜀黍1 81啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利5，641，876 (稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，426，446 (玉蜀黍RS324啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，429，362 (玉蜀黍PR-1啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，232，526(玉蜀黍A3啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，177，611 (組成型玉蜀黍啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利5，322，938,5, 352，605,5, 359，142 和 5，530，196 (35S 啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利 6，433，252 (玉蜀黍L3油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子，P-Zm.L3)、美國(guó)專(zhuān)利6，429，357 (稻肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子以及稻肌動(dòng)蛋白2內(nèi)含子)、美國(guó)專(zhuān)利5，837，848 (根特異性啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，294，714 (光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，140，078 (鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，252，138 (病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，175，060 (磷缺乏誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、美國(guó)專(zhuān)利6，635，806 ( Y -薏苡醇溶蛋白啟動(dòng)子，PC1.Gcx)和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)09/757，089 (玉蜀黍葉綠體醛縮酶啟動(dòng)子)中描述，全部文獻(xiàn)均通過(guò)援引并入·。此外，可以構(gòu)建這樣的嵌合啟動(dòng)子分子，其具有進(jìn)一步增強(qiáng)用于本發(fā)明中的啟動(dòng)子表達(dá)情況的衍生自異質(zhì)來(lái)源的順式元件。例如，已經(jīng)證實(shí)植物病毒啟動(dòng)子元件在可操作連接時(shí)對(duì)植物啟動(dòng)子元件提供增強(qiáng)(美國(guó)專(zhuān)利6，660，911，在本文中完整地通過(guò)援引并入)。
用在轉(zhuǎn)化植物中的DNA構(gòu)建體典型地除了啟動(dòng)子之外還包含其他調(diào)節(jié)元件，例如，但不限于3'非翻譯區(qū)(含有聚腺苷酸化位點(diǎn))，用于將蛋白質(zhì)靶向至植物細(xì)胞的細(xì)胞器、尤其葉綠體、白色體或其它質(zhì)體細(xì)胞器中的運(yùn)輸或信號(hào)肽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道在設(shè)計(jì)有效植物表達(dá)載體中有用的多種內(nèi)含子、增強(qiáng)子、運(yùn)輸肽、靶向信號(hào)序列、5'和3'非翻譯區(qū)(UTRs)，如在例如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2003/01403641 (在本文中通過(guò)援引并入)中公開(kāi)的那些。
作為翻譯前導(dǎo)序列發(fā)揮作用的5' UTR是位于基因啟動(dòng)子序列與編碼序列之間的DNA遺傳元件。翻譯前導(dǎo)序列在充分加工的mRNA中的翻譯起始序列上游存在。翻譯前導(dǎo)序列可以影響初級(jí)轉(zhuǎn)錄物至mRNA的加工，或它可以影響mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率。翻譯前導(dǎo)序列的實(shí)例包括玉蜀黍和矮牽牛(petunia)熱休克蛋白前導(dǎo)序列(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，362，865)、植物病毒衣殼蛋白前導(dǎo)序列、植物Rubisco前導(dǎo)序列，不一而足(Turner和Foster, 1995)。在天然環(huán)境下與本發(fā)明中所述啟動(dòng)子分子連接的前導(dǎo)分子包括例如玉蜀黍B32前導(dǎo)序列(L-Zm.B32)、稻肌動(dòng)蛋白I前導(dǎo)序列(L-Os.Actl)、Y薏苡醇溶蛋白前導(dǎo)序列(L-Cl.Gcx)。
3'非翻譯區(qū)(3' UTR)或3'多腺苷酸化區(qū)意指與結(jié)構(gòu)性多核苷酸分子連接并位于該結(jié)構(gòu)性多核苷酸分子下游的DNA分子，并且包括提供聚腺苷酸化信號(hào)和能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達(dá)的其它調(diào)節(jié)信號(hào)的多核苷酸。聚腺苷酸化信號(hào)在植物中發(fā)揮作用以引起聚腺苷酸核苷酸添加至mRNA前體的3'末端。聚腺苷酸化序列可以從天然基因、從多種植物基因或從農(nóng)桿菌T-DNA基因中衍生。3' UTR區(qū)的實(shí)例是胭脂堿合酶3'區(qū)(nos3' ;Fraley 等、1983)、小麥 hspl7 (T-Ta.Hspl7)和 T-Ps.RbcS2:E9 (豌豆 rubisco 小亞基)，在TO0011200A2中公開(kāi)的那些3' UTR和現(xiàn)有技術(shù)中已知的其它3' UTR可以進(jìn)行測(cè)試并與DHDPS或AK編碼區(qū)組合地使用，本文中稱(chēng)作T-3’ UTR0
