專利名稱：轉(zhuǎn)基因植物種子在上游和下游加工中的可跟蹤性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，并具體涉及通過靶向培育用于轉(zhuǎn)化所需的栽培種，改進(jìn)在收獲之前和收獲之后對轉(zhuǎn)基因種子的遏制和跟蹤的方法無論是。
背景發(fā)育中的農(nóng)作物種子中，固有的積累蛋白質(zhì)的能力意味著許多農(nóng)作物植株，特別是單子葉植物，具有成為大規(guī)模生產(chǎn)異源性重組蛋白的實(shí)用且有效的載體的能力，所述重組蛋白如用于制藥工業(yè)的高價值的多肽；制造過程經(jīng)常稱作分子農(nóng)業(yè)。另外，由于這些種子可以常年儲存而不影響異源性多肽的質(zhì)量，因此在種子中儲存異源性多肽降低了下游加工的成本。這種蛋白的表達(dá)優(yōu)選在種子特異性或胚乳特異性啟動子的控制下。
雖然生物技術(shù)工業(yè)繼續(xù)循其在食物和/或飼料作物，如谷物中生產(chǎn)藥用和工業(yè)用蛋白的途徑，但是對于源于轉(zhuǎn)基因植物的種子可能在收獲、儲存或下游加工期間，通過與非轉(zhuǎn)基因種子混合意外地進(jìn)入人類的食物供應(yīng)卻受到越來越多的關(guān)注。例如，尤其是轉(zhuǎn)基因谷物生產(chǎn)的用于分子農(nóng)業(yè)的種子以簡單的目測與非轉(zhuǎn)基因種子不能區(qū)分開來。因此，為了保障食物供應(yīng)和環(huán)境的安全，分子農(nóng)業(yè)迫切需要將在地里或收獲和下游加工中的轉(zhuǎn)基因種子與非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)分開來的簡單技術(shù)。此外，還有一個迫切需要是不用在流線型的表達(dá)框中加入另外的基因即可實(shí)現(xiàn)這種目測跟蹤，所述流線型表達(dá)框可以用于分子農(nóng)業(yè)高水平表達(dá)尤其高價值的異源蛋白。這樣的技術(shù)將是獲得改進(jìn)的對作為制藥工業(yè)的原材料的轉(zhuǎn)基因種子材料的遏制的嚴(yán)格指導(dǎo)原則的重要因素。當(dāng)Good Agriculture Practice(GAP)的一般原則作為制藥和工業(yè)用酶的所有分子農(nóng)業(yè)的先決條件提出時，這就更為重要了。
通過簡單的目測，對不能與非轉(zhuǎn)基因材料區(qū)別開的轉(zhuǎn)基因材料，如種子進(jìn)行跟蹤，是非常困難的，并且既耗時又要基于繁瑣的提取方案和相對價昂的診斷技術(shù)，如定量PCR和實(shí)時PCR或ELISA。
如可篩選標(biāo)記的遺傳標(biāo)記可用在表達(dá)載體中，來篩查用于有效轉(zhuǎn)化的宿主生物體，所述標(biāo)記包括R-座基因，其在植物組織中編碼一種調(diào)節(jié)花青素(紅色)生成的產(chǎn)物(Dellapotra等，1988)，能實(shí)現(xiàn)生物熒光檢測的熒光素酶(lux)基因，或綠色熒光蛋白(GFP)基因。雖然它們可用于在基因轉(zhuǎn)移后的組織培養(yǎng)中，但是在GM農(nóng)作物的生物農(nóng)業(yè)中，它們無一適用于大規(guī)模標(biāo)記和追蹤，原因是例如原位應(yīng)用中的困難，或是由于需要天然生化前體途徑去激活可能在所靶植物中缺失的標(biāo)記。
還應(yīng)該注意的是植物生物技術(shù)中所采用的傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)常常產(chǎn)生源自一個以上細(xì)胞的“嵌合”或“鑲嵌”雜交株，并可以產(chǎn)生表達(dá)在植物中引入的靶異源基因但是不表達(dá)可篩選的標(biāo)記的植物。在轉(zhuǎn)化中表達(dá)由表達(dá)載體引入的可篩選標(biāo)記經(jīng)常會在個世代間消失，因此所述標(biāo)記對于目測是不可靠的特征。
隨著對與遺傳修飾農(nóng)作物和生物農(nóng)業(yè)有關(guān)的一般安全性顧慮的提高，迫切需要安全有效的方法，用于生產(chǎn)遺傳修飾的植物，所述植物被安全地牽制并且與非修飾的野生或種植的植物可靠地區(qū)分開來。
發(fā)明概述和目的基于著色種子的簡單目測或機(jī)械觀測的追蹤技術(shù)是分子農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)的直接優(yōu)點(diǎn)。同樣也非常希望存在簡單的技術(shù)方法，所述方法可以有助于獲得分子農(nóng)業(yè)中對于基因遏制所繼續(xù)的安全措施。
本發(fā)明的主要目標(biāo)概括為提供改進(jìn)分子農(nóng)業(yè)中種子材料的生物遏制性和可追蹤性水平的方法。在以上的優(yōu)選實(shí)施方式中，主要的方法是將可目測的可遺傳特性，如種皮或種子其它部分的特征性顏色引入適于分子農(nóng)業(yè)的適宜的植物宿主，并將此新型栽培種用作載體或宿主植物來產(chǎn)生表達(dá)靶異源蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其種子在田里或收獲期間或收獲后可被追蹤并且可與同樣栽培種、沒有目測特征，例如種子的特征性顏色的非轉(zhuǎn)基因種子輕易地區(qū)分開來。
通常，根據(jù)本發(fā)明所使用和產(chǎn)生的植物和植物栽培種選自雙子葉植物和單子葉植物，并且在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述植物來自油菜籽、大豆、大麥、玉米、小麥、燕麥和水稻。本發(fā)明尤其適用于產(chǎn)生和使用轉(zhuǎn)基因植物如谷物，所述谷物在植物種子中用于表達(dá)和累積異源蛋白。在這樣的實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)理解不僅是本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物從非轉(zhuǎn)基因植物中輕易地識別出來，而且轉(zhuǎn)基因植物的種子，在與植物的莖、葉等分離時，能輕易地從非轉(zhuǎn)基因種子中識別出來，正如

圖1和具體實(shí)施方式
