本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及表達dtmuv病毒樣顆粒的重組鴨瘟病毒及其構建方法和應用。

背景技術：

1、鴨坦布蘇病毒(dtmuv)及其他的水禽tmuv均具有黃病毒屬性。因此，關于dtmuv疫苗的研制是非常迫切的。目前，已有商品化的dtmuv滅活疫苗(hb株)和減毒疫苗(wf100株)。這些疫苗各有優(yōu)缺點，滅活苗安全性高、但價格高，而減毒疫苗存在一定安全隱患。鴨瘟是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高，曾給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。

2、鴨瘟的防控目前主要靠傳統(tǒng)鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗，鴨瘟弱毒疫苗在水禽生產(chǎn)上廣泛應用，具有免疫效果好、安全性高的特點，還能突破母源抗體的干擾。但不能區(qū)分免疫鴨和自然感染鴨，影響該病的免疫檢測及監(jiān)控。這也是疫苗研究工作者急需解決的問題。

3、鴨瘟病毒(dev)除了具有皰疹病毒特性之外，商品化的dev弱化疫苗株已被廣泛用于dev的防控。因此，dev是極佳的用于研發(fā)水禽疫苗的病毒載體候選者。迄今為止，研究者已嘗試以dev為載體，分別將傳染性法氏囊病病毒、鴨病毒性肝炎病毒i型和iii型、新城疫病毒、h5n1亞型禽流感病毒(aiv)、h5n6亞型aiv、h5n8亞型aiv、h9n2亞型aiv、dtmuv、鵝細小病毒、鵝h5亞型禽流感病毒的抗原基因插入至dev基因組中，用于研發(fā)相關的二聯(lián)疫苗。chen等分別將前綴信號肽tpas的dtmuv截短形式的e蛋白(te)和與prm串聯(lián)表達的e截短體(prm/te)插入到dev疫苗株基因組的us7/us8間，獲得了兩株重組鴨瘟病毒，該病毒感染雞胚成纖維細胞能表達外源蛋白，并能誘導鴨體產(chǎn)生e蛋白抗體，經(jīng)過兩次免疫，rdev-prm/te能完全保護鴨免受dtmuv的攻擊，而rdev-te只能保護部分鴨子遭受dtmuv攻毒。該研究顯示，ttpa信號肽的加入增加了e蛋白的表達量及分泌型蛋白的產(chǎn)生。zou等以dev作為載體表達dtmuv全長e基因也取得了成功。重組病毒c-kce-e能保護鴨免于dev強毒攻擊，且能產(chǎn)生dtmuv?e蛋白中和性抗體。之后，zou等又同時將h5n1亞型禽流感病毒ha和dtmuvprm-e克隆至dev疫苗株基因組，獲得了重組病毒c-kce-ha/prm-e，該病毒能誘導部分鴨產(chǎn)生針對h5n1亞型aiv和dtmuv的中和性抗體，但同時也能誘導機體產(chǎn)生體液免疫，接種重組病毒能保護鴨免于dev、h5n1亞型aiv和dtmuv強毒的攻擊。我們也經(jīng)過長期的研究構建了表達不同形式dtmuv?e抗原的重組鴨瘟病毒，并對其表達條件進行了優(yōu)化，雖然這些研究取得了不錯的成績，但還沒有以鴨瘟病毒作為載體表達dtmuv病毒樣顆粒的報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了表達dtmuv病毒樣顆粒的重組鴨瘟病毒及其構建方法和應用，所述重組病毒能形成dtmuv病毒樣顆粒(vlps)，可以穩(wěn)定誘導鴨產(chǎn)生針對dtmuv?e蛋白的特異性抗體。