運(yùn)輸信號(hào)通常指與目的蛋白連接時(shí)指導(dǎo)該蛋白質(zhì)至特定組織、細(xì)胞、亞細(xì)胞位置或細(xì)胞器內(nèi)的肽分子。實(shí)例包括，但不限于葉綠體運(yùn)輸肽、核靶向信號(hào)和液泡信號(hào)。質(zhì)體運(yùn)輸肽在本發(fā)明中特別用于指導(dǎo)DHDPS酶在種子的質(zhì)體中的表達(dá)。葉綠體運(yùn)輸肽(CTP)可以加以工程化以與待引導(dǎo)至植物葉綠體內(nèi)的蛋白質(zhì)的氨基末端融合。眾多位于葉綠體的蛋白質(zhì)從核基因中表達(dá)作為前體并且通過(guò)CTP導(dǎo)向葉綠體，其中所述的CTP在輸出步驟期間被除去。葉綠體蛋白質(zhì)的實(shí)例包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基(RbcS2)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、集光復(fù)合體蛋白質(zhì)I和蛋白質(zhì)II和硫氧還蛋白F。已經(jīng)在體內(nèi)和體外證實(shí)非葉綠體蛋白質(zhì)可以通過(guò)使用與CTP形成的蛋白質(zhì)融合物而導(dǎo)向葉綠體并且CTP足以將蛋白質(zhì)導(dǎo)向葉綠體。合適的葉綠體運(yùn)輸肽如擬南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP (Klee 等，1987)和矮牽牛(Petuniahybrida)EPSPS CTP (della-Cioppa 等，1986)的引入已經(jīng)證實(shí)在轉(zhuǎn)基因植物中將異源蛋白質(zhì)導(dǎo)向葉綠體。本發(fā)明的玉米DapA CTP(SEQID NO:6，本文中稱(chēng)作TS-Zm.DapA)具有提供指導(dǎo)連接的DHDPS多肽至種子質(zhì)體中的用途。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以產(chǎn)生多種嵌合構(gòu)建體，其利用特定CTP的功能以輸出異源DHDPS多肽至植物細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)。對(duì)于葉綠體運(yùn)輸肽的用途描述，見(jiàn)通過(guò)援引并入的美國(guó)專(zhuān)利5，188，642?！?br>表I顯示與LKR基因抑制分子及DHDPS編碼分子可操作連接的啟動(dòng)子和其它調(diào)節(jié)元件的組合以及它們對(duì)玉米植物和種仁中賴(lài)氨酸水平所產(chǎn)生的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道具有相似功能的外源性DNA分子可以用表I中所示的那些外源性DNA分子進(jìn)行替換并在本文中所述的方法或在用于評(píng)價(jià)植物組織、種仁或加工產(chǎn)品內(nèi)賴(lài)氨酸水平的相關(guān)方法中測(cè)試。
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體可以任選地含有選擇性或可計(jì)分的標(biāo)記分子。特別重要的是還提供有價(jià)值的農(nóng)藝性狀例如除草劑耐受性的選擇標(biāo)記分子。已對(duì)其證實(shí)轉(zhuǎn)基因植物耐受性并且可以適用本發(fā)明方法的除草劑包括，但不限于:草甘膦、草胺磷、磺酰脲類(lèi)、咪唑啉酮類(lèi)、溴苯腈、茅草枯、環(huán)己二酮、原卟啉原氧化酶抑制劑和異卩惡唑草酮(isoxafIutole)除草齊U。編碼參與除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且包括但不限于編碼用于草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(EPSPS，在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，627，061 ;5，633，435 ;6，040，497 ；Padgette 等，1996 ;和 Penaloza-Vazquez 等，1995 中描述)和aroA(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，094，945);用于溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，810，648);八氫番茄紅素去飽和酶(crtl，Misawa等，1993和1994);用于氟草敏耐受性的乙酰輕酸合酶(AHAS,akaALS, Sathasiivan等，1990)和用于草胺磷和雙丙氨磷耐受性的bar基因(DeBlock等，1987)的多核苷酸分子。
除草劑耐受性是作物植物所期望的表型。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體優(yōu)選地含有在轉(zhuǎn)化的玉米植物中提供草甘膦耐受性的表達(dá)盒。此外，表達(dá)盒允許在含有草甘膦的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞。表達(dá)盒優(yōu)選地含有指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中所述的基因在轉(zhuǎn)化植物的全部細(xì)胞中編碼草甘膦抵抗的(enzyme resistance)EPSPS。尤其,本發(fā)明的草甘膦耐受表達(dá)盒包含與編碼葉綠體運(yùn)輸肽的多核苷酸和編碼草甘膦抵抗性EPSPS的多核苷酸可操作連接的稻肌動(dòng)蛋白I啟動(dòng)子和內(nèi)含子(P-Os.Actl，IOs.Actl，美國(guó)專(zhuān)利5，641，876，在本文中通過(guò)援引并入)，其中所述的草甘膦抵抗性EPSPS從農(nóng)桿菌菌株CP4中分離(本文中稱(chēng)作aroA:CP4EPSPS，美國(guó)專(zhuān)利5，633，435，在本文中通過(guò)援引并入)。