專利名稱：一種去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的方法及其專用載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的方法及其專用載體。
背景技術：
目前，轉(zhuǎn)基因植物在抗蟲抗除草劑方面的突出表現(xiàn)給人類社會帶來了巨大的經(jīng)濟和社會效益，與此同時，也帶來了風險，在轉(zhuǎn)基因操作中使用的選擇標記，多為抗生素基因或抗除草劑基因，這些基因如果通過生物鏈傳播，將給生態(tài)環(huán)境造成極大的破壞，最后危及人類社會。因此如何去除選擇標記基因成為必須解決的問題。目前，較為常用的去除植物選擇標記基因的方法有雙T-DNA法，即在一個植物表達載體上將選擇標記基因和功能基因分別構建在兩個T-DNA結(jié)構內(nèi)，共轉(zhuǎn)化，利用后代分離的原理在轉(zhuǎn)基因后代中選擇不帶選擇標記的植株(T-DNA integration intothe barley genome from single and double cassette vectors Rainer Stahl，Henriette Horvath，Jennifer Van Fleet，Michael Voetz，Diter von Wettstein，and Norbert Wolf.Proc Natl Acad Sci U S A.2002February 19；99(4)2146-2151)；還有利用細菌由來的位點特異性重組酶去除選擇標記，如Cre-loxP法，在選擇標記兩端連上loxP序列，通過Cre蛋白的作用，得到無選擇標記的后代(Chemical-regulated，site-specific DNA excision in transgenic plants.NatBiotechnol.2001 Feb；19(2)157-61.Zuo J，Niu QW，Moller SG，Chua NH.)等等。這些方法或需要一個雜交或者后代分離的過程，或會在植物中留下微生物來源片段。
根據(jù)選擇標記基因不同的作用方式，可把它分為正篩選標記和負篩選標記，使轉(zhuǎn)化材料在特定篩選劑的作用下或在特定環(huán)境下存活的，該選擇標記基因為正篩選標記，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因等；使轉(zhuǎn)化材料在特定篩選劑的作用下或特定環(huán)境下死亡的，該選擇標記基因為負篩選標記，如胞嘧啶脫氨酶基因、氨基水解酶基因、乙醇脫氫酶基因等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的方法及其專用載體。
本發(fā)明所提供的去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體，含有正篩選標記基因，其中，在所述選擇標記基因的兩側(cè)分別連接有一段相同的同向重復序列。
所述重復序列可來源于植物，動物，微生物或人工合成。
所述重復序列的長度至少為300bp，越長重組頻率越高。
所述正篩選標記基因可為抗性標記基因或代謝標記基因。
所述抗性標記基因包括抗生素抗性基因(如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因等等)、和抗除草劑基因(如乙酰CoA轉(zhuǎn)移酶基因基因、草苷磷氧化還原酶基因、氨晴水合酶基因等等)。
所述代謝標記基因可為異戊基轉(zhuǎn)移酶、組氨酸激酶等等。
為了便于驗證轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標記是否去除，在所述兩段相同的同向重復序列之間連接有負篩選標記基因。
所述負篩選標記基因可為胞嘧啶脫氨酶基因或氨基水解酶基因、乙醇脫氫酶基因等。
本發(fā)明所提供的去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的方法，是將上述去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體轉(zhuǎn)化目的植物，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物，再用所述正篩選標記基因?qū)暮Y選標記篩選，不能生長的植物為去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物。
所述方法中，還包括下述驗證步驟將得到的去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物再在負選擇標記基因?qū)倪x擇標記中篩選，能生長的植物為去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物。
所述重復序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。
序列表中序列1的核苷酸序列為水稻rubisco基因的3’末端片段，長為732bp。
所述水稻rubisco基因的3’末端片段可以水稻基因組DNA為模板，用正向引物和反向引物進行PCR擴增得到；所述正向引物的自5′端的第1位至第26位脫氧核苷酸為5′AGCATGCTGGCAACTAAGCCGTCATC 3′；所述反向引物的自5′端的第1位至第21位脫氧核苷酸為5′TATCATCTGCCAACCTTTCTG 3′。
所述重復序列具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列表中序列2的核苷酸序列為水稻ubiquitin基因的3’末端片段，長為1535bp。
所述水稻ubiquitin基因的3’末端片段可以水稻基因組DNA為模板，用引物對1或引物對2進行PCR擴增得到；所述引物對1為正向引物5′TGGTGGTCAGTAATCAGCCAGTT 3′，反向引物5′ATGCATCTAGTATTTATAGTCCTGAGCTTACTTA 3′；所述引物對2為正向引物5’GCATGCTGGTGGTCAGTAATCAGCC3’，反向引物5’ATGCATCTAGTATTTATAGTCCTGAGCTTACTTA 3’本發(fā)明的方法適合于雙子葉植物，如煙草、馬鈴薯、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油料種子、甜菜或向日葵等，還適合于單子葉植物，如高羊茅草、其它草坪草、小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米等。
