本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種細(xì)菌細(xì)胞破碎制劑及方法。

背景技術(shù)：

1、大腸桿菌為目前最廣泛使用的原核表達(dá)宿主，大腸桿菌的表達(dá)外源蛋白時(shí)一般存在于胞內(nèi)或周質(zhì)空間中，要獲得重組蛋白首先要進(jìn)行細(xì)胞破碎。通常比較有效的破碎方法有高壓勻漿、珠磨法和超聲波破碎等物理方法。但這些屬于較為劇烈的破碎方法，破碎過程中產(chǎn)生的剪切力與溫度上升存在使目標(biāo)產(chǎn)物變性的風(fēng)險(xiǎn)，且能耗較大，需要特殊機(jī)械設(shè)備?；瘜W(xué)滲透法、凍融法等其他方法對(duì)大腸桿菌的破碎效率很低。

2、以各種溶菌酶為基礎(chǔ)的大腸桿菌酶法破碎方法目前有2種：(1)直接使用溶菌酶對(duì)大腸桿菌裂解，條件溫和，能有效降低蛋白變性，但是溶菌酶價(jià)格較高，破碎成本高；(2)在需要裂解的大腸桿菌中表達(dá)溶菌酶，將重組蛋白和溶菌酶在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)，然后經(jīng)過凍融或表面活性劑、低濃度有機(jī)溶劑如氯仿等方法處理后，將細(xì)胞裂解，釋放胞內(nèi)蛋白；此法不需要直接添加溶菌酶，成本低，溫和，破碎效率高，但溶菌酶和重組蛋白同時(shí)在大腸桿菌中表達(dá)，溶菌酶的表達(dá)會(huì)干擾重組蛋白的表達(dá)；大腸桿菌生長(zhǎng)過程中溶菌酶有微量泄露，會(huì)降低大腸桿菌的生長(zhǎng)速度，影響大腸桿菌的生長(zhǎng)與重組蛋白的表達(dá)。

3、因此，目前需研究開發(fā)一種成本低，溫和，不會(huì)影響大腸桿菌的生長(zhǎng)與重組蛋白的表達(dá)的高效的大腸桿菌破碎方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌細(xì)胞破碎制劑及方法。該方法對(duì)細(xì)菌細(xì)胞破碎簡(jiǎn)單高效，條件溫和，且成本較低。

2、本發(fā)明原理是將溶菌酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，由于細(xì)胞質(zhì)中的溶菌酶不接觸細(xì)胞膜外的細(xì)胞壁，它不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生的非常極端的不利影響。將其他待破碎的大腸桿菌與表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌混合，在表面活性劑、金屬絡(luò)合劑、有機(jī)溶劑、凍融等方法的作用下，含溶菌酶的細(xì)胞內(nèi)的溶菌酶會(huì)釋放出，從而對(duì)不含溶菌酶的待破碎大腸桿菌細(xì)菌壁進(jìn)行水解，共同作用導(dǎo)致待破碎大腸桿菌細(xì)胞破碎。

3、為此，本發(fā)明第一方面提供了一種細(xì)菌細(xì)胞破碎制劑，其包含作為細(xì)菌細(xì)胞破碎主劑的表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌體和/或表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌體制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶為能夠水解肽聚糖的酶。

4、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述溶菌酶包括t4溶菌酶、t7溶菌酶和λ溶菌酶中的一種或幾種。

5、根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞破碎制劑還包含細(xì)胞破碎助劑，其包括細(xì)胞破碎液降粘制劑、表面活性劑、金屬絡(luò)合劑、tris緩沖液和有機(jī)溶劑中的一種或幾種。

6、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞破碎液降粘制劑包括非特異水解dna的核酸酶、表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體、由表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體制得的核酸酶粗品中的一種或幾種。

7、本發(fā)明第二方面提供了一種細(xì)胞破碎方法，其采用如本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞破碎制劑對(duì)待破碎菌進(jìn)行細(xì)胞破碎。

8、本發(fā)明中，所述待破碎菌包括革蘭氏陰性菌和/或革蘭氏陽(yáng)性菌。

9、根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞破碎方法包括將待破碎菌菌懸液與細(xì)胞破碎制劑混合形成細(xì)胞破碎體系，然后進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，使得待破碎菌細(xì)胞裂解。

10、根據(jù)本發(fā)明，在所述細(xì)胞破碎體系中，所述待破碎菌菌懸液與表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌懸液混合形成混合菌懸液。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在混合菌懸液中，表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌懸液的濃度與待破碎菌菌濃度之比≥1:5000。

12、本發(fā)明中，所述細(xì)胞破碎制劑包含作為細(xì)菌細(xì)胞破碎主劑的表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌體和/或表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌體制得的溶菌酶粗品，其中，所述溶菌酶為能夠水解肽聚糖的酶。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述溶菌酶包括但不限于t4溶菌酶、t7溶菌酶和λ溶菌酶中的一種或幾種。