N-膦?；谆拾彼?，也稱(chēng)作草甘膦，是對(duì)廣泛類(lèi)型植物物種有活性的眾所周知的除草劑。草甘膦是在環(huán)境中具有理想短半衰期的一種安全除草劑Roundup 除草劑(Monsanto C0., St.Louis,MO)的活性成分。當(dāng)施加至植物表面時(shí)，草甘膦分布至植物全身。草甘膦因阻斷提供芳族氨基酸合成前體的莽草酸途徑而對(duì)植物有毒。具體而言，草甘膦通過(guò)抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(下文稱(chēng)作EPSP合酶或EPSPS)而影響磷酸烯醇丙酮酸與3-磷代莽草酸(3-phosphoshikimic acid)轉(zhuǎn)化成5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸。為本發(fā)明目的，術(shù)語(yǔ)"草甘膦"應(yīng)當(dāng)認(rèn)為包括N-膦?；谆拾彼?包括其任何鹽)的任何有除草劑有效形式和導(dǎo)致在植物中產(chǎn)生草甘膦陰離子的其它形式。草甘膦如N-膦?；谆拾彼峒捌潲}用作合成培養(yǎng)基的成分以選擇細(xì)菌和植物對(duì)草甘膦的耐受性或用來(lái)在體外生物化學(xué)分析中確定酶抵抗性(enzyme resistance)。草甘膦商業(yè)制劑的實(shí)例包括而不限于由孟山都公司在除草劑商標(biāo) ROUNDUP 、ROUNDUP ULTRA、ROUNDUP ULTRAMAX、ROUNDUP ㊣CT、ROUNDUP ㊣ EXTRA、ROUNDUP BIACTIVE、ROUNDUP B10F0RCE、RODEO 、POLARIS 、SPARK i 和ACCORD⑧除草劑下出售的那些商業(yè)制劑，這些商業(yè)制劑均含有作為其異丙基銨鹽的草甘膦；由孟山都公司作為R0UNDUP DRY和RIVAL 除草劑出售的那些商業(yè)制劑，含有作為銨鹽的草甘膦；由孟山都公司作為ROUNDUP GE0F0RCE出售的商業(yè)制劑，含有作為鈉鹽的草甘膦；由孟山都公司作為ROUNDUP WEATHERMAX出售的商業(yè)制劑，含有作為鉀鹽的草甘膦；由Zeneca Limited作為T(mén)OUCHDOWN 除草劑出售的商業(yè)制劑，含有作為三甲基锍鹽(trimethylsulfonium)的草甘膦。草甘膦除草劑制劑可以安全地以低至8盤(pán)司/英畝并至多到64盎司/英畝的比率在草甘膦耐受作物的頂部施用以控制田間雜草。實(shí)驗(yàn)中，草甘膦已經(jīng)以低至4盎司/英畝并至多到或超過(guò)128盎司/英畝的比率施用于草甘膦耐受作物，而不明顯損害作物植物。選擇形成生物有效劑量的草甘膦制劑施用比率處在普通農(nóng)業(yè)技術(shù)人員的技術(shù)能力范圍內(nèi)。為說(shuō)明產(chǎn)生具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力，參考美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0106096A1和2002/0112260A1和美國(guó)專(zhuān)利5，034，322 ;6，107，549和6，376，754，全部文獻(xiàn)均通過(guò)援引并入。本發(fā)明提供具有增加的賴(lài)氨酸的玉米植物并且任選地是草甘膦耐受的。
在轉(zhuǎn)化期間，外源性DNA可以隨 機(jī)地即在非特異性位置上導(dǎo)入植物基因組中。在一些情況下，例如為了替換基因組中現(xiàn)存的基因序列或區(qū)域，定向插入外源性DNA以便實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性整合可能是有用的。在另一些情況下，在預(yù)定的位點(diǎn)處使外源性DNA定向整合至基因組可能是有用的，其中已知在所述的位點(diǎn)存在基因表達(dá)。存在已知在植物中有功能的幾個(gè)位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，包括如美國(guó)專(zhuān)利4，959，317中公開(kāi)的Cre/lox和如美國(guó)專(zhuān)利5，527，695中公開(kāi)的FLP/FRT，這兩份文獻(xiàn)均通過(guò)援引并入。
有用的選擇標(biāo)記基因包括賦予對(duì)抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素(nptll)、潮霉素B(aphlV)和慶大霉素(aac3和aacC4)抗性的那些選擇標(biāo)記基因，或如美國(guó)專(zhuān)利5，550，318 ;5，633，435 ;5，780，708和6，118，047中所述的選擇標(biāo)記基因，全部文獻(xiàn)在本文中通過(guò)援引并入。也可以使用提供目視鑒定轉(zhuǎn)化體的能力的可篩選標(biāo)記，例如表達(dá)有色蛋白質(zhì)或熒光蛋白如螢光素酶或綠色熒光蛋白(GFP)的基因或表達(dá)已知有多種生色底物的β-葡糖醛酸酶或UidA基因(GUS)的基因。
某因抑制