導入本發(fā)明所述去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體的細胞系、宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。
本發(fā)明利用同源重組的原理去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記，在轉(zhuǎn)基因當代即可去除選擇標記，不僅周期短，而且能在樹木等無法進行有性繁殖的植物中應用。


圖1為去選擇標記載體pNE103的物理圖譜圖2為轉(zhuǎn)pNE103質(zhì)粒煙草的PCR產(chǎn)物電泳3為去選擇標記載體pNE101::Pubi-gusA的物理圖譜圖4為轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA高羊茅愈傷組織的GUS活性檢測結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實施例1、轉(zhuǎn)pNE103煙草的去選擇標記實驗一、去選擇標記載體pNE103的構建以常規(guī)方法構建去選擇標記載體pNE103(圖1)。在此載體中負篩選標記基因胞嘧啶脫氨酶基因(codA)是由大腸桿菌經(jīng)PCR得到。PCR引物為codA-S5’-GTCGACATGTCGAATAACGCTTTACAAA-3’，codA-A5’-CTCGAGTCAACGTTTGTAATCGATGG-3’。PCR反應體系為共25ul含有大腸桿菌K12菌體、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM codA-S和1μM codA-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。將擴增得到的1296bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用XhoI和KpnI雙酶切該片段插入pUC19質(zhì)粒的XhoI和KpnI位點間，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明得到含有胞嘧啶脫氨酶基因(codA)的質(zhì)粒，命名為pUC19::codA。
用PCR方法擴增35S的3’末端序列。以pCAMBIA1300(CAMBIA公司)為模板，PCR引物為35SpolyA-S5’-GATCTGTCGATCGACAAGCTC-3’，35SpolyA-A15’-GGTACCGCATGCTAATTCGGGGGATCTGGAT-3’，進行PCR擴增。PCR反應體系共25ul含有100ng pCAMBIA1300(CAMBIA公司)質(zhì)粒DNA、1.5mM MgCl2、20mMTris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM 35SpolyA-S和1μM35SpolyA-Al，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到的227bp的DNA片段，用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，將回收片段連接到pGEM-Teasy，測序(三博遠志生物技術公司)，并用SalI和KpnI雙酶切后，插入pUC19::codA的XhoI和KpnI位點間，經(jīng)測序表明得到的質(zhì)粒含有擴增得到的35S的3’末端序列，將該質(zhì)粒命名為pUC19::codA-35SpolyA。
用PCR方法擴增水稻actin基因的啟動子序列。用CTAB法(Steiner JJ，PoklembaCJ，F(xiàn)jellstrom RG，Elliott LF.，A rapid one-tube genomic DNA extractionprocess for PCR and RAPD analyses.Nucleic Acids Res.1995 Jul11；23(13)2569-70.)提取水稻基因組DNA，具體方法如下取水稻葉片，以液氮研磨，每1克的植物材料中加入5毫升經(jīng)68℃預熱的CTAB溶液(用前加10mM巰基乙醇)，60℃加熱30分鐘。然后加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，15000g離心15分鐘，取上清。在上清液中加入2/3倍體積的異丙醇，混勻，用注射針針尖將DNA絲攪出置于新管中，再加入75％乙醇，洗滌沉淀及離心管壁，然后將乙醇吸干，空氣烘干剩余的乙醇，加入TE溶解DNA。并于-20℃保存。以該水稻基因組DNA為模板，引物為Actin-S5’-CTCGAGTCTTCTACCTACAAAAAAGCTCC-3’，act in-A5’-CTCGAGGTCATTCATATGCTTGAG-3’，進行PCR擴增。PCR反應體系為共25ul，含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Actin-S和1μM actin-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到的1410bp的DNA片段，用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，并連接到pGEM-Teasy vector，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明該擴增得到的片段為具有actin基因的啟動子序列的片段，將其用XhoI酶切后插入pUC19::codA-35SpolyA的XhoI位點，得到質(zhì)粒pUC19::Pactin-codA-35SpolyA。