的描述。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，大麥，特別是Hordeum vulgaris大麥，特別適用于作為在具有可目測標(biāo)記的種子的轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生靶異源蛋白的植物宿主，因?yàn)閷?shí)際上不存在意外的交叉授粉的問題。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了稀有的大麥栽培種，其本身并不適于基因操作，但具有非常顯著的可目測特點(diǎn)，使所述栽培種的植株及其產(chǎn)生的種子能與普通農(nóng)業(yè)或野生的栽培種很容易地區(qū)分開來。
更具體地，本發(fā)明的目標(biāo)是應(yīng)用回交育種來為分子農(nóng)業(yè)產(chǎn)生具有可目測特征的新型、合適的宿主植物/栽培種，所述可目測特征例如為具有著色的種皮，或能通過簡單的目測很容易地進(jìn)行追蹤的種子，并從而使提高遏制水平成為可能。
本發(fā)明的另一個目的是由實(shí)施方案說明的，在所述實(shí)施方案中，被選作適用于分子農(nóng)業(yè)的大麥宿主植株用具有使種皮或種子著色的基因座的供體大麥植株的花粉授粉，并通過反復(fù)回交來產(chǎn)生除了具有來自供體植物的可目測特征以外具有適用于分子農(nóng)業(yè)的原始栽培種所有必要特征的宿主植物，所述原始栽培種的必要特征包括易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化，所述供體的可目測特征為諸如特別是易于被目測識別或自動檢測設(shè)備識別的著色的種子或種皮。
尤其是，本發(fā)明的目的是提供產(chǎn)生適合分子農(nóng)業(yè)的新型等基因大麥宿主植物的方法，所述所述植物易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化，具有能夠在田里、收獲期間或收獲后被輕易識別和目測追蹤的黑色種子。這樣的等基因宿主植物將在異源蛋白的生產(chǎn)中提供可復(fù)制性和安全性，因?yàn)樗械膫€體植株都具有相同的二倍體基因結(jié)構(gòu)，種子的顏色基本沒有差異。
在前述的優(yōu)選實(shí)施方式中，產(chǎn)生宿主植株，例如，特別是適用于分子農(nóng)業(yè)、具有黑色種子、并易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的等基因大麥宿主植株的方法，包括(1)從易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的栽培種中選擇第一大麥植株；(2)從具有著色種皮、并且通常不用于商業(yè)農(nóng)業(yè)的栽培種中選擇第二大麥植株；(3)將第二植株與所述第一植株雜交，即，用具有著色種皮(如黑色、深灰或深藍(lán)或紅色)的植株的花粉為第一植株授粉，產(chǎn)生雜交F1植株；(4)用易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的栽培種回交雜交的F1植株；(5)重復(fù)回交一至數(shù)次，取決于回交次數(shù)，產(chǎn)生具有與所述第二植株的著色種皮，并保留易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的所述第一植株的大體的基因結(jié)構(gòu)所雜交品系；(6)采用花藥/小孢子培養(yǎng)方法來產(chǎn)生具有黑色種皮的等基因品系；(7)用含有表達(dá)盒的核酸構(gòu)建體多次轉(zhuǎn)化所述等基因系，并篩選最適合的等基因分子農(nóng)業(yè)品系，其具有著色的種子并適于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化。該方法的實(shí)施方式包括的如下的其他步驟用編碼植株活性啟動子的核酸構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化所述合適的等基因分子農(nóng)業(yè)品系來產(chǎn)生具有著色的種子的轉(zhuǎn)基因大麥，所述種子表達(dá)高水平表達(dá)的高價值異源蛋白。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于分子農(nóng)業(yè)的等基因大麥栽培種，作為新型大麥植株的實(shí)施方式，本申請中其稱作“Dimma”。
本發(fā)明成功解決了分子農(nóng)業(yè)、田里、收獲期間或收獲后對轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行充分追蹤的現(xiàn)有技術(shù)的不足。特別是，本發(fā)明提供了種子污染問題的簡單解決方案，所述問題指通過在收獲期間或儲存過程中，轉(zhuǎn)基因種子與非轉(zhuǎn)基因種子的混合，將來自轉(zhuǎn)基因植物的種子偶然進(jìn)入人類或動物食物供應(yīng)中。本發(fā)明提供了降低了所述種子污染的風(fēng)險的即經(jīng)濟(jì)又可靠的方法。
附圖簡述圖1大麥栽培種“Golden Promise”(a)、“Svarthovdi”(b)和等基因大麥雜交系“Dimma”(c)的完全發(fā)育的種子。
圖2顯示了“Dimma”和栽培種“Golden Promise”的種子混合物中“Dimma”種子的目測差異。
圖3顯示了本發(fā)明用于“Dimma”轉(zhuǎn)化和選擇的表達(dá)盒pbGF20lif的示意圖。
縮寫Dhor，胚乳特異性D-大麥醇溶蛋白啟動子；pb，信號肽；lif，白血病抑制因子cDNA序列；p，接頭；CBM，碳水化合物結(jié)合組件cDNA；pin II，馬鈴薯蛋白酶抑制劑II基因終止信號；35S，花椰菜花葉病毒35S啟動子；hph，E.coli的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Genebank登錄號#K01193)；nos，胭脂堿合成酶終止信號；R，右邊界；L，左邊界。
發(fā)明詳述后文將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