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體提供對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中內(nèi)源性L(fǎng)KR基因(賴(lài)氨酸-酮戍二酸還原酶(LKR,植物中的一種雙功能酶，也稱(chēng)作酵母氨酸脫氫酶(saccharopinedehydrogenase), SDH)特異的反義RNA基因抑制分子的表達(dá)。這種DNA構(gòu)建體包含在作為酶抑制靶標(biāo)的組織中有活性的啟動(dòng)子和具有如此序列的可轉(zhuǎn)錄DNA元件，其中所述的序列與作為抑制靶標(biāo)的LKR基因的多核苷酸序列互補(bǔ)。為用于基因抑制構(gòu)建體中的可轉(zhuǎn)錄DNA而拷貝的靶定基因元件可以是啟動(dòng)子元件、內(nèi)含子元件、外顯子元件、5' UTR元件或3' UTR元件。雖然從作為抑制靶標(biāo)的基因的序列中拷貝的DNA最小尺度據(jù)信是約21或23個(gè)核苷酸；優(yōu)選更大的核苷酸節(jié)段，例如至多到靶向基因的全長(zhǎng)。DNA元件可以包含基因的多個(gè)部分，例如與連續(xù)或間斷的基因元件UTR、外顯子和內(nèi)含子互補(bǔ)的核苷酸。此類(lèi)構(gòu)建體也可以根據(jù)需要包含其它調(diào)節(jié)元件、編碼運(yùn)輸肽、信號(hào)肽、選擇標(biāo)記和可篩選標(biāo)記的DNA。為形成反義方向的RNA環(huán)，互補(bǔ)DNA元件方便地不超過(guò)反義方向DNA元件的約一半長(zhǎng)度，常常不超過(guò)所述反義方向DNA元件的三分之一長(zhǎng)度，例如不超過(guò)所述反義方向DNA元件的四分之一長(zhǎng)度。合并的DNA元件的總長(zhǎng)度可以變化。例如反義方向的DNA元件可以由500-5000個(gè)核苷酸構(gòu)成，并且互補(bǔ)性DNA元件 可以由50-500個(gè)核苷酸構(gòu)成。
可以設(shè)計(jì)反義轉(zhuǎn)錄單位以抑制多個(gè)基因或基因家族成員，其中DNA與來(lái)自作為抑制靶標(biāo)的不同基因中的兩個(gè)或多個(gè)反義方向元件排列在一起，隨后是互補(bǔ)性有義方向元件，例如與最5'端反義元件的至少一部分互補(bǔ)。
基因抑制包括用于抑制基因轉(zhuǎn)錄或與該基因相對(duì)應(yīng)的mRNA積累因而阻止轉(zhuǎn)錄物翻譯成蛋白質(zhì)的眾所周知的任何方法。轉(zhuǎn)錄后基因抑制由已整合重組DNA的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)，以形成與作為抑制靶標(biāo)的基因具有同源性的雙鏈RNA (dsRNA)。這種dsRNA的形成最常見(jiàn)因靶基因整合的倒置重復(fù)的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生，并且是稱(chēng)作反義抑制、共抑制和RNA干擾(RNAi)的基因抑制方法的共同特征。轉(zhuǎn)錄性抑制可以由轉(zhuǎn)錄的dsRNA介導(dǎo)，其中所述轉(zhuǎn)錄的dsRNA與實(shí)施所謂啟動(dòng)子反式抑制的啟動(dòng)子DNA序列具有同源性。
更具體地，在美國(guó)專(zhuān)利5，107，065 (Shewmaker等)和美國(guó)專(zhuān)利5，759，829 (Shewmaker等)中公開(kāi)了通過(guò)插入具有反義方向DNA的重組DNA構(gòu)建體以便調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因抑制。使用抑制基因的這類(lèi)反義方向DNA構(gòu)建體所轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物可以包含排列作為倒置重復(fù)的整合DNA，其中所述的倒置重復(fù)因DNA構(gòu)建體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化而插入植物中產(chǎn)生,如由Redenbaugh等(1992)公開(kāi)。倒置重復(fù)插入物可以包含T-DNA構(gòu)建體的部分或全部，例如，完整轉(zhuǎn)錄單位的倒置重復(fù)或轉(zhuǎn)錄終止子序列的倒置重復(fù)。篩選包含倒置重復(fù)元件的插入DNA可以改進(jìn)鑒定有效發(fā)生基因沉默的轉(zhuǎn)化事件的效率，鑒定轉(zhuǎn)化構(gòu)建體是否為必須以多重拷貝進(jìn)行插入的簡(jiǎn)單反義DNA構(gòu)建體或是可以作為單個(gè)拷貝進(jìn)行插入的復(fù)雜倒置重復(fù)DNA構(gòu)建體(例如RNAi構(gòu)建體)。本發(fā)明DNA構(gòu)建體可以含有插入調(diào)節(jié)元件(例如內(nèi)含子)中的倒置重復(fù)序列。倒置重復(fù)序列包含與宿主植物細(xì)胞的內(nèi)源性L(fǎng)KR基因同源和互補(bǔ)的DNA分子。在本發(fā)明中，DNA分子(SEQ IDNO:9,dsSDH bfx，也稱(chēng)作 LKR dsRNA bfx)與編碼玉米 LKR/SDH(SEQ ID NO:2)的 DNA 的部分同源，并且用來(lái)抑制玉米天然LKRISDH基因的表達(dá)。注釋Bfx指用于基因抑制的通過(guò)分析靶分子并排除在某些其它生物中找到的相關(guān)靶序列而特異性選擇的dsRNA分子序列。在本文中所述的一些構(gòu)建體，LKR dsRNA bfx片段嵌入內(nèi)含子中(1-Zm.DnaK嵌入Zm.LKR dsRNAbfx, SEQ ID NO:10)?？梢赃x擇與玉米LKR基因序列同源和互補(bǔ)的其它多核苷酸以便用于本發(fā)明中。
因通過(guò)轉(zhuǎn)座元件產(chǎn)生的插入突變而實(shí)現(xiàn)的抑制也可以阻止基因功能。例如在眾多雙子葉植物中，可以便利地實(shí)現(xiàn)由農(nóng)桿菌T-DNA所致的轉(zhuǎn)化并且可以迅速得到大量的轉(zhuǎn)化植物。另外，一些物種如玉米存在具有有效轉(zhuǎn)座元件的品系，其中所述的有效轉(zhuǎn)座元件可以高效地用于產(chǎn)生大量的插入突變，而某些其它物種缺少這類(lèi)選擇余地?？梢允褂帽景l(fā)明的多核苷酸鑒定由農(nóng)桿菌或轉(zhuǎn)座子誘變產(chǎn)生并且具有目的多肽的變異表達(dá)的突變植物。例如，可以用編碼目的多肽的多核苷酸篩選突變植物的巨大群體以檢測(cè)在編碼目的多肽的基因中具有插入的突變植物。
蛋白質(zhì)分子