用PCR方法擴增兩段帶不同酶切位點的水稻ubiquitin基因的3’末端序列片段。以上述提取的水稻基因組DNA為模板，引物為Tubi-S15’-TGGTGGTCAGTAATCAGCCAGTT-3，Tbui-A5’-ATGCATCTAGTATTTATAGTCCTGAGCTTACTTA-3’，進行PCR擴增。PCR反應體系共25ul含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Tubi-S1和1μM Tubi-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到1541bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescriptII KS(-)(STRATAGENE公司)的HincII位點，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明擴增產(chǎn)物為具有序列表中序列2中第1位至1535位的核苷酸序列的水稻ubiquitin基因的3’末端序列片段，將含有該片段的pBluescriptIIKS(-)質(zhì)粒命名為pBS::Tubi-A。
以水稻基因組DNA為模板，以Tubi-S25’-GCATGCTGGTGGTCAGTAATCAGCC-3’，Tbui-A5’-ATGCATCTAGTATTTATAGTCCTGAGCTTACTTA-3’為引物，進行PCR擴增。PCR反應體系共25ul含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Tubi-S2和1μM Tubi-A，1U的Pfu酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到1547bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入到pBluescriptII KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoRV位點，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明擴增產(chǎn)物為具有序列表中序列2中第1位至1535位的核苷酸序列的水稻ubiquitin基因的3’末端序列片段，將含有該片段的pBluescript II KS(-)質(zhì)粒命名為pBS::Tubi-B。
用PCR方法擴增35S的3’末端序列。以pCAMBIA1300(CAMBIA公司)為模板，引物為35SpolyA-S5’-GTCGACGATCTGTCGATCGACAAGCTC，35SpolyA-A25’GTCGACTAATTCGGGGGATCTGGAT。PCR反應體系共25ul中含有100ngpCAMBIA1300(CAMBIA公司)質(zhì)粒DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mMKCl、0.8mM dNTP混合物、1μM 35SpolyA-S和1μM 35SpolyA-A2，1U的Pfu聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。將擴增得到的221bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，并用SalI酶切后，插入pBluescript II KS(-)(STRATAGENE公司)的相同位點，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明得到了含有擴增產(chǎn)物35S的3’末端序列片段的質(zhì)粒，將其命名為pBS::35SpolyA2。
以pCAMBIA1300(CAMBIA公司)為模板，引物為TBL-S5’-CTGCAGATTCGGCGTTAATTCAGTACA-3’，TBL-A5’-ATACCTTAGCAGGAGACATTCC-3’。25ul PCR反應體系含有100ng pCAMBIA1300(CAMBIA公司)質(zhì)粒DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM TBL-S和1μM TBL-A，1U的Pfu聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到616bp的片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，插入pBluescriptII KS(-)(STRATAGENE公司)的EcoRV位點，測序(三博遠志生物技術公司)，測序結(jié)果表明得到了包含T左邊界的DNA片段的質(zhì)粒，將其命名為pBS::TBL。
將質(zhì)粒pBS::35SpolyA2用SalI酶切下含35S的3’末端序列的片段插入pBS::Tubi-A的XhoI位點，得到質(zhì)粒pBS::35SpolyA2-TubiA。
將質(zhì)粒pBS::TBL用PstI/SacII酶切下含T左邊界的序列片段插入pBS::35SpolyA2-TubiA的NsiI/SacII位點，得到質(zhì)粒pBS::35SpolyA2-TubiA-TBL。
將質(zhì)粒pBS::35SpolyA2-TubiA-TBL中的含35SpolyA2-TubiA-TBL片段用SacII/XhoI切下插入pCAMBIA1300(CAMBIA公司)的相同位點得到質(zhì)粒pNE3。
將pCAMBIA1300上的潮霉素基因用XhoI切下插入pNE3的相同位點處，得到質(zhì)粒pC1300::35SpolyA-Tubi-TBL。
將質(zhì)粒pBS::Tubi-B用NsiI酶切下含水稻ubiquitin基因的3’末端序列片段插入質(zhì)粒pUC19::Pactin-codA-35SpolyA的SbfI位點，得到質(zhì)粒pUC19::Tubi-Pactin-codA-35SpolyA。
從質(zhì)粒pUC19::Tubi-Pactin-codA-35SpolyA上用SphI切下含Tubi-Pactin-codA-35SpolyA序列的片段并插入pCAMBIA1300的BstxI位點，得到質(zhì)粒pC1300::Tubi-codA。
