本發(fā)明涉及一種α-淀粉酶、α-淀粉酶基因、高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌及其應(yīng)用，屬于生物和酶工程。

背景技術(shù)：

1、淀粉酶是一種存在于人類到微生物體內(nèi)的酶類，其在淀粉和多糖水解成葡萄糖和麥芽糖等簡(jiǎn)單糖中發(fā)揮著基礎(chǔ)性作用。淀粉酶的廣泛應(yīng)用涵蓋多個(gè)行業(yè)：在食品加工中，它加速淀粉的水解，用于面包和啤酒等產(chǎn)品；在制藥中，它有助于消化酶的補(bǔ)充；在生物技術(shù)中，它促進(jìn)dna提取和酶消化反應(yīng)；在紡織業(yè)中，它通過(guò)去除淀粉殘留增強(qiáng)織物柔軟性。這種多功能酶類顯著提升了這些不同領(lǐng)域的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。

2、根據(jù)淀粉酶催化水解的位置不同，可分為三種主要類型：α-淀粉酶、β-淀粉酶和γ-淀粉酶。α-淀粉酶(ec?3.2.1.1)屬于糖苷水解酶家族13(gh13)，具有多結(jié)構(gòu)域，水解淀粉和相關(guān)糖類中內(nèi)部的α-1,4-糖苷鍵，生成較短的寡糖。相反，β-淀粉酶(ec?3.2.1.2)屬于糖苷水解酶家族14(gh14)，通常為單體酶，特異性地從聚葡聚糖鏈的非還原端水解第二個(gè)α-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖。另一方面，γ-淀粉酶(ec?3.2.1.3)屬于糖苷水解酶家族15(gh15)，除了水解淀粉和支鏈淀粉的非還原端末α-1,4-糖苷鍵外，還水解α-1,6-糖苷鍵，與其他形式的淀粉酶不同，生成葡萄糖。目前，由于α-淀粉酶具有更廣泛的底物特異性、在各種生物體中來(lái)源豐富、ph范圍適應(yīng)廣泛的優(yōu)勢(shì)，以及在食品加工、釀造、紡織和生物技術(shù)等多個(gè)工業(yè)應(yīng)用中的多樣性，比β-淀粉酶和γ-淀粉酶應(yīng)用更廣泛。此外，α-淀粉酶在各種條件下的穩(wěn)定性和對(duì)高溫的耐受性進(jìn)一步增強(qiáng)了其在工業(yè)環(huán)境中的實(shí)用性。

3、α-淀粉酶可以從植物、動(dòng)物和微生物中獲得。然而，動(dòng)植物來(lái)源的α-淀粉酶活性和產(chǎn)量較低，顯著限制了其工業(yè)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。隨著微生物發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)展和改進(jìn)，微生物發(fā)酵由于具有高效性、可控性、豐富的來(lái)源、可持續(xù)性和高純度等優(yōu)勢(shì)，已成為工業(yè)α-淀粉酶生產(chǎn)的主要方法。目前，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道真菌和細(xì)菌都能生產(chǎn)α-淀粉酶，其中大多數(shù)生產(chǎn)α-淀粉酶的真菌集中在熱耐性真菌，特別是aspergillus(曲霉菌屬)和penicillium(青霉菌屬)的真菌屬，已經(jīng)建立了特定的培養(yǎng)條件，并選擇了優(yōu)良的真菌菌株進(jìn)行商業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。此外，包括bacillus(芽孢桿菌屬)和某些嗜鹽細(xì)菌如chromohalobacter?sp.(色鹽桿菌)和halobacillussp.(嗜鹽芽胞桿菌)的各種細(xì)菌也能生產(chǎn)α-淀粉酶。然而，對(duì)于商業(yè)應(yīng)用，α-淀粉酶主要來(lái)源于bacillus(芽孢桿菌屬)細(xì)菌，bacillus?amyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)、bacillus?licheniformis(地衣芽孢桿菌)、bacillus?stearothermophilus(嗜熱脂肪芽孢桿菌)、bacillus?subtilis(枯草芽孢桿菌)、bacillus?megaterium(巨大芽孢桿菌)和bacillus?circulans(環(huán)狀芽孢桿菌)等菌種生產(chǎn)的酶已在多個(gè)工業(yè)過(guò)程中顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4、與真菌中的分子遺傳操縱復(fù)雜性以及大腸桿菌相關(guān)的內(nèi)毒素安全問(wèn)題相比，芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有宿主非致病性、表達(dá)蛋白中無(wú)內(nèi)毒素、顯著的耐熱性、沒(méi)有顯著的密碼子偏好以及高效的分泌信號(hào)肽和分子伴侶系統(tǒng)等優(yōu)勢(shì)。在大多數(shù)情況下，由芽孢桿菌分泌的重組蛋白質(zhì)能夠保持其天然構(gòu)象和生物活性，從而避免包含體的形成。此外，芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有短的表達(dá)周期和高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。因此，芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)被廣泛用于高效表達(dá)各種酶類。例如，li等人結(jié)合雙啟動(dòng)子工程和啟動(dòng)子修飾，增強(qiáng)了在b.subtilis(枯草芽孢桿菌)中的myz1(一種淀粉酶基因)分泌產(chǎn)量，amyz1(一種淀粉酶)的胞外活性增加了3.11倍。chen等人通過(guò)過(guò)表達(dá)分子伴侶prsa(一種分子伴侶基因)基因，優(yōu)化了重組amym(一種淀粉酶)的分泌效率，其胞外酶活性增加了101.58％。盡管在提高產(chǎn)量方面已付出了相當(dāng)大的努力，但由于工業(yè)需求的不斷增長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)更高效的α-淀粉酶仍具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種α-淀粉酶，為現(xiàn)有提供一種ph穩(wěn)定性強(qiáng)、耐溫范圍廣以及對(duì)有機(jī)溶劑抵抗能力強(qiáng)的α-淀粉酶。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種α-淀粉酶基因，為現(xiàn)有技術(shù)提供一種新的α-淀粉酶基因。