除了另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解和使用的含義相同。
用于本文的術(shù)語“分子農(nóng)業(yè)”，指應(yīng)用敞田或封閉設(shè)備中的任何種類的植物，生產(chǎn)有價值的生物化合物如蛋白質(zhì)從而用于進(jìn)一步處理的過程。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文中與“多肽”和“肽”可互換使用。
術(shù)語“種子污染”指，用于分子農(nóng)業(yè)的植物，如谷物的種子與用于食物或食品生產(chǎn)的植物種子意外混合的情況。術(shù)語“遏制”或“轉(zhuǎn)基因種子的遏制”是指，不管是在田里、收獲期間還是收獲后，轉(zhuǎn)基因植物栽培種的種子成功地與非轉(zhuǎn)基因種子保持隔離，并且不與非轉(zhuǎn)基因的種子混合。
術(shù)語“植物栽培種”指培植下發(fā)芽和持續(xù)生長的植物，其通過選擇性雜交產(chǎn)生或存在于從野生群落中，并且通過無性繁殖或純系種子得以保持。
用于本文的術(shù)語“所需的親本栽培種”或“所需的栽培種”是指所選擇的通過培育成為用于分子農(nóng)業(yè)的合適宿主栽培種改良的植物栽培種。術(shù)語“宿主栽培種”是指通常遺傳轉(zhuǎn)化用作分子農(nóng)業(yè)中生產(chǎn)重組蛋白的植物栽培種。
本文所用的術(shù)語“F1代”或“F1植株”或“F1雜交種”是指所需的栽培種和具有所需的特征如種子或種皮的特征性著色圖案的栽培種之間雜交產(chǎn)生的第一代。
術(shù)語“回交”指培育者反復(fù)將雜交后代(F1至F1+n，其中n為1或大于1)與初始所需的親本栽培種雜交的過程。非限制性實(shí)例是，大麥(Hordeum vulgaris cv.)“Golden Promise”(所需的母本栽培種)與大麥(Hordeum vulgaris cv.)‘Svarthovdi”(有所需特征的栽培種)之間的雜交后代與初始的所需母本“Golden Promise”反復(fù)回交。
本文所用的術(shù)語“等基因系”或“等基因大麥”指二倍體大麥栽培種或系，其為或多或少的等位基因的雙單倍體系或純合子。
術(shù)語“種子著色”指由植物細(xì)胞生成的色素化合物累積在種子或種皮中。術(shù)語“特征性著色”指種子或種皮的著色圖案，其能輕易地與商用或普通的栽培種可能具有的著色圖案區(qū)分開來。作為商用栽培種著色圖案的非限制性實(shí)例是在栽培種大麥(Hordeum vulgaris cv.)“Golden Promise”中所見的著色圖案(圖1a)。作為特征性著色圖案的非限制性實(shí)例是在大麥(Hordeum vulgaris cv.)“Svarthovdi”(圖1b)中所見的著色圖案。“種皮”或“外種皮”指種子的外和內(nèi)株被，包括色素層，或種子的保護(hù)性外層。本發(fā)明的非限制性實(shí)例為大麥栽培種‘Svarthovdi”種子中黑色黑色素樣色素的累積。
術(shù)語“機(jī)械化檢測設(shè)備”或“自動化檢測設(shè)備”是能區(qū)分著色種子和不著色種子的任何工具或儀器。術(shù)語“目測追蹤”指基于種皮或種子其它任何部分的著色或著色圖案，對其進(jìn)行追蹤和鑒別的任何方法。所述檢測設(shè)備可基于用于測定通過光源和檢測器之間的光束路的樣品種子的吸光率和/或反射率的分光光度技術(shù)。具有CCD或CMOS檢測器的機(jī)器視覺(Machine vision)照相機(jī)，與裝有合適的圖案識別軟件程序的計算機(jī)設(shè)備相連，也適于本發(fā)明對可目測標(biāo)記的種子的自動化檢測。
術(shù)語“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。
“啟動子”定義為一種或多種核酸控制序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子結(jié)合位點(diǎn)的排列，其能導(dǎo)可操作性連接的核酸的轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“基因轉(zhuǎn)化”指核酸分子轉(zhuǎn)移入宿主生物體的基因組，產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的遺傳特征。含有轉(zhuǎn)化的核酸片斷的宿主生物體被稱作“轉(zhuǎn)基因”生物體。本發(fā)明的“轉(zhuǎn)基因植物宿主細(xì)胞”含有穩(wěn)定整合到基因組中的至少一種外源，優(yōu)選兩種外源核酸分子。植物轉(zhuǎn)化方法的實(shí)例包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(De Blaere等，1987)和粒子轟擊或“基因槍”轉(zhuǎn)化技術(shù)(Klein等(1987)；美國專利4,945,050)。
術(shù)語“選擇標(biāo)記”或“選擇標(biāo)記基因”是指能給表達(dá)基因的細(xì)胞或生物體賦予獨(dú)特的表型特征的基因，其特征是細(xì)胞或生物體能更耐受特定化學(xué)劑如除草劑或抗生素等的毒性。
術(shù)語“篩選標(biāo)記”指細(xì)胞或生物體的表型特征，其能通過觀察或檢驗(yàn)通常是通過目測進(jìn)行檢測。
選擇適于分子農(nóng)業(yè)、易于進(jìn)行組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的所需植物栽培種之后，選擇具有能輕易地以目測與所需的栽培種的種子相區(qū)分的種子的另一栽培種。這些種子可以有不同的顏色或著色，如某些埃塞俄比亞當(dāng)?shù)卮篼溤耘喾N的黑色種子，或藍(lán)色、紅色或灰色，或彩色圖案，或具有能以目測輕易地與用于食品或飼料的栽培種的種子相區(qū)別的其它形態(tài)特征。優(yōu)選決定特征性特性的基因座，如某些埃塞俄比亞當(dāng)?shù)氐拇篼溤耘喾N的黑色種皮是顯性的、有很強(qiáng)表現(xiàn)率的高度可遺傳特征。文獻(xiàn)中記述了許多具有產(chǎn)生著色的種子的高度可遺傳特性的不同大麥栽培種。分子農(nóng)業(yè)所需的栽培種與具有所需的用于著色種子或種皮的特性的栽培種進(jìn)行人工雜交，雜交后代與所需的栽培種反復(fù)回交。