從質(zhì)粒pC1300::35SpolyA-Tubi-TBL上用AatII/SacII切下含35SpolyA-Tubi-TBL序列的片段并插入pC1300::Tubi-codA的相同位點，得到質(zhì)粒pNE103。
在pNE103載體中負篩選標記基因codA基因受水稻actin啟動子的調(diào)控并與正篩選標記基因潮霉素基因相連，在這兩個表達結(jié)構的外測兩端是兩段同向重復的水稻ubiquitin基因的3’末端片段，長為1535bp。
二、轉(zhuǎn)pNE103煙草的去選擇標記實驗將pNE103轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到農(nóng)桿菌菌株TpNE103。用無菌刀片將幼嫩的煙草無菌苗葉片切成四邊長約1cm的葉盤，在TpNE103菌液中浸泡10分鐘，轉(zhuǎn)接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基，于25℃暗培養(yǎng)3天，再轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)三天，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2-3cm時，用解剖刀將再生芽切下，并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，取2棵轉(zhuǎn)基因植株繼續(xù)后續(xù)實驗。
每升共培養(yǎng)培養(yǎng)基成分如下MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美國)0.1mg、蔗糖(北京益利精細化學品有限公司)30g，pH5.2。
每升繼代培養(yǎng)基成分如下MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美國)0.1mg、羧芐青霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)250mg、蔗糖(北京益利精細化學品有限公司)30g，pH5.8。
每升篩選培養(yǎng)基成分如下MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)1.0mg、吲哚乙酸(Gibco，美國)0.1mg、羧芐青霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)250mg、潮霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)30mg、蔗糖(北京益利精細化學品有限公司)30g，pH5.8。
每升再生培養(yǎng)基成分如下MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤(Sigma，美國)1.0mg、羧芐青霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)250mg、潮霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)30mg、蔗糖(北京益利精細化學品有限公司)30g，pH5.8。
每升生根培養(yǎng)基成分如下MS基本培養(yǎng)基加潮霉素(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)30mg、蔗糖(北京益利精細化學品有限公司)20g，pH5.8。
用CTAB法(Steiner JJ，Poklemba CJ，F(xiàn)jellstrom RG，Elliott LF.，Arapidone-tube genomic DNA extraction process for PCR and RAPD analyses.NucleicAcids Res.1995 Jul 11；23(13)2569-70.)提取煙草基因組DNA。以100ng基因組DNA為模板進行PCR反應，擴增35s啟動子及潮霉素基因的一部分以確認轉(zhuǎn)基因植物。反應液含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM 5’引物和1μM 3’引物，以及1個單位的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。引物序列如下5’引物5’-cgtaagggatgacgcacaa-3’3’引物5’-ttggcgacctcgtattgg-3’
按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)以擴增35s啟動子及潮霉素基因的一部分DNA片段先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。將擴增產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果圖2所示，轉(zhuǎn)pNE103煙草在預計的846bp處有清晰的條帶，表明pNE103轉(zhuǎn)入到煙草中并且能在煙草中表達。圖2中，泳道1為未轉(zhuǎn)基因煙草的PCR產(chǎn)物，泳道2為pNE103轉(zhuǎn)基因煙草1的PCR產(chǎn)物，泳道3為pNE103轉(zhuǎn)基因煙草2的PCR，泳道M為1kb DNA marker取轉(zhuǎn)pNE103質(zhì)粒的煙草葉片在培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，一個半月后，將愈傷組織塊分成小塊，并在無潮霉素而加有1mg/ml的負篩選劑5氟胞嘧啶的培養(yǎng)基上篩選愈傷組織，愈傷組織塊的存活頻率為0.4％，將存活的愈傷組織取一部分再放回30mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)愈傷組織死亡，說明在這些愈傷組織里已發(fā)生了重組，丟失了codA和潮霉素基因。
