專利名稱：具有特定單核苷酸多態(tài)性的cdh1基因及檢測其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因及檢測其的方法。
背景技術(shù)：
CDH1是編碼上皮細(xì)胞粘附分子的基因，在家族性胃癌患者中常常能夠檢出其編碼區(qū)的各種胚系突變(germline mutations)，是腫瘤抑制基因[1-3]。在少數(shù)散發(fā)性的惡性腫瘤組織(例如彌漫型胃癌和小葉型乳腺癌組織)中還能檢出體細(xì)胞突變(somatic mutations)[3-7]，在多數(shù)散發(fā)性的腫瘤組織中，該基因則經(jīng)常表達(dá)下調(diào)，甚至完全不表達(dá)。這種表達(dá)下調(diào)與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤能力增強(qiáng)有關(guān)，故又稱之為侵襲抑制基因[7-10]。研究表明，CDH1基因CpG島甲基化、SNAIL等轉(zhuǎn)錄抑制因子過表達(dá)是該基因在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的主要原因[11-13]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，CDH1基因啟動子區(qū)的某些單核苷酸多態(tài)性(例如-160A/C和-374A/AG)可能影響該基因的轉(zhuǎn)錄活性，繼而可能影響不同基因型攜帶者的腫瘤易感性[14-16]。CDH1基因啟動子E-box和CCAAT-box是該基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性調(diào)控元件，SNAIL等轉(zhuǎn)錄抑制因子通過與E-box結(jié)合而抑制其轉(zhuǎn)錄[15-18]，雌激素則可通過ER-MTA3-SNAIL途徑上調(diào)CDH1基因的表達(dá)水平[19]。
已經(jīng)公布的人類基因組序列數(shù)據(jù)顯示，該基因啟動子-73位為A(腺嘌呤核苷酸殘基)，目前尚無其附近區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因，該基因的核苷酸序列與在GenBank中登記號為D49685的CDH1基因相比，-73位點的A變異為C。
所述啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因是男性胃癌易感基因。
本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，該方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與測定該位點核苷酸的技術(shù)，諸如測序法或變性高效液相色譜(DHPLC)相結(jié)合。
本發(fā)明提供了一種體外預(yù)測待測男性個體胃癌易感性的方法，該方法包括體外檢測個體樣品中CDH1基因-73位點A/C多態(tài)性，其中該位點為特定單核苷酸C。
本發(fā)明提供了一種體外預(yù)測待測男性個體胃癌易感性的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與測定該位點核苷酸的技術(shù)，諸如測序法或變性高效液相色譜(DHPLC)相結(jié)合檢測CDH1基因-73A/C多態(tài)性位點，其中該位點為特定單核苷酸C。
我們新發(fā)現(xiàn)的核苷酸多態(tài)性位點(-73A/C)位于CDH1基因啟動子E-box和CCAAT-box 2個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間(SEQ ID NO1)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶-73CC基因型CDH1的男性個體患腫瘤的風(fēng)險明顯提高(OR(odd ratio)＝6.17)。功能研究發(fā)現(xiàn)，攜帶-73C位點的啟動子轉(zhuǎn)錄活性與攜帶-73A位點者存在顯著差別。
1.在CDH1基因啟動子E-box和CCAAT-box 2個關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件之間首次發(fā)現(xiàn)了單核苷酸多態(tài)性位點-73A/C(轉(zhuǎn)錄起始點為+1)；2.這種單核苷酸多態(tài)性影響CDH1基因啟動子活性；3.攜帶-73CC基因型的個體患腫瘤及其相關(guān)疾病的的風(fēng)險比攜帶非73CC基因型者明顯升高，可用于檢測腫瘤易感個體。


圖1是CDH1基因啟動子的核苷酸序列、結(jié)合位點及-73多態(tài)性位點的示意圖。
圖2是-73CC、AA、CA基因型的CDH1基因啟動子PCR產(chǎn)物的DHPLC和測序圖譜。
為了更清楚地理解本發(fā)明，下面參考附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，實施例中未注明的實驗條件和實驗方法為本領(lǐng)域熟知的常規(guī)條件和常規(guī)方法。例如參見Sambrook等人，《分子克隆實驗手冊》(New YorkCold Spring Harbor LaboratortyPress，1989)中所述的條件和方法，或者按照制造商所建議的條件。
具體實施例方式
參考圖1，本發(fā)明通過大量實驗研究，提供了一種啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因。本發(fā)明的基因與Gen Bank中登記號為D49685的CDH1基因相比，為啟動子區(qū)具有特定的單核苷酸多態(tài)性，具體地，為-73位點的A變異為C。所述序列編號是該CDH1基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游第73個核苷酸，即定義轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸編號為+1，其上游方向的核苷酸(3’-5’)依次定義為-1，-2，-3……。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，所謂“單核苷酸多態(tài)性”指基因組序列中單個核苷酸發(fā)生改變。發(fā)生改變的核苷酸所在的位點就是單核苷酸多態(tài)性位點。
所述的“易感性”指易于罹患某種(某類)疾病的傾向。所述的“易感基因”指決定個體易于罹患某種(某類)疾病的基因。胃癌易感基因指決定個體易于患胃癌的基因。