本發(fā)明的蛋白質(zhì)代表給予蛋白質(zhì)重要(relevant)生物學(xué)活性(例如轉(zhuǎn)基因玉蜀黍種仁中增加的賴(lài)氨酸含量)的完整蛋白質(zhì)或完整蛋白質(zhì)的至少足夠部分。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"也包括由一條或多條多肽鏈構(gòu)成的分子。因此，本發(fā)明中有用的蛋白質(zhì)可以構(gòu)成提供本發(fā)明農(nóng)藝性狀(即增加的賴(lài)氨酸)的完整基因產(chǎn)物或天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)功能部分。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的同源物可以如此鑒定，即通過(guò)例如手工比較或通過(guò)使用已知基于同源性的搜索算法如通常已知并稱(chēng)作BLAST、FASTA和Smith-Waterman的那些算法，比較DHDPS(SEQ ID NO:7)或天冬氨酸激酶(SEQ ID NO:8)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與來(lái)自相同或不同植物或細(xì)菌源的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
本發(fā)明的又一個(gè)方面提供編碼功能性同源蛋白質(zhì)的編碼序列，其中所述的編碼序列與本文中提供的DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的編碼序列相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸，這因一個(gè)或多個(gè)眾所周知的保守性氨基酸置換而產(chǎn)生，例如纈氨酸是亮氨酸的保守性置換物而蘇氨酸是絲氨酸的保守性置換物。當(dāng)這種同源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，同源蛋白質(zhì)將以基本上如DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)那樣的相同方式影響轉(zhuǎn)基因植物。
對(duì)天然蛋白質(zhì)序列中氨基酸的保守性置換可以從天然存在性氨基酸所屬的類(lèi)別的另一個(gè)成員中選擇。在這些多個(gè)類(lèi)別中的代表性氨基酸包括，但不限于:(I)酸性(帶負(fù)電荷)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2)堿性(帶正電荷)氨基酸如精氨酸、組氨酸和賴(lài)氨酸；(3)中性極性氨基酸如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非極性(疏水 性)氨基酸如亮氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。對(duì)天然蛋白質(zhì)序列中氨基酸的保守性置換可以從天然存在性氨基酸所屬的類(lèi)別的另一個(gè)成員中選擇。例如、具有脂族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守性氨基酸置換基團(tuán)是:纈氨酸-亮氨酸、纈氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、亮氨酸-纈氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺谷氨酰胺。
本發(fā)明的又一個(gè)方面包含這樣的蛋白質(zhì)，其與具有如所述DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)序列的那些蛋白質(zhì)相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸，這因天然序列中缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而產(chǎn)生。當(dāng)這種同源蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)時(shí)，同源蛋白質(zhì)將以基本上如DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)那樣的相同方式影響轉(zhuǎn)基因植物，例如導(dǎo)致玉蜀黍種仁中增加的賴(lài)
氨酸含量。
作為本文中所提供蛋白質(zhì)的變體的本發(fā)明蛋白質(zhì)通常將顯示與本文中所提供蛋白質(zhì)的顯著同一性，如與DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的至少50%或更高，例如至少60%或70%同一性。有用的蛋白質(zhì)也包括與DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)節(jié)段中的氨基酸具有更高同一性百分?jǐn)?shù)例如80%、90%、95%、98%或至多到99%同一性的那些蛋白質(zhì)。
轉(zhuǎn)化方法和植物
如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"玉蜀黍"意指玉米，也稱(chēng)作玉米，并且包括可以與玉蜀黍配種的全部植物品種，包括野生玉蜀黍種。
在實(shí)施 本發(fā)明中用于通過(guò)導(dǎo)入外源性DNA至植物基因組而使植物轉(zhuǎn)化的方法和組合物可以包括眾所周知并證實(shí)的任何方法。植物轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法是如美國(guó)專(zhuān)利5，015，580 ;5，550，318 ;5，538，880 ;6，160，208 ;6，399，861 和 6，403，865 中所示的微粒轟擊法和如在美國(guó)專(zhuān)利 5，635，055 ;5，824，877 ;5，591，616 ;5，981，840 和 6，384，301 和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20030196219中所示的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，全部所述文獻(xiàn)均通過(guò)援引并入。微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化指送遞包被在微粒上的DNA，其中所述的微粒通過(guò)幾種方法推動(dòng)至靶組織內(nèi)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通過(guò)使用屬于農(nóng)桿菌屬的基因工程化土壤細(xì)菌而實(shí)現(xiàn)。幾種農(nóng)桿菌種介導(dǎo)稱(chēng)作"T-DNA"的特定DNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，其中所述的DNA質(zhì)?？梢约右赃z傳工程化以攜帶任何所需的DNA片段至多種植物物種。