實施例2、轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA高羊茅愈傷的去選擇標記實驗一、去選擇標記載體pNE101::Pubi-gusA的構建以常規(guī)方法構建去選擇標記載體pNE101::Pubi-gusA。
用PCR方法擴增水稻rubisco小亞基基因的3’末端序列。以水稻基因組DNA為模板，引物為TrbcS-S5’-AGCATGCTGGCAACTAAGCCGTCATC-3’，TrbcS-A5’-TATCATCTGCCAACCTTTCTG-3’，進行PCR擴增。PCR反應體系共25ul，含有100ng基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM TrbcS-S和1μM TrbcS-A，1U的Pfu聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，54℃ 1分鐘，72℃ 1分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。擴增得到732bp的DNA片段，將擴增得到的DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用pGEM-Teasy vector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按該系統(tǒng)提供的方案克隆該片段，測序(三博遠志生物技術公司)，經(jīng)測序表明，擴增片段具有序列表中序列1的序列，為水稻rubisco小亞基基因的3’末端序列(如序列表1所示)。將該片段插入pBluescriptIIKS(-)(STRATAGENE公司)的EcoRV位點，得到質(zhì)粒為pBS::TrbcS。
將實施例1的質(zhì)粒pUC19::Pactin-codA-35SpolyA用KpnI/SbfI酶切下含Pactin-codA-35SpolyA表達結(jié)構的片段插入pBS::TrbcS的KpnI/NsiI位點，得到質(zhì)粒pBS::TrbcS-Pactin-codA-35SpolyA。
將實施例1的pBS::35SpolyA2用SalI酶切下含35S3’末端的序列片段插入pBS::TrbcS的XhoI位點，得到質(zhì)粒pBS::35SpolyA-TrbcS。
將實施例1的pBS::TBL用PstI/SacII酶切含T左邊界序列插入pBS::35SpolyA-TrbcS的NsiI/SacII位點，得到質(zhì)粒pBS::35SpolyA-TrbcS-TBL。
將質(zhì)粒pBS::35SpolyA-TrbcS-TBL中的含35SpolyA-TrbcS-TBL片段用SacII/XhoI切下插入pCAMBIA1300的相同位點得到質(zhì)粒pNE。將pCAMBIA1300上的潮霉素基因用XhoI切下插入pNE的相同位點處，得到質(zhì)粒pNE10。
將質(zhì)粒pBS::TrbcS-Pactin-codA-35SpolyA用SphI酶切下含TrbcS-Pactin-codA-35SpolyA的片段插入質(zhì)粒pNE10的BstXI位點，得到質(zhì)粒pNE101。
從質(zhì)粒pBI121(AF485783)上用SmaI/EcoRI切下gus基因并用Klenow酶補平后插入pNE101的SmaI位點，得到質(zhì)粒pNE101::gusA。
提取玉米基因組DNA，用PCR方法擴增ubiquitin啟動子。PCR反應體系共25ul含有100ng玉米基因組DNA、1.5mM MgCl2、20mM Tris-HCl(pH8.4)、50mM KCl、0.8mM dNTP混合物、1μM Ubi-S和1μM Ubi-A，1U的Taq聚合酶(上海申友生物技術公司)。按照下列方案在PCR-熱循環(huán)儀(Eppendorf公司，德國)中進行PCR循環(huán)先94℃ 5分鐘；再94℃ 1分鐘，50℃ 1分鐘，72℃ 2分，共30個循環(huán)；最后72℃ 10分鐘。Ubi-S5’-CTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGG-3’，Ubi-A5’-CTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCG-3’。將擴增得到的1998bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(北京天緯時代科技有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用pGEM-Teasyvector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按該系統(tǒng)提供的方案克隆該片段，測序(三博遠志生物技術公司)，并用Pst I酶切插入pNE101::gusA的SbfI位點，得到質(zhì)粒pNE101::Pubi-gusA。(圖3)。
在pNE101::Pubi-gusA中，負篩選標記基因胞嘧啶脫氨酶基因受actin啟動子的調(diào)控并與正篩選標記基因潮霉素基因相連，在這兩個表達結(jié)構的外測兩端是兩段同向重復的水稻rubisco基因的3′末端片段，長為732bp。在兩段重復序列的外測玉米ubiquitin啟動子調(diào)控gus基因的表達。