3、本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌，為現(xiàn)有技術(shù)中提供了一種高效表達(dá)α-淀粉酶的工程菌。

4、本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌在α-淀粉酶生產(chǎn)中的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中α-淀粉酶生產(chǎn)菌產(chǎn)α-淀粉酶效率較低的問(wèn)題。

5、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種α-淀粉酶的技術(shù)方案是：

6、一種α-淀粉酶，所述α-淀粉酶的氨基酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.18或seqid?no.19所示。

7、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本發(fā)明的一種α-淀粉酶為開(kāi)拓型發(fā)明。本發(fā)明通過(guò)篩選獲得一株具有較強(qiáng)淀粉降解能力的天然菌株a8-1，對(duì)a8-1發(fā)酵生產(chǎn)的α-淀粉酶進(jìn)行酶學(xué)特性分析，發(fā)現(xiàn)該α-淀粉酶在50℃時(shí)酶活力最大，但是在30～70℃溫度范圍內(nèi)均能保持較高的酶活，且當(dāng)溫度為80℃時(shí)，還能保持50％以上的酶活；同時(shí)該α-淀粉酶在ph為7時(shí)酶活力最大，但是在ph為4～8的范圍內(nèi)均能保持較高的酶活；而且乙醇、甘油、丙二醇等有機(jī)溶劑對(duì)該α-淀粉酶酶活影響極小。這說(shuō)明本發(fā)明提供的具有如seq?id?no.1所示氨基酸序列的α-淀粉酶具有ph穩(wěn)定性強(qiáng)、耐溫范圍廣以及對(duì)有機(jī)溶劑抵抗能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。

8、進(jìn)一步地，本發(fā)明又通過(guò)生物信息學(xué)分析，確定如seq?id?no.1所示氨基酸序列的α-淀粉酶中的信號(hào)肽，通過(guò)基因工程的手段將原始信號(hào)肽更換為來(lái)源于乳酸菌lactobacillus?plantarum的tag1(信號(hào)肽sp001)和來(lái)源于嗜熱脂肪土芽胞桿菌(geobacillus?stearothermophilus)的bgls(信號(hào)肽sp002)，獲得具有如seq?id?no.18和seq?id?no.19所示氨基酸序列的α-淀粉酶。

9、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種α-淀粉酶基因的技術(shù)方案是：

10、一種α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因的核苷酸序列如seq?id?no.2、seq?idno.16或seq?id?no.17所示。

11、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)對(duì)具有較強(qiáng)淀粉降解能力的天然菌株a8-1的基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其具有如seq?id?no.2所示核苷酸序列的α-淀粉酶基因amy(a8-1)，由其編碼的α-淀粉酶具有ph穩(wěn)定性強(qiáng)、耐溫范圍廣以及對(duì)有機(jī)溶劑抵抗能力強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明為現(xiàn)有技術(shù)提供一種新的、來(lái)源于貝萊斯芽孢桿菌的α-淀粉酶基因。

12、進(jìn)一步地，本發(fā)明又通過(guò)基因工程技術(shù)，將α-淀粉酶基因amy(a8-1)中編碼信號(hào)肽部分的核苷酸序列進(jìn)行替換，獲得具有如seq?id?no.16和seq?id?no.17所示核苷酸序列的α-淀粉酶基因。

13、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌的技術(shù)方案是：

14、一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌，所述工程菌以芽孢桿菌為出發(fā)菌，過(guò)表達(dá)核苷酸序列如seq?id?no.2、seq?id?no.16或seq?id?no.17所示的α-淀粉酶基因；所述芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌。

15、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)α-淀粉酶基因amy(a8-1)的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入不同的芽孢桿菌宿主中，在不同的芽孢桿菌宿主中過(guò)表達(dá)α-淀粉酶基因amy(a8-1)，獲得了高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌。α-淀粉酶發(fā)酵活性分析表明，α-淀粉酶基因amy(a8-1)在解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌中均能高效表達(dá)。

16、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述解淀粉芽孢桿菌為解淀粉芽孢桿菌hz12或解淀粉芽孢桿菌bax-5；所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌wb800或枯草芽孢桿菌168；所述地衣芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌bl10。

17、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本發(fā)明對(duì)構(gòu)建的多個(gè)工程菌進(jìn)行α-淀粉酶發(fā)酵活性分析，結(jié)果表明α-淀粉酶基因amy(a8-1)在上述宿主菌中均能表達(dá)，其中bax-5為最佳宿主。

18、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：構(gòu)建表達(dá)α-淀粉酶基因的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入芽孢桿菌中，使α-淀粉酶過(guò)表達(dá)。

19、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體為pt-17。

20、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌在α-淀粉酶生產(chǎn)中的應(yīng)用的技術(shù)方案是：

21、一種高產(chǎn)α-淀粉酶的工程菌在α-淀粉酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。

22、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本發(fā)明為了進(jìn)一步提高α-淀粉酶活性，進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵條件。在最佳條件下，bax-5/ptamy(a8-1)sp002的酶活性達(dá)到1440u/ml，比原始野生型菌株a8-1高出9.2倍，而且緩解了發(fā)酵液粘性問(wèn)題，在α-淀粉酶生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)。