如本文中所用，"轉(zhuǎn)基因"生物是其基因組包含外源性DNA或分離的DNA的生物。轉(zhuǎn)基因生物可以是植物、動(dòng)物、昆蟲(chóng)、真菌、細(xì)菌或病毒。如本文中所用"轉(zhuǎn)基因植物"意指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物或源自其中的任何后續(xù)世代的子代植物，其中植物或其子代的DNA含有外源性DNA。
轉(zhuǎn)基因植物可以額外地含有對(duì)所轉(zhuǎn)化的植物為天然的序列，但是其中已經(jīng)變更外源性DNA以改變基因表達(dá)的水平或模式。
如本文中所用，"穩(wěn)定"轉(zhuǎn)化的植物是其中外源性DNA可遺傳的植物。外源性DNA可以作為維持于植物細(xì)胞中并且不插入宿主基因組內(nèi)的DNA片段而可遺傳。優(yōu)選地，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物包含在細(xì)胞核、線(xiàn)粒體或葉綠體的染色體DNA中插入、最優(yōu)選在細(xì)胞核的染色體DNA插入的外源性DNA。
如本文中所用"RO轉(zhuǎn)基因植物"是已經(jīng)用外源性DNA直接轉(zhuǎn)化的或已經(jīng)從已用外源性DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)中再生出的植物。如本文中所用，"子代"意指從特定的親代植物或成組親代植物中衍生的任何后繼世代，包括來(lái)自它們的種子和植物；得到的子代可以是高度雜合的或是基本上純合的，這取決于系譜。本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的子代可以例如自我授粉、與另一種轉(zhuǎn)基因植物雜交、與非轉(zhuǎn)基因植物雜交和/或與祖先回交。
本發(fā)明植物的種子可以從能育轉(zhuǎn)基因植物中收獲并且可以用來(lái)培育本發(fā)明植物的子世代，包括在其基因組中含有如本發(fā)明表I中所列的外源性DNA構(gòu)建體的雜種植物系，這提供在玉蜀黍種仁中賴(lài)氨酸增加的益處和任選地提供草甘膦除草劑耐受性。
轉(zhuǎn)基因"事件"通過(guò)如此方式產(chǎn)生，即用外源性DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再生由于外源性DNA特異性插入至植物基因組內(nèi)而產(chǎn)生的植物并且選擇以事件DNA為特征的特定植物。每一事件因此是因本發(fā)明外源性DNA構(gòu)建體的特定基因組插入位置而可區(qū)別于其它事件的獨(dú)特個(gè)體。事件DNA的檢測(cè)通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何數(shù)目的DNA檢測(cè)方法進(jìn)行，并且可以在含有DNA的事件的植物組織、種子和加工產(chǎn)品上實(shí)施。一般，轉(zhuǎn)化大量的植物細(xì)胞，每個(gè)植物細(xì)胞潛在地代表不同的整合事件，產(chǎn)生從中選擇出特定植物的植物群體。由于整合的位置通常經(jīng)歷重復(fù)的植物再生循環(huán)是穩(wěn)定的，因此術(shù)語(yǔ)"事件"指初始Rtl轉(zhuǎn)化體和轉(zhuǎn)化體的子代，其中所述的轉(zhuǎn)化體包括插入基因組的特殊和獨(dú)特位置內(nèi)的外源性DNA，即事件DNA。子代通過(guò)有性遠(yuǎn)交、自交或重復(fù)回交而產(chǎn)生，其中在育種中所用的植物的至少一種是來(lái)自初始Rtl轉(zhuǎn)化體的在任何世代上的后代，含有相同的事件DNA。
在加工本發(fā)明的種子和谷物以產(chǎn)生飼料和食物產(chǎn)物中，正常的植物組織會(huì)被摧毀，植物細(xì)胞可以被破壞并且天然DNA及外源性植物表達(dá)盒可能不是充分完整的，尤其當(dāng)使用高溫、提取溶劑等時(shí)。然而，因?qū)嵤┍景l(fā)明而能夠得到的獨(dú)特加工產(chǎn)品可以便利地因包含天然DNA的片段和外源性植物表達(dá)盒的片段而得到鑒定。"片段"意指至少20堿基對(duì)長(zhǎng)度的可分離或可擴(kuò)增DNA節(jié)。此類(lèi)片段可以進(jìn)行測(cè)序或限制性作圖以證實(shí)與原材料的天然DNA或外源性表達(dá)盒的序列同一性。
`[0076]實(shí)施例
包括以下實(shí)施例以顯示本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解以下實(shí)施例中所公開(kāi)的技術(shù)代表本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在實(shí)施本發(fā)明中起到良好作用的方法，并且因此可以視為構(gòu)成本發(fā)明實(shí)施的優(yōu)選模式的實(shí)例。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮本公開(kāi)內(nèi)容的情況下應(yīng)當(dāng)理解，眾多變化可以在公開(kāi)的具體實(shí)施方案中產(chǎn)生并仍然得到可能或相似的結(jié)果而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
實(shí)施例1
DNA構(gòu)律體和棺物轉(zhuǎn)化