數(shù)次回交后(如2、3、4或更多次)，檢驗(yàn)雜交種對組織培養(yǎng)以及遺傳轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性，并與最初所需的栽培種相比較。一旦認(rèn)為雜交系對組織培養(yǎng)或遺傳轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性已充分，并與所需的栽培種相當(dāng)，雜交系就被用于產(chǎn)生雙單倍體系或等基因系，例如優(yōu)選通過使用實(shí)施例2描述的和Kasha等(1992；2001)詳細(xì)描述的花藥-小孢子培育方法，從該雜交栽培種產(chǎn)生作為著色種子的所需特性的純合子的株系。然后該等基因雜交系可用作用于分子農(nóng)業(yè)的宿主栽培種。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，回交后得到的雜交系中獲得多個等基因植株；個體等基因系不同的等基因的基因組成表明了F3代有大量可能產(chǎn)生的雜交；播種所述等基因植物的種子并生長，隨后通過如在本文描述的表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化，并篩選有效轉(zhuǎn)化和表達(dá)來檢驗(yàn)其對轉(zhuǎn)化和組織培養(yǎng)的可行性；并且基于所述檢驗(yàn)，從所述的多個等基因植株中選擇一個等基因系，作為用于產(chǎn)生靶異源蛋白的可轉(zhuǎn)化植株。
可遺傳操作的單子葉和雙子葉植物在本發(fā)明中可以用作所需的栽培種。優(yōu)選單子葉植物，更優(yōu)選大麥，并且最優(yōu)選Hordeum vulgaris大麥。能遺傳轉(zhuǎn)化的植物可以向其中引入異源DNA序列，包括編碼區(qū)DNA序列，在其中表達(dá)、穩(wěn)定保持并傳遞到后代中的植物。已經(jīng)將遺傳操作和轉(zhuǎn)化方法用于生產(chǎn)大麥植株，所述植株應(yīng)用除草劑抗性包括，例如，雙丙氨膦或Basta，或者抗生素抗性，如潮霉素抗性作為選擇標(biāo)記。
優(yōu)選在本發(fā)明的DNA構(gòu)建體中利用的啟動子在可目測區(qū)分的植物部分(如種子組織中)具有很強(qiáng)的活性，在所述種子組織中需要積聚靶異源多肽。這樣的啟動子可以得自不同的植物遺傳材料或者植物病毒。優(yōu)選所選的特定啟動子適于在單子葉種子中表達(dá)異源蛋白，更優(yōu)選在大麥中，并最優(yōu)選在種子的胚乳組織中表達(dá)異源蛋白。
本發(fā)明的重組質(zhì)?？梢酝ㄟ^將靶DNA序列連接(插入)到適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒中獲得，所述質(zhì)粒可在細(xì)菌宿主中復(fù)制。如編碼靶異源蛋白的基因的DNA序列，或者為組織特異性種子表達(dá)而設(shè)計的啟動子序列應(yīng)當(dāng)可操作性整合到質(zhì)粒中，所述質(zhì)粒為了這個目的，如果需要的話，除了啟動子之外可以含有另外的增強(qiáng)子DNA序列、支架連接區(qū)、內(nèi)含子、poly(A)加尾信號、核糖體結(jié)合序列和靶選擇標(biāo)記基因如潮霉素耐受基因、氨芐青霉素耐受基因、雙丙氨膦耐受基因等。所選擇標(biāo)記優(yōu)選用在大麥的轉(zhuǎn)化中，因?yàn)檗D(zhuǎn)化率相對低下，因此需要能從非轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇陽性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
實(shí)施例下列實(shí)施例的提供是為了更好地限定本發(fā)明，并指導(dǎo)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除了另有說明，術(shù)語的理解參照相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的傳統(tǒng)用法。
方法大麥品系雜交和回交中的人工授粉Hordeum vulgaris或大麥?zhǔn)亲泽w受精的植物，意即一朵花的花粉通常給同一朵花的胚珠授粉。通過栽培，自體授粉將最終產(chǎn)生等基因或接近等基因的品系，意味著大多數(shù)或所有的等位基因都是純合子。為了在這樣的自體受精品種中引入新的特征或表型，人工授粉或雜交是必需對。大麥的人工授粉或雜交在溫室中進(jìn)行。開始，選擇兩個具有某些所需特型的栽培種，并將其種子種植在盆中。在數(shù)日內(nèi)重復(fù)播種，以確保選用于雜交的親本的發(fā)育階段可以相匹配。人工授粉分兩步驟進(jìn)行。第一步驟是當(dāng)宿主栽培種的花恰好發(fā)育完全，或者恰好在穗狀花序下的分蘗開始從葉鞘中出現(xiàn)后進(jìn)行。然后打開穗狀花序上的每一朵花或小穗狀花序，用鑷子除去花內(nèi)的三個雄蕊。然后用袋子包好每個處理過的花穗，防止花粉傳播到小穗狀花序并防止花朵干燥。第二步驟是實(shí)際上的人工授粉或雜交，在除去雄蕊后三至五天進(jìn)行，或當(dāng)心皮在宿主栽培種中發(fā)育完全并準(zhǔn)備授粉時進(jìn)行。選擇供體栽培種還沒有將其花粉播散到自己的心皮上并且發(fā)育完全的雄蕊，用于給除去雄蕊的宿主小穗狀花序授粉。人工授粉的成功率通常在50％和70％之間。