二、轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA高羊茅愈傷的去選擇標記實驗將pNE101::Pubi-gusA轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，得到農(nóng)桿菌菌株TpNE101::Pubi-gusA。選取成熟飽滿的高羊茅草(Festuca arundinacea Schreb.)種子，滅菌消毒。在無菌條件下，將胚從消毒好的種子上完整的剝下，再橫切成兩半后接入愈傷組織誘導培養(yǎng)基。每升愈傷組織誘導培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)3-8mg，水解酪蛋白濃度在0.5-2g，pH5.8。每兩至三星期將愈傷組織轉(zhuǎn)皿一次。侵染前將愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天。每升愈傷組織狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎上加入生長素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-2mg，細胞分裂素類物質(zhì)6-芐氨基嘌呤0.1-0.5mg，KT濃度0-0.5mg，水解酪蛋白濃度在0.5-2g，pH5.8。將狀態(tài)調(diào)整培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織置于根癌農(nóng)桿菌TpNE101::Pubi-gusA菌液中侵染10分鐘，倒去菌液，在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3天后，用抗性愈傷組織誘導篩選培養(yǎng)基對愈傷組織進行篩選。2-3周，可見呈新鮮淺黃白色的抗性愈傷組織生長出來，葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測試驗結(jié)果如圖4所示，轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA的愈傷組織葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測結(jié)果為藍色，而未轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA的愈傷組織仍然呈現(xiàn)淺黃白色，表明gus基因已插入轉(zhuǎn)pNE101::Pubi-gusA的愈傷組織，并且在抗性愈傷組織的基因組DNA并穩(wěn)定表達。
每升抗性愈傷組織誘導篩選培養(yǎng)基的組成如下在MS基本培養(yǎng)基的基礎上加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-8mg，細胞分裂素類物質(zhì)6-芐氨基嘌呤0-0.5mg，KT濃度0-0.5mg，水解酪蛋白濃度在0.5-2g，潮霉素50-100mg，羧芐青霉素250mg，pH5.8。
將上述抗性愈傷組織置于無任何篩選劑的愈傷誘導培養(yǎng)基上任其生長，2-3個月后，將愈傷組織置于含2mg/ml負篩選劑5氟胞嘧啶的培養(yǎng)基上篩選，愈傷組織塊的存活頻率為0.1％，將存活的愈傷組織取一部分進行葡糖醛酸糖苷酶活性定性檢測結(jié)果為藍色，另取一部分放回含50-100mg/l潮霉素的培養(yǎng)基上，愈傷組織死亡。說明這些愈傷組織塊的基因組里有GUS基因，發(fā)生同源重組丟失了codA和潮霉素基因。
序列表<160>2<210>1<211>732<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1tggcaactaa gccgtcatcg tcatatatag ccttgtttaa ttgttcatct ctgattcgat 60gatgtctccc accttgtttc gtgtgttccc agtttgttca tcgtcttttg attttaccgg 120ccgtgctctg cttttgtttt tgtttcacct gatctctctc tgacttgatg taagagtggt 180atctgctacg actatatgtt gttgggtgag gcatatgtga atgaaatata tggaagctcc 240ggctatatat atttatacaa agggtacgag atggatgtga atcctagagc atatgtgtcc 300aacaatcaat tcgtcgacaa tgaaaatttg atcatggaat taaaaaatca tgcttctgtt 360gttcatcgga aatgcctttc tatactgatt agtggatttc caaactgaat tcacaagaaa 420acatatataa ttgttgtgtt catcaatcta cttcttttga tcaaataaaa gataatttga 480cttggcaaaa aacaaaaaat acagtttttc aggtatggag ggagtacttt ttttttttca 540agattgtcac atgcaaatag gcaataatac actcttttta taacttgtaa gtgttttttt 600accttttttt tgctacatat taaataccaa aacagtgtat cgaaaagcaa atctgtacga 660cgaccaaatg gctaagtggt gtaattgtgt gtcagtccag tccaagtcca acagaaaggt 720tggcagatga ta 732<210>2<211>1535<212>DNA<213>稻屬水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>2tggtggtcag taatcagcca gtttggtgga gctgccgatg tgcctggtcg tcccgagcct 60ctgttcgtca agtatttgtg gtgctgatgt ctacttgtgt ctggtttaat ggaccatcga 120gtccgtatga tatgttagtt ttatgaaaca gtttcctgtg ggacagcagt atgctttatg 180