本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含與目的DNA可操作連接的調(diào)節(jié)分子。尤其，DNA構(gòu)建體包含啟動(dòng)子、內(nèi)含子、5'前導(dǎo)序列、編碼分子或非編碼分子和3'非翻譯區(qū)。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體使用多種分子方法和工具(如在SambiOOk等中所述那些分子方法和工具)制備，并且可以實(shí)施DNA操作領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的這些方法的變體以產(chǎn)生基本上相似的構(gòu)建體。方法如PCR擴(kuò)增、克隆和亞克隆方法用來(lái)以可操作構(gòu)型可操作地連接如表I中所列并在圖1-6中所示的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、運(yùn)輸肽、編碼分子、非編碼分子和3'非翻譯區(qū)。將DNA構(gòu)建體克隆至適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉蜀黍細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的一種或多種質(zhì)粒主鏈中，盡管可以選擇其它質(zhì)粒主鏈，例如，旨在分離DNA片段用于粒子槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的高拷貝數(shù)質(zhì)粒，或與其它細(xì)菌宿主兼容的質(zhì)粒。產(chǎn)生表I中列出的35種構(gòu)建體來(lái)測(cè)試表達(dá)策略的組合以便表達(dá)賴(lài)氨酸反饋抗性的DHDPS多肽(SEQ ID NO:7)和通過(guò)對(duì)玉蜀黍內(nèi)源性L(fǎng)KR/SDH基因(SEQID NO:2)的基因抑制或表達(dá)天冬氨酸激酶(SEQ ID NO:8)而阻遏賴(lài)氨酸異化。例如，這些策略包括:1)在胚中表達(dá)LKR-dsRNA ；2)在胚中表達(dá)DHDPS多肽和LKR-dsRNA ；3)在胚乳中表達(dá)DHDPS多肽和LKR-dsRNA ；4)在胚乳中表達(dá)DHDPS多肽并在胚中表達(dá)LKR-dsRNA ；5)表達(dá)DHDPS多肽和天冬氨酸激酶并且表達(dá)LKR-dsRNA。
轉(zhuǎn)基因植物的制備
分離包含不成熟胚或愈傷組織的玉米組織(LH198或LH244近交系)用于轉(zhuǎn)化，并且本發(fā)明的DNA構(gòu)建體使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(例如美國(guó)專(zhuān)利5，635，055 ；5，824，877 ;5，591,616 ;5，981，840和6，384，301，全部文獻(xiàn)均通過(guò)援引并入)插入玉米基因組。在玉米組織上接種被轉(zhuǎn)化以包含表I中所列DNA構(gòu)建體的農(nóng)桿菌。在暴露于轉(zhuǎn)化細(xì)菌后，使用補(bǔ)充草甘膦除草劑的培養(yǎng)基，利用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方案來(lái)增殖并選擇轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞。在選擇暴露于草甘膦除草劑而存活的細(xì)胞后，再生R0轉(zhuǎn)基因植物至成熟。種子從能育轉(zhuǎn)基因植物中收集，此后自交或與第二種玉米植物遠(yuǎn)交。實(shí)施分子分析以表征轉(zhuǎn)基因的插入。使用PCR、Southern印跡、Tagman. 測(cè)定或分子生物學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來(lái)鑒定包含單個(gè)的完整DNA構(gòu)建體插入的事件或接合性分析。將子代種子種植并且培育子代植物用于組織和子代種子的 賴(lài)氨酸分析。
實(shí)施例2_4] 測(cè)定S蜀黍組織和種子的賴(lài)氨酸含暈
多種方法用于測(cè)定植物組織、種子和加工產(chǎn)品的賴(lài)氨酸含量，例如在本發(fā)明中，使用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(LC-MS-MS)以分析用如表I內(nèi)所列DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化時(shí)所鑒定的多個(gè)事件的玉米種仁中的游離賴(lài)氨酸(份每百萬(wàn)份，ppm)，并且這種分析的結(jié)果在表I和表2中描述。每一事件的單個(gè)成熟玉米種仁樣品首先稱(chēng)重、研磨成精細(xì)均勻的粉末并用包含甲醇、水和甲酸的提取溶劑提取。在其中種仁形成大塊的情況下，使用大約30mg研磨粉末。使用液相色譜和多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)質(zhì)譜技術(shù)以分離樣品提取物中的賴(lài)氨酸。在分離后，賴(lài)氨酸使用其質(zhì)譜峰面積針對(duì)使用氘化d4-賴(lài)氨酸內(nèi)標(biāo)(IS)制備的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)校正曲線(xiàn)而定量。
在另一種方法中，玉米種仁的賴(lài)氨酸含量以通過(guò)高效液相色譜(HPLC)評(píng)估游離氨基酸為基礎(chǔ)。每一事件的單個(gè)種仁或種仁匯集物如所述研磨成精細(xì)均勻的粉末，并且在本例子中，大約30mg粉末用于分析。氨基酸用5%三氯乙酸提取并且通過(guò)用鄰苯二醛(OPA)的柱前伯胺衍生化進(jìn)行氨基酸檢測(cè)。使用反向色譜，通過(guò)位于每個(gè)氨基酸上的R基團(tuán)的疏水性實(shí)現(xiàn)分離。為幫助穩(wěn)定熒光團(tuán)，添加硫醇，如2-巰基乙醇(SHCH2CH2OH)或3-巰基丙酸(SHCH2CH2C00H)。