雙單倍體、等基因大麥雜交品系的產(chǎn)生該技術(shù)是基于Kasha等建立的方案(2001)。種子播種在75％的輕質(zhì)水蘚泥炭和25％浮石(中等粒徑)的混合物中，植株生長條件是，白天16℃(16小時)，夜間12℃(8小時)，白天在白色冷熒光250μmolm-2s-1的持續(xù)光照下，相對濕度70％，需要時用水根下灌溉(sub-irragated)。這些條件下，植株營養(yǎng)生長約55-95天，直至未成熟的穗狀花序在適當(dāng)?shù)碾A段可以收集。培養(yǎng)小孢子的理想階段是在單核階段的中間期至晚期。采集后，穗狀花序放置在粗濾布(cheese cloth)上，用80％EtOH噴灑，用粗濾布覆蓋，并干燥5分鐘。從鞘除去穗狀花序，放在無菌Petri培養(yǎng)皿中，每皿約10個穗狀花序。每皿加入15ml冰冷的0.3M甘露醇，然后用透明塑料膜密封，用鋁箔覆蓋，保存于4℃3-4天。然后切去預(yù)處理過的穗狀花序的根部，棄去，將穗狀花序切成1-2cm的小片，放入用冰冷的甘露醇變冷的攪拌杯中。組分在Waring攪拌機(jī)上低速混合5秒，漿狀物通過500μ+200μ的尼龍膜過濾。收集濾出液，用100μ的膜過濾并收集在50ml BD Falcon管中。旋轉(zhuǎn)試管5分鐘，仔細(xì)倒出液體，以0.3M甘露醇、與一個或兩個50ml管合用清洗，并旋轉(zhuǎn)5分鐘，液體從50ml管中倒出，顆粒物再懸浮于2ml的甘露醇中，用吸量管放入15ml Falcon管中大約(ca)12ml的20％麥芽糖內(nèi)。旋轉(zhuǎn)試管5分鐘，用吸量管從試管中部以上的層中收集存活的小孢子，再懸浮于甘露醇中，并旋轉(zhuǎn)5分鐘，小孢子花粉再懸浮于2ml FHG介質(zhì)中。然后懸浮的小孢子被吸量管輕柔地放在真空條件下、瓷漏斗中預(yù)先濕潤過的濾紙上。最上層的濾紙移至Petri培養(yǎng)皿中FHG固化培養(yǎng)基的中央，培養(yǎng)皿用塑料膜密封，在25℃的黑暗中孵育3-4周。7-10天后在培養(yǎng)皿中加入新鮮的液體FHG。當(dāng)其達(dá)到1-2mm大小時，胚芽狀組織被移入MS分化培養(yǎng)基，黑暗中孵育3天，然后移入22℃的8小時光照數(shù)周。小植株苗(3-4cm)移入盒中的MS再生長培養(yǎng)基，植株根系發(fā)育良好后馬上移植。
對大麥雜交品系組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化的適應(yīng)性的評價a)用于基因轉(zhuǎn)化的植物材料大麥(Hordeum vulgaris cv)Golden Promise的種子和不同的雜交系的種子，播種在75％的輕質(zhì)水蘚泥炭和25％浮石(中等粒徑)的混合物中，植株生長條件是，白天16℃(16小時)，夜間12℃(8小時)，白天在白色冷熒光250μmol m-2s-1的持續(xù)光照下，相對濕度70％，需要時用水根下灌溉(sub-irragated)。這些條件下，植株營養(yǎng)生長約55-95天，或直至未成熟的種子可以作為轉(zhuǎn)化的材料，即開花后約8-14天。種子在震搖器中，以3％次氯酸鈉消毒40分鐘，并用無菌水沖洗五次。
b)菌株以及植株轉(zhuǎn)化的準(zhǔn)備根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)，其帶有具vir區(qū)的Ti-質(zhì)粒的反式雙元載體，用于利用具有調(diào)節(jié)靶異源蛋白表達(dá)的DNA構(gòu)建體將T-DNA區(qū)導(dǎo)入大麥。大腸桿菌(E.coli)X-Blue和根癌農(nóng)桿菌兩個細(xì)菌的轉(zhuǎn)化通過電穿孔完成，描述于Maniatis等的Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1982)。為了準(zhǔn)備植株的轉(zhuǎn)化，在5ml Agro培養(yǎng)基(胰化蛋白胨5g/L，酵母提取物2.5g/L，甘露醇5g/L，谷氨酸1g/L，KH2PO4250mg/L，MgSOs-7H2O 100mg/L，生物素1μg/L，pH7.0，25μg/ml利福平，50μg/ml奇霉素)中接種農(nóng)桿菌培養(yǎng)菌的單個菌落，并在27℃下生長24-40小時。在無菌eppendorf管中，將200μl培養(yǎng)菌放入200μl的水合甘油中(預(yù)先滅菌)，儲存在-80℃以前，培養(yǎng)菌被充分渦旋，并留在工作臺上2小時。每次轉(zhuǎn)化，從-80℃冰箱中取出一個試管，融化，將200μl的農(nóng)桿菌原種加入5ml沒有抗生素的Agro培養(yǎng)基中。然后培養(yǎng)菌在用作接種植株材料前，在27℃下生長17-20小時(見下文)。
c)制備用于農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的大麥外植體在第一天大約采摘10個大麥穗，約在開花后8-14天，除去芒和種子，選擇1.5mm和2mm大小之間的胚芽。最初的植物材料要健康和成熟，不能過量吸水，種子應(yīng)為綠色，沒有真菌病的征象。種子置于50ml的falcon管中(不超過半滿)，用70％乙醇沖洗，然后倒掉乙醇。然后加入20％漂白溶液(White King)，混合20分鐘。在層流空氣凈化罩中倒掉漂白液，用無菌水沖洗種子(約洗5-8次)，放在4℃ O/N。第二天，種子放在顯微鏡平臺上的無菌Petri培養(yǎng)皿中。確定胚芽的位置，切除種子尾部并切下種子側(cè)面。然后用鑷子穩(wěn)定地夾起種子，在種子中間加壓，從而使胚芽突出。用鑷子將胚芽放好，用解剖刀片插入盾片和莖軸間的溝槽，慢慢切除莖軸。在Petri培養(yǎng)皿中心，除去莖軸的胚芽放在再生長培養(yǎng)基中，切側(cè)朝上，大約每皿25個胚芽。每次轉(zhuǎn)化用的胚芽總數(shù)為200。
d)雙元載體的處理雙元載體37℃下在含有100μg/ml奇霉素的大腸桿菌Xl-Blue LB培養(yǎng)培養(yǎng)基中增殖，然后用QIAGENPlasmid Midi Kit，從過夜生長的100ml培養(yǎng)菌中純化載體。把1μl(1μg)的載體放入帶有0.1cm間隙的無菌小瓶(BioRad)中，以電穿孔法把純化的雙元載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，用40μl電感受態(tài)細(xì)胞(electrocompetent cell)洗脫載體，設(shè)置電壓為2.5kV，電容為21μF，用于電穿孔。細(xì)胞涂布在含有100μg/ml奇霉素和20μg/ml利福平的YEP選擇皿上，28℃生長2天。進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌的質(zhì)粒限制性消化分析，以證實(shí)雙元載體的完整性。