aataagttgg atttgaacct aaatatgtgc tcaatttgct catttgcatc tcattcctgt 240tgatgtttta tctgagttgc aagtttgaaa atgctgcata ttcttattaa atcgtcattt 300acttttatct taatgagctt tgcaatggcc tatgggatat aaaagattat tctggaggga 360agtgatgctg gaaggactat gctgtcctga tttatatttg gagccactat gagcatttgg 420gctttctttt cagaacgctg taggcgtgtg ttgaaatctt tgcgacattc aatttgatat 480atgattcgag gtaattgggc tttaatttgt catctcatgt aacatctttt tgtttcttcg 540ctgcttgatt tctctatttc gtagcattgg aagataatag tagaatgatg atatactcca 600atacttgcaa tttcaaaacc gttagaaaga aaggaaaatc acggctaggg gaaaaattct 660ctctgatgcg tgcatcacca aaatctgatt gattgacata agcattggaa cacaaataga 720agatggagag gtggacatgt ttccgagaca tagcatttga gctcacattg tttttgatcc 780gtggctgtgc catacgcgat aatttactaa actttccctt gccccttggt aatataaagc 840ttataatgta tacaccgaaa ttgaaaaacg tattagttca ctcttcttcc tttttctcag 900caaagcgtgt tcatcaattt tattccacat gaatgtgatt gcgaattgtg accaggaatg 960atttaacaat cccgatcaac cctgttgtcg gtggtggcac taaaaattac caaacagcaa1020cctatcaagc aatgacaaat actttccaat ccaaaaaatg atccaagcca aaagtctgac1080aaaagggagg aggaagcttc agagctttgg aaccttgcct aagcaaggca atggcaggaa1140agaggaggaa aggatcaagt tcttttcttg ctctttcttc cacccacgat gtaccaatcg1200atcacccatc aattcatcat caagattgca aaagttaaac atgattcgaa aaagactaaa1260agaagctaga tataaagcag agaaattaaa gcgaaagaaa tagatagagg aatcaagtga1320cactgtcaca cgcttctccc ggttccattt tgcgtgcgtg catgtggagg catatttttc1380actgttcctt tcaaaatcat tggcgaatcc aagttaaatt accctgcttt ttatactgca1440tttttctctc aaaaaataga tttcgaacta agtttgaagt aatctcactc tctgaagaaa1500tgtctgttaa gtaagctcag gactataaat actag 153權利要求
1.一種去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體，含有正篩選標記基因，其特征在于所述選擇標記基因的兩側(cè)分別連接有一段相同的同向重復序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的載體，其特征在于所述同向重復序列來源于植物，動物，微生物或人工合成，其長度至少為300bp。
3.根據(jù)權利要求1所述的載體，其特征在于所述正篩選標記基因為抗性標記基因或代謝標記基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的載體，其特征在于在所述兩段相同的同向重復序列之間連接有負篩選標記基因；所述負篩選標記基因為胞嘧啶脫氨酶基因或氨基水解酶基因或乙醇脫氫酶基因。
5.根據(jù)權利要求4所述的載體，其特征在于所述重復序列具有序列表中序列1或序列2的核苷酸序列。
6.根據(jù)權利要求5所述的載體，其特征在于所述去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體為如圖1所示的pNE103或如圖3所示的pNE101∷Pubi-gusA。
7.一種去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的方法，是將權利要求1至5中任一所述的去除轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記的載體轉(zhuǎn)化目的植物，篩選獲得轉(zhuǎn)基因植物，再用所述正篩選標記基因?qū)暮Y選標記篩選，不能生長的植物為去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括下述驗證步驟將得到的去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物再在負篩選標記基因?qū)倪x擇標記中篩選，能生長的植物為去除選擇標記的轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物包括高羊茅草、草坪草、小麥、大麥、燕麥、水稻或玉米；所述雙子葉植物包括煙草、馬鈴薯、棉花、萵苣、番茄、甜瓜、黃瓜、豌豆、油料種子、甜菜或向日葵。
10.導入權利要求1-6中任一權利要求所述載體得到的細胞系、宿主菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記的方法及其專用載體。本發(fā)明去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記的載體含有選擇標記基因，其中該選擇標記基因的兩側(cè)分別連接有一段相同的同向重復序列。本發(fā)明利用同源重組的原理去除轉(zhuǎn)基因植物選擇標記，不僅周期短，而且能在樹木等無法進行有性繁殖的植物中應用。
文檔編號C12N15/64GK1793376SQ20051011509
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月28日 優(yōu)先權日2005年11月28日
發(fā)明者陳蕾, 徐建勇 申請人:北京北方杰士生物科技有限責任公司