本發(fā)明研究的主要過程如下1.提取待測個體的基因組DNA；2.PCR擴(kuò)增含CDH1啟動子-73位點的核苷酸片段；3.確定該-73位點的核苷酸；4.開展胃癌患者和非癌患者病例對照研究；5.構(gòu)建攜帶-73C或-73A位點的CDH1啟動子報告基因，比較2種啟動子的活性；實施例1.用酚氯仿法抽提待測樣品(組織、體液、血液等)基因組DNA；2.根據(jù)人類基因組數(shù)據(jù)庫公布的CDH1啟動子序列(GenBank登記號D49685)，設(shè)計PCR擴(kuò)增用正向和反向引物(參考圖1)正向引物5’-tagagggtcaccgcgtctatg-3’；反向引物5’-actgagagggggtgcgtggct-3’3.PCR擴(kuò)增目的序列吸取25ng基因組DNA，用DNA聚合酶擴(kuò)增長度為174bp的目的序列；4.用變性高效液相色譜儀法(DHPLC)在67.6℃條件下分析，初篩出含-73AA或-73CC純合子的樣品(圖2)；5.將上述初篩出的樣品PCR產(chǎn)物與參照樣品PCR產(chǎn)物(經(jīng)測序確證含-73AA位點)混合、變性、退火，進(jìn)行DHPLC二輪分析，篩選出含-73CC純合子的樣品(21)；6.對所篩選出的含-73AA、AC、CC位點的部分樣品進(jìn)行PCR，產(chǎn)物直接測序驗證(圖2)；
7.病例-對照研究272例男性胃癌患者和400例男性非癌對照者中-73CC基因型的檢出率分別為6.62％(18/272)和1.50％(6/400)，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(p＜0.0004；OR＝4.65，95％CI 1.71～13.29)；而108例女性胃癌患者和222例女性非癌對照者中-73CC基因型的檢出率無差別，分別為3.7％(4/104)和3.6％(8/222)。該結(jié)果說明-73CC基因型為男性胃癌的易感位點；8.雙熒光報告基因比較2種啟動子的活性研究將攜帶-73C位點和-73A位點的CDH1啟動子片段(-108～+31)分別克隆到pGL3-Basic報告基因載體(Promega)中，分別瞬時轉(zhuǎn)染到有CDH1表達(dá)和沒有CDH1表達(dá)的細(xì)胞(如MCF7和HeLa細(xì)胞系)中，測定報告基因的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)在有CDH1表達(dá)的MCF7細(xì)胞中，含-73C位點的啟動子活性高于含-73A位點啟動子(6倍)；在無CDH1表達(dá)的HeLa細(xì)胞中，含-73C位點的啟動子活性則低于含-73A位點啟動子(1倍)。該結(jié)果說明-73CC基因型的啟動子可能對CDH1轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用極其敏感。
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權(quán)利要求
1.一種啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因，該基因的核苷酸序列與在GenBank中登記號為D49685的CDH1基因相比，-73位點的A變異為特定單核苷酸C。
2.如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因，該基因為男性胃癌易感基因。
3.一種檢測如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，該方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與測定該位點核苷酸的技術(shù)相結(jié)合。
4.如權(quán)利要求3所述的檢測如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，所述的測定該位點核苷酸的技術(shù)為測序法或變性高效液相色譜。
5.一種體外檢測待測樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，該方法包括(1)提取待測樣品的DNA，針對CDH1基因-73A/C多態(tài)性位點設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(2)對所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析；(3)鑒定CDH1基因-73位點是否為特定單核苷酸C。
6.如權(quán)利要求5所述的體外檢測待測樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，其中對所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析是采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與測定該位點核苷酸的技術(shù)相結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述的體外檢測待測樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，所述的測定該位點核苷酸的技術(shù)為測序法或變性高效液相色譜。
8.如權(quán)利要求5，6或7所述的體外檢測待測樣品中是否存在如權(quán)利要求1所述的啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因的方法，其中所述待測樣品是組織、血液或體液。
9.一種體外預(yù)測待測男性個體胃癌易感性的方法，該方法包括體外檢測男性個體樣品中CDH1基因-73A/C多態(tài)性位點，其中該位點的特定單核苷酸為C。
10.如權(quán)利要求9所述的一種體外預(yù)測待測男性個體胃癌易感性的方法，其中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和測序法或變性高效液相色譜相結(jié)合檢測CDH1基因-73A/C多態(tài)性位點，其中該位點為特定單核苷酸C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種啟動子區(qū)域具有特定單核苷酸多態(tài)性的CDH1基因，該基因的核苷酸序列與在GenBank中登記號為D49685的CDH1基因相比，－73位點的A變異為C。
文檔編號C12Q1/68GK1955309SQ20051011451
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月24日
發(fā)明者鄧大君, 張寶珍 申請人:北京市腫瘤防治研究所