2、本發(fā)明提供了重組多核苷酸，包括依次連接的c基因、prm基因和截短的e基因；

3、所述c基因、prm基因和截短的e基因均來源于鴨坦布蘇病毒基因組，且在所述連接前以鴨為宿主進行了密碼子優(yōu)化。

4、在本發(fā)明一個具體實施方式中，經(jīng)密碼子優(yōu)化后的c基因的核苷酸序列包括seqid?no.1所示的序列；

5、經(jīng)密碼子優(yōu)化后的prm基因的核苷酸序列包括seq?id?no.2所示的序列。

6、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述截短的e基因包括僅保留1-451位氨基酸序列的截短的e基因；

7、所述截短的e基因的核苷酸序列包括seq?id?no.3所示的序列。

8、本發(fā)明提供了一種包含上述重組多核苷酸的重組質粒。

9、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述重組質粒的基礎骨架質粒包括pep-bgh-end質粒。

10、本發(fā)明提供了上述重組多核苷酸或上述重組質粒在構建重組鴨瘟病毒中的應用。

11、本發(fā)明提供了重組鴨瘟病毒突變體bac克隆的構建方法，包括以下步驟：

12、(1)將上述重組多核苷酸插入pep-bgh-end中，得重組質粒pep-pcmv-cme451；

13、(2)以步驟(1)所述重組質粒pep-pcmv-cme451為模板，利用引物對進行pcr擴增，將pcr擴增片段轉化至菌株感受態(tài)細胞中，篩選得到含kan標記的重組克隆中間體ppcmv-kan.cme451；所述菌株感受態(tài)細胞為攜帶有鴨瘟病毒疫苗株感染性bac克隆(pdev-ef1，簡稱pe1)的菌株；所述引物對包括核苷酸序列如seq?id?no.4所示的上游引物和核苷酸序列如seq?id?no.5所示的下游引物；

14、(3)通過同源重組去除步驟(2)得到的所述重組克隆中間體ppcmv-kan.cme451的kan基因，構建得到重組鴨瘟病毒突變體bac克隆。

15、本發(fā)明還提供了利用上述構建方法得到的重組鴨瘟病毒突變體bac克隆。

16、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆經(jīng)拯救后得到的重組病毒。

17、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆或上述重組病毒制備得到的病毒樣顆粒。

18、本發(fā)明還提供了利用上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆、上述重組病毒或上述病毒樣顆粒在制備疫苗中的應用。

19、在本發(fā)明一個具體實施方式中，所述疫苗包括二聯(lián)活疫苗。

20、本發(fā)明還提供了一種疫苗，包括上述重組鴨瘟病毒突變體bac克隆、上述重組病毒或上述病毒樣顆粒，和藥學上可接受的輔料。

21、有益效果：本發(fā)明提供了一種來源于鴨坦布蘇病毒基因組并以鴨為宿主進行了密碼子優(yōu)化的重組多核苷酸(cme451基因)，包括依次連接的c基因、prm基因和截短的e基因。本發(fā)明將所述重組多核苷酸插入到pep-bgh-end，構建得到質粒pep-pcmv-cme451。

22、本發(fā)明以pep-pcmv-cme451質粒為模板，并通過“red?e/t兩步重組”獲得重組鴨瘟突變體bac克隆，如含kan標記的重組bac克隆中間體ppcmv-kan.cme451；以及去除kan基因后只含有pcmv-cme451-bgh-pa表達框的重組子ppcmv-cme451。

23、本發(fā)明利用雞胚成纖維細胞(cefs)對ppcmv-cme451進行拯救，拯救得到rpcmv-cme451。本發(fā)明所述rpcmv-cme451蝕斑面積較re1增加了46％；將rpcmv-cme451感染細胞后能檢測到相應的dtmuv病毒e蛋白，顯示為三條條帶，疑似為外源蛋白裂解前后的含e451蛋白的條帶：cme451(81.31kda)、me451(68.03kda)和e451(49.06kda)。在透射電鏡下，rpcmv-cme451病毒感染cefs后，dtmuv?c-m-e451形成病毒樣顆粒(vlps)結構；重組病毒rpcmv-cme451感染鴨能產(chǎn)生針對e蛋白的抗體，在第2次免疫1w時抗體陽轉率達到100％。