e)大麥外植體的農(nóng)桿菌感染大約10μl的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液滴到每個胚芽上，保證所有的胚芽與溶液接觸。輕彈胚芽(切側(cè)朝下)，并拖動通過再生長培養(yǎng)基至培養(yǎng)皿外面，取出多余農(nóng)桿菌。然后將胚芽轉(zhuǎn)入新鮮的再生長培養(yǎng)基培養(yǎng)皿(切側(cè)朝上)，間距相等(每皿25個)，放在24℃的黑暗柜中。農(nóng)桿菌感染后在大麥組織中再生和器官形成。三天后，胚芽被移入帶有選擇標(biāo)記(如雙丙氨膦或潮霉素)的新鮮再生長培養(yǎng)基中，放置四至六周，每兩周進(jìn)行次培養(yǎng)。為了新芽再生，將愈傷組織轉(zhuǎn)入新芽-誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SIM)中，存活的愈傷組織和再生的新芽每兩周轉(zhuǎn)入新鮮SIM，直至形成小植株苗。然后植株苗轉(zhuǎn)入根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(RIM)，對存活的植株計數(shù)，然后盆栽于土壤中。一個月后，從每個植株中收集土壤中的葉外植體，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的PCR篩查，計算每100個接種農(nóng)桿菌的胚芽的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)。
轉(zhuǎn)基因品系的DNA提取和PCR分析用Clonetech的NucleoSpin Plant Kit，并根據(jù)制造商的說明書，對從大約200mg幼葉組織中提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在25μl反應(yīng)混合物中(50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.4)，1.5mM MgCl2，每種dNTP 200μM，大約0.25μM引物，2.5U Taq引物酶(Fermentas)和50ng-100ng的模版DNA，進(jìn)行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)首先在94℃下進(jìn)行3分鐘，然后以下列步驟進(jìn)行31次循環(huán)66℃ 30秒，72℃ 45秒，94℃ 30秒。擴(kuò)增反應(yīng)以72℃下的4分鐘延伸步驟終止。兩種hph特異性引物(hph129和hph130)用于擴(kuò)增。引物的序列如下hph129，5’-CGGGCGCCATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACG-3’(SEQ IDNO1)；hph130，5’-CGGGCGCCCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGC-3’(SEQ IDNO2)。
實(shí)施例1培育具有黑色種子的可轉(zhuǎn)化大麥雜交系通過組織培養(yǎng)適于植物轉(zhuǎn)化和植物再生的大麥(Hordeum vulgariscv)Golden Promise的種子，種植在盆中。數(shù)日內(nèi)反復(fù)播種，植株在自然光下于溫室中生長。同時，稱作“Svarthovdi”的大麥Hordeum vulgaris栽培品種，具有黑色種子，但通過組織培養(yǎng)不適應(yīng)植物轉(zhuǎn)化和植物再生，其種子在同樣條件下盆栽和生長。黑色種子是“Svarthovdi”的顯性特征，表型表現(xiàn)在種皮或種子的糊粉層。種子完全成熟時，至少有50％的種皮有黑色著色。當(dāng)Golden Promise栽培種的花恰好發(fā)育完全時，或者恰好在穗狀花序下的分蘗開始從葉鞘中出現(xiàn)后，打開穗狀花序上的十朵花或小穗，用鑷子除去花內(nèi)的三個雄蕊。然后用袋子包好每個處理過的花穗，防止花粉傳入小穗狀花序和花朵干燥。四天后，采集栽培種“Svarthovdi”發(fā)育完全的雄蕊，用于給除去雄蕊的GoldenPromise栽培種的十朵花的心皮授粉。授粉后繼續(xù)用袋子包好穗狀花序，不收獲種子，直至其完全發(fā)育。這些種子中的F1胚芽都為黑色等位基因的雜合子。遺傳背景是50％Golden Promise和50％有黑色著色種皮的“Svarthovdi”，因?yàn)楹谏任换蚴秋@性的。所有處理過的F1種子進(jìn)行盆播種，F(xiàn)1植株生長，直至小花穗可以與栽培種Golden Promise的花粉回交。與Golden Promise回交按上面所描述的進(jìn)行，盆播種F2種子，F(xiàn)2植株在溫室條件下生長，直至小穗狀花序可以反復(fù)與栽培種Golden Promise的花粉回交。計算F2植株的遺傳背景為75％cv GoldenPromise和25％cv“Svarthovdi”。F2植株在溫室條件下生長，直至小穗狀花序可以反復(fù)與栽培種Golden Promise的花粉按上面所述回交。F3植株的遺傳背景應(yīng)當(dāng)是87.5％cv Golden Promise和12.5％cv“Svarthovdi”。允許F3小穗狀花序自體授粉，產(chǎn)生完全成熟的F3種子。75％的F3種子有黑色表型，25％有傳統(tǒng)的黃色種子表型。采集黑色F3種子進(jìn)行盆播種，F(xiàn)3植株在溫室條件下生長，直至可以收獲小孢子用于孢子培養(yǎng)，以產(chǎn)生或?yàn)楹谏N子表型或?yàn)辄S色種子表型的雙單倍體等基因雜交系純合子，遺傳背景均為主要(計算為87.5％)來自于Golden Promise栽培種，其適應(yīng)植株轉(zhuǎn)化和植株再生。等基因雜交系生長至成熟，收集具有黑色種子表型的品系，用于檢驗(yàn)植株轉(zhuǎn)化和植株再生的適應(yīng)性。