14、根據(jù)本發(fā)明，所述細(xì)胞破碎制劑還包含細(xì)胞破碎助劑，其包括細(xì)胞破碎液降粘制劑、表面活性劑、金屬絡(luò)合劑、tris緩沖液和有機(jī)溶劑中的一種或幾種。

15、本發(fā)明中，所述表面活性劑包括但不限于烷基糖苷apg0814、烷基糖苷apg0810和triton?x-100的一種或幾種；優(yōu)選地，本發(fā)明中所述表面活性劑的工作濃度包括但不限于0-5％(w/v)。

16、本發(fā)明中，所述金屬絡(luò)合劑包括但不限于edta等；優(yōu)選地，所述金屬絡(luò)合劑的工作濃度包括但不限于0-30mm。

17、本發(fā)明中，所述有機(jī)溶劑包括但不限于甲苯和/或氯仿等；優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑的工作濃度包括但不限于0-2％(v/v)。

18、優(yōu)選地，所述tris緩沖液的濃度包括但不限于0-100mm。

19、如前所述，本發(fā)明原理是將溶菌酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，由于細(xì)胞質(zhì)中的溶菌酶不接觸細(xì)胞膜外的細(xì)胞壁，它不會(huì)對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生的非常極端的不利影響。

20、在本發(fā)明的一些具體的例子中，采用表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌對(duì)待破碎菌進(jìn)行破碎，將待破碎菌菌懸液與表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌菌懸液混合形成混合菌懸液，向其中加入表面活性劑、金屬絡(luò)合劑、tris緩沖液、有機(jī)溶劑等中的一種或幾種細(xì)胞破碎助劑，在細(xì)胞破碎助劑的作用下，含溶菌酶的細(xì)胞內(nèi)的溶菌酶會(huì)釋放出，從而對(duì)不含溶菌酶的待破碎大腸桿菌細(xì)菌壁進(jìn)行水解，共同作用導(dǎo)致待破碎大腸桿菌細(xì)胞破碎。

21、在一些具體例子中，所述表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌包括但不限于根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)含有t4溶菌酶目的序列的dna序列(如seq?id?no.1所示)的大腸桿菌、根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)含有t7溶菌酶目的序列的dna序列(如seq?id?no.3所示)的大腸桿菌。

22、在一些具體例子中，所述細(xì)胞破碎助劑還包括細(xì)胞破碎液降粘制劑，其能夠在細(xì)胞破碎過程中降低細(xì)胞破碎液的粘度，有益于細(xì)胞破碎，有利于破碎液處理。

23、本發(fā)明中，所述細(xì)胞破碎液降粘制劑包括非特異水解dna的核酸酶、表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體、由表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體制得的核酸酶粗品中的一種或幾種。

24、優(yōu)選地，細(xì)胞破碎液降粘制劑包括表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體和/或由表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌菌體制得的核酸酶粗品。

25、優(yōu)選地，所述非特異水解dna的核酸酶包括全能核酸酶、金黃色葡萄球菌核酸酶b(staphylococcus?aureus?nucleaseb)和脫氧核糖核酸酶i中的一種或幾種。

26、進(jìn)一步優(yōu)選地，在細(xì)胞破碎體系中，降粘制劑的濃度與含待破碎菌的菌懸液中菌濃度之比≥1:20萬(wàn)。

27、在一些具體例子中，所述表達(dá)非特異水解dna的核酸酶的大腸桿菌包括但不限于根據(jù)大腸桿菌密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)含有粘質(zhì)沙雷菌(serratia?marcescens)來(lái)源的全能核酸酶目的序列的dna序列(如seq?id?no.2所示)的大腸桿菌。

28、在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，在所述細(xì)胞破碎體系中，所述細(xì)胞破碎制劑中細(xì)胞破碎主劑、細(xì)胞破碎助劑同時(shí)加入或者分次加入。

29、優(yōu)選地，細(xì)胞破碎過程中對(duì)含待破碎菌的體系進(jìn)行冷凍處理。

30、本發(fā)明中所述“含待破碎菌的體系”包括待破碎菌的菌體、含待破碎菌的菌懸液、由含待破碎菌菌懸液和細(xì)菌細(xì)胞破碎制劑混合而成的混合液。

31、在一些具體例子中，含待破碎菌的體系(例如，混合菌懸液)經(jīng)過冷凍，解凍，放置，然后完成待破碎菌細(xì)胞破碎。

32、本發(fā)明中所述用語(yǔ)“工作濃度”是指反應(yīng)物或反應(yīng)試劑在反應(yīng)體系內(nèi)的濃度。

33、本發(fā)明提供了一種細(xì)菌細(xì)胞破碎制劑及方法，該方法表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌和待破碎的細(xì)菌是兩種不同菌體，本發(fā)明細(xì)胞破碎不需要直接添加溶菌酶，使用表達(dá)溶菌酶的大腸桿菌成本低；待破碎的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)并無(wú)溶菌酶，不會(huì)影響待破碎的細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)；可以溫和、高效的破碎細(xì)胞。