在通過(guò)用每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件中測(cè)量的游離賴(lài)氨酸水平(ppm)進(jìn)行平均化并在表I中總結(jié)。還鑒定了已分析種子的世代(F1、F2、F3和F4)。含有PM0N80378的轉(zhuǎn)基因玉米事件的Rl種子的游離賴(lài)氨酸水平量值示于表2。在分析的6個(gè)事件中5個(gè)事件的賴(lài)氨酸水平令人驚訝地高?？梢酝ㄟ^(guò)繁育含有表I中所述植物表達(dá)盒的多種組合的玉米事件而進(jìn)一步調(diào)整賴(lài)氨酸水平，以至于含有一種或多種表達(dá)盒的雜交親代的雜交種子具有所期望的賴(lài)氨酸水平。例如含有CordapA和大腸桿菌IysC(野生型或Ec.1ysC.mut，SEQ ID NO:11，編碼在四個(gè)位置S2A、C58G、T352I和A401G被修飾的蛋白質(zhì)的DNA分子)表達(dá)盒的近交親代可以與具有LKR dsRNA表達(dá)盒的親代配種以產(chǎn)生具有如此賴(lài)氨酸水平的雜合子代種子，其中所述的賴(lài)氨酸水平比兩種親代種子的賴(lài)氨酸水平的加和更高。其它組合如含有CordapA和LKR dsRNA的親代可以與LysC親代交配，或LysC和LKRdsRNA親代可以與CordapA親代交配以提供雜交種子中的出乎預(yù)料的高賴(lài)氨酸水平。
表1.從溫室和多種田間試驗(yàn)所分析的每個(gè)世代的賴(lài)氨酸(ppm)平均值
權(quán)利要求
1.DNA構(gòu)建體，其包含保藏至ATCC作為PTA-6734的質(zhì)粒pM0N93093中的植物表達(dá)盒。
2.玉米細(xì)胞，包含如權(quán)利要求
1的質(zhì)粒pM0N93093的一種或多種外源性植物表達(dá)盒。
3.權(quán)利要求
2所述的細(xì)胞，其中所述構(gòu)建體還包含編碼5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶的DNA分子。
4.權(quán)利要求
3所述的細(xì)胞，其中所述5-烯醇式丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶是aroA:CP4EPSPS。
5.權(quán)利要求
2所述的細(xì)胞，其中被轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生抑制賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的RNA分子的DNA分子是SEQ ID NO:9。
6.權(quán)利要求
2所述的細(xì)胞，其中所述DNA分子還包含編碼葉綠體運(yùn)輸信號(hào)肽的DNA序列，該DNA序列與編碼二氫吡啶二羧酸合酶或天冬氨酸激酶的DNA序列可操作連接。
7.權(quán)利要求
2所述的細(xì)胞，其中所述啟動(dòng)子是玉米B32啟動(dòng)子或玉米Y薏苡醇溶蛋白啟動(dòng)子或玉米L3啟動(dòng)子。
8.植物細(xì)胞，在其基因組內(nèi)包含如權(quán)利要求
1的質(zhì)粒pM0N93093的植物表達(dá)盒。
9.含有根據(jù)權(quán)利要求
2的完整或破裂細(xì)胞的加工產(chǎn)品，其中該產(chǎn)品是飼料、粗粉或粉。
10.用于產(chǎn)生谷粒的方法，包括步驟: a)用如權(quán)利要求
1的植物表達(dá)盒質(zhì)粒PM0N93093轉(zhuǎn)化植物品種的細(xì)胞； b)再生所述細(xì)胞為在其基因組內(nèi)具有所述表達(dá)盒的能育植物；和· c)從所述植物收獲種子， 因而該種子比未用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相同品種的種子具有更高的賴(lài)氨酸含量。
11.向人或低等動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)的方法，包括供給所述人或低等動(dòng)物這樣的飲食，其包含含有如權(quán)利要求
1的PM0N93093的植物表達(dá)盒的高賴(lài)氨酸玉米種子或來(lái)自該玉米種子的加工產(chǎn)品。
12.向人或低等動(dòng)物提供營(yíng)養(yǎng)的方法，包括供給所述人或低等動(dòng)物這樣的飲食，其包含含有來(lái)自種子中天然DNA的片段和如權(quán)利要求
1的PM0N93093的植物表達(dá)盒片段的高賴(lài)氨酸玉米種子或來(lái)自該玉米種子的加工產(chǎn)品。
13.種子的加工產(chǎn)品，包括步驟: a)用如權(quán)利要求
1的植物表達(dá)盒質(zhì)粒PM0N93093轉(zhuǎn)化植物品種的細(xì)胞； b)再生所述細(xì)胞為在其基因組內(nèi)具有所述表達(dá)盒的能育植物； c)從所述植物收獲種子，和 d)將所述種子加工成動(dòng)物飼料、或粗粉、或粉或油； 因而該種子比未用所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的相同品種的種子具有更高的賴(lài)氨酸含量。
專(zhuān)利摘要
本文中公開(kāi)了具有新的外源DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述的外源DNA構(gòu)建體表達(dá)二氫吡啶二羧酸合酶和賴(lài)氨酸酮戊二酸還原酶的基因抑制分子，其活性導(dǎo)致植物種子中增加的賴(lài)氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/82GKCN101321873 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200680045480
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2006年10月2日
發(fā)明者T·M·馬爾瓦, S·黃, M·H·呂蒂 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (2),