實(shí)施例2用基因轉(zhuǎn)化通過組織培養(yǎng)選擇具有黑色種子并適應(yīng)植株轉(zhuǎn)化和植株再生的大麥雜交系50粒雜交的雙單倍體等基因系的不成熟種子，大約在開花后8-14天收集并保存在4℃黑暗中。冷孵育的不成熟種子在70％EtOH中處理1分鐘，然后在0.6％的次氯酸鈉中10分鐘，然后用無菌蒸餾水徹底清洗(5-8次)，無菌環(huán)境下在層流凈化罩中的解剖顯微鏡下放置在無菌Petri培養(yǎng)皿上。確定胚芽的位置，切去種子尾部，切斷種子側(cè)面。用鑷子壓迫種子，種子中部受壓因而胚芽被擠出。用鑷子放好胚芽，用解剖刀片插入盾片和莖軸間的溝槽，慢慢切除莖軸。盾片放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，切側(cè)朝上，用25μl至40μl全濃度帶有植株轉(zhuǎn)化載體pbGF20lif(SEQ ID NO3，見圖3及其前面的描述)的根癌農(nóng)桿菌接種1-5分鐘。接種后，拖動盾片至培養(yǎng)皿外側(cè)，以降低細(xì)菌負(fù)載和降低共培育期的過度生長。感染的盾片轉(zhuǎn)入新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿在24℃的黑暗中孵育3天。3天后盾片轉(zhuǎn)入新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，但所述培養(yǎng)基帶有100μg/ml的特泯菌(timentin)以殺滅農(nóng)桿菌和50μg/ml潮霉素以選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，在24C的黑暗中孵育4周，2周后次培養(yǎng)。然后愈傷組織轉(zhuǎn)入新芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(包括2.5mg/LBAP，50μg/ml特泯菌和25μg/ml潮霉素)，高光下孵育4-10周。單個再生植株苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(50μg/ml特泯菌和25μg/ml潮霉素，沒有激素)。在生長出大約5-7cm帶根的新芽后，轉(zhuǎn)基因植株被移種入土壤，在此在全光下生長。采用抗兔cbm(纖維素結(jié)合組件)的多克隆抗體ELISA，篩查轉(zhuǎn)基因系種子lif-cbm異源融合蛋白的表達(dá)。給出了轉(zhuǎn)基因植株最高的百分率的雜交的雙單倍體等基因系，被選作分子農(nóng)業(yè)的最適品系，稱作“Dimma”。
實(shí)施例3靶異源蛋白的生產(chǎn)從實(shí)施例2選擇的植株系并被稱作Dimma的種子基本按照上述轉(zhuǎn)化，除了編碼靶異源蛋白的基因被導(dǎo)入表達(dá)載體，而不是lif-cbm編碼序列。播種成功的轉(zhuǎn)化株并生長；收集種子和從其提取的靶蛋白。特別優(yōu)選表達(dá)靶異源蛋白作為cbm融合蛋白，因?yàn)檫@樣融合蛋白可以容易地提取并大規(guī)模純化，并且通過導(dǎo)入能被合適的蛋白酶識別的、在cbm編碼序列和編碼靶異源蛋白的序列之間的切割位點(diǎn)，融合蛋白的cbm部分能任選被輕易切割開來，并與靶異源蛋白分離。所述方法詳細(xì)描述于申請人的共同未決申請WO 2005/021762和WO 2005/021764，在此全文引入作為參考。
雖然只是具體闡述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)料到對前面實(shí)施例描述的本發(fā)明的眾多修改和變化，只要不背離本發(fā)明的精神和要求保護(hù)的范圍。
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1.一種產(chǎn)生種子具有可目測的特征性特性的可轉(zhuǎn)化植株的方法，包括如下步驟(a)提供用于在其種子或其任何部分表達(dá)和累積異源蛋白的所需的第一栽培種，其中所述栽培種通過組織培養(yǎng)適于植株轉(zhuǎn)化和植株再生，以及(b)提供種子具有可目測的特征性特性的第二栽培種，使得所述栽培種的種子與相同品種的普通農(nóng)作物或野生栽培種的種子有顯著的可目測的差異，所述的相同品種生長在意圖用于生長所述轉(zhuǎn)化植株的地理區(qū)域，(c)將所述的第二栽培種與所述的第一栽培種雜交，以產(chǎn)生雜交系，(d)所述雜交系與所述第一栽培種回交，以獲得雜交植株，其基因組基本上由所述第一栽培種的基因組組成，并具有與所述第二栽培種所見種子具有相同的可目測特征性特性的種子。(e)從所述雜交植株中選擇宿主雜交系，所述宿主雜交系保持了所述第一栽培種的特征使其可適于植株轉(zhuǎn)化和植株再生。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述可目測的特征性特性是與所述相同品種的普通農(nóng)作物或野生栽培種的種子顏色有顯著不同的種子顏色，所述相同品種生長在意圖用于生長所述轉(zhuǎn)化植株的地理區(qū)域。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述遺傳轉(zhuǎn)化的植株是單子葉植物。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述遺傳轉(zhuǎn)化的植株是大麥。
5.權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其中回交步驟(d)重復(fù)至少一次以得到所述雜交植株。
6.權(quán)利要求1-5的任一項所述的方法，其中所述雜交植株的小孢子被用于組織培養(yǎng)，以生成適于植株轉(zhuǎn)化和植株再生、并具有所述不同顏色的種子的等基因雜交系。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中用包含與啟動子可操作性連接的選擇標(biāo)記基因的核酸構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化多個所述的等基因雜交植株，并且基于所述核酸構(gòu)建體的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和表達(dá)效率的評價來選擇所述宿主雜交系。
8.權(quán)利要求2-8任一項所述的方法，其中至少50％的所述遺傳轉(zhuǎn)化植株的所述可目測標(biāo)記的種子的表面與生長在意圖用于生長所述轉(zhuǎn)化植株的地理區(qū)域的相同品種的普通農(nóng)作物或野生栽培種的種子有顯著不同的顏色。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，進(jìn)一步包含如下步驟(f)提供包含有編碼植株活性啟動子的核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述啟動子與編碼靶異源蛋白的核苷序列可操作性連接，(g)從所述的帶有所述核酸構(gòu)建體的宿主雜交系中轉(zhuǎn)化一或多個細(xì)胞，(h)從來自所述宿主雜交系的所述一或多個轉(zhuǎn)化的植株宿主細(xì)胞再生植株，并生長所述植株，以獲得表達(dá)所述異源蛋白的有可目測標(biāo)記的種子的遺傳轉(zhuǎn)化的植株。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述啟動子是種子特異性啟動子。
11.權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述的靶異源蛋白選自膠原、膠原酶、同源異形盒多肽、單克隆抗體、分泌的抗體、包括輕鏈和重鏈的抗體單鏈、甘露糖結(jié)合的凝集素、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰島素、酪蛋白、人生長激素、人血清白蛋白、人胰島素、纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶、肌醇六磷酸酶、水解酶、過氧化物酶、纖維蛋白原、凝血因子IX、凝血因子XIII、凝血酶、蛋白C、木聚糖酶、異淀粉酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、同工酶、β葡聚糖酶、葡糖腦苷脂酶、酪蛋白、乳糖酶、尿素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)化酶、鏈親合素、酯酶、堿性磷酸酶、蛋白酶抑制劑、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰島素、木瓜蛋白酶、激酶、磷酸酶、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷脂酶、脂肪酶、漆酶、蜘蛛絲蛋白、抗凍蛋白、抗微生物肽或防御素、生長因子和細(xì)胞分裂素。
12.權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述靶異源蛋白是白血病抑制因子。
13.權(quán)利要求9-12任一項所述的方法，其中所述核酸構(gòu)建體包含編碼纖維素結(jié)合組件(cbm)的核酸序列，所述cbm與編碼所述靶異源蛋白的核酸序列鄰接，任選被編碼蛋白水解切割位點(diǎn)的核酸序列所截斷。
14.權(quán)利要求9-13任一項所述的方法，其中具有所述的可目測標(biāo)記種子的遺傳轉(zhuǎn)化植株生長在如下條件下由此表達(dá)編碼所述靶異源蛋白的核酸序列被，使所述蛋白蓄積在所述植株的種子中。
15.一種轉(zhuǎn)基因大麥植株，在其種子中表達(dá)靶異源蛋白，在其種子或種皮中產(chǎn)生與傳統(tǒng)大麥如大麥品種Hordeumvulgaris的天然黃色種子顏色有明顯可目測差異的色素。
16.權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，產(chǎn)生足以給予植株的種子顯著的藍(lán)色、紅色、灰色或黑色的黑色、紅色或藍(lán)色色素。
17.權(quán)利要求15或16所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，在其種子中表達(dá)幾乎所有的所述異源蛋白。
18.權(quán)利要求15-17任一項所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，在其基因組中具有與編碼所述異源蛋白的核酸序列可操作性連接的種子特異性啟動子。
19.權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，其中所述種子特異性啟動子選自來自主要是種子特異性的單子葉植株的啟動子。
20.權(quán)利要求15-19任一項所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，所述植株為等基因的。
21.權(quán)利要求15-20任一項所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，適于組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化。
22.權(quán)利要求15-21任一項所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，其由權(quán)利要求9-14的任一項所述的方法產(chǎn)生。
23.權(quán)利要求15-22任一項所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株，其中所述異源蛋白作為含有碳水化合物結(jié)合組件的融合蛋白表達(dá)。
24.一種生產(chǎn)靶異源蛋白的方法，包括(a)生長根據(jù)權(quán)利要求15-23任一項的轉(zhuǎn)基因大麥植株，該植株與相同品種的普通農(nóng)作物或野生栽培種有可目測的不同種子，所述相同品種生長在所述轉(zhuǎn)基因大麥植株的地理區(qū)域，所述轉(zhuǎn)基因大麥植株在其種子中表達(dá)所述靶異源蛋白，(b)收獲所述植株并且(c)從其種子中提取所述異源蛋白。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中將多個所述的轉(zhuǎn)基因大麥植株生長在敞田中，與任何非轉(zhuǎn)基因的大麥植株隔開。
全文摘要
本發(fā)明涉及在收獲前和收獲后增加對轉(zhuǎn)基因種子的遏制和可追蹤性的改進(jìn)方法。該方法公開了分子農(nóng)業(yè)適用的所需植物栽培種的產(chǎn)生和選擇，所需植物栽培種特征在于易于適于轉(zhuǎn)化和再生長，并具有可目測的特征性特性，如種皮和種子其它部分的特定特征性著色，使種子在田里或在收獲期間和/或之后易于被追蹤并且，很容易與不具可目測的特征性特性的相同品種的非轉(zhuǎn)基因種子區(qū)別開來。
文檔編號C12N15/82GK101027398SQ200580027275
公開日2007年8月29日 申請日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月11日
發(fā)明者比約登·拉魯斯·奧瓦爾 申請人:奧夫萊夫塔?？四峁?br>