本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法及抗氧化肽產(chǎn)品。

背景技術：

1、活性氧(ros)是正常細胞代謝的副產(chǎn)物。雖然一定水平的ros對生理過程是必不可少的，但它們的過度積累會導致氧化應激，損害人體的健康。氧化應激會導致蛋白質交聯(lián)、脂質過氧化、rna和dna損傷等有害影響，從而發(fā)展為慢性疾病。抗氧化劑是一種能夠捕獲和中和ros，從而減輕其對人體的有害損傷的物質。因此，在食品和藥物中補充抗氧化劑是對抗過量ros損傷的首選策略?？紤]到人工抗氧化劑對健康的不利影響，如致癌作用、高成本等，人們越來越傾向于探索天然、高效和無毒的替代品。在天然食物來源中尋找安全的抗氧化肽尤為重要。這些多肽可以通過微生物發(fā)酵、消化酶解、化學合成等多種途徑得到，并且大多具有抗氧化活性的多肽是由2-20個氨基酸組成，分子量在500-1500da之間，含有一定量的疏水氨基酸、芳香族氨基酸，同時在n端或c端區(qū)域中疏水氨基酸的存在也可以增強多肽的抗氧化活性。

2、抗氧化肽作為食品科學和營養(yǎng)學的研究熱點，可以通過清除自由基、抑制過氧化物和螯合金屬離子來發(fā)揮作用。因此，如何有效地發(fā)現(xiàn)和篩選抗氧化肽已成為研究和生產(chǎn)中的關鍵問題。傳統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)方法耗時且昂貴，對解決抗氧化肽的定量構效關系也具有挑戰(zhàn)性。一些新技術，包括分子對接、人工智能(ai)、生物信息學等，正作為解決傳統(tǒng)方法帶來的問題提供了新思路。這些新技術具有發(fā)現(xiàn)抗氧化肽的有效能力，即具有高通量篩選的潛力。此外，結合這些新技術可以克服單一技術的缺點，從而提高效率和擴大發(fā)現(xiàn)范圍。其中，分子對接是評價抗氧化活性、闡明抗氧化機制和預測抗氧化肽定量構效關系的有效方法。更為重要的是分子對接預測了抗氧化肽與信號通路的關鍵靶點結合的能力。keap1-nrf2信號通路是其主要的代表?？寡趸耐ㄟ^與keap1的kelch結構域結合，阻斷keap1-nrf2的相互作用，釋放nrf2易位到細胞核。nrf2與抗氧化反應元件(are)結合，促進抗氧化相關基因的轉錄，發(fā)揮抗氧化作用。

3、中國專利cn202211407894.7公開了一種基于分子模擬技術的牛乳清蛋白源抗氧化肽的篩選，中國專利cn202410486383.1公開了一種人工合成的抗氧化肽pep9及其應用，中國專利cn202211404356.2公開了一種基于老年人靜態(tài)消化模型的乳清蛋白源抗氧化肽的篩選。分子對接作為一個預測抗氧化肽的抗氧化能力和機制常用的方法，是一種強大的技術。它可以將大量的候選肽縮小到少量，促進將來更有針對性的實驗研究，不僅節(jié)省了大量的實驗時間，而且可以更有效地利用有限的研究資源。然而，將分子對接技術與細胞水平驗證實驗結合篩選抗氧化肽的發(fā)明專利報道不多。因此，研發(fā)一種基于分子對接和細胞層面的研究手段篩選出抗氧化肽的方法，對進一步認識多肽的抗氧化作用機制有一定的指導意義，能夠為后續(xù)篩選抗氧化肽提供了一定的理論基礎。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足和實際需求，本發(fā)明提供了一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法及抗氧化肽產(chǎn)品。本發(fā)明提供的方法利用分子對接的方法驗證肽與keap1活性位點的結合能力，選擇與keap1活性位點能互相結合的肽，即為抗氧化肽。采用該方法篩選得到的抗氧化肽通過氫鍵、范德華力和烷基相互作用與keap1活性位點結合，通過激活keap1-nrf2通路，增強細胞對h2o2誘導的氧化損傷的抗性，從而發(fā)揮抗氧化作用。所述抗氧化肽具有較好的抗氧化活性，具有安全無毒的特點，對開發(fā)具有抗氧化功能和抗衰老功能的產(chǎn)品具有十分重要的意義。

2、本發(fā)明的技術方案包括：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)keap1蛋白篩選抗氧化肽的方法，所述的方法包括：利用分子對接的方法驗證肽與keap1活性位點的結合能力，選擇與keap1活性位點能互相結合的肽，即為抗氧化肽。

4、具體地，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspev。

5、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽valalare具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。seq?idno.1：valalare。

6、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽leaspev具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。seq?idno.2：leaspevi。

7、具體地，所述的keap1活性位點包括：ala366、ala607、arg326、aly466、asn469、cys368、gln563、gly509、gly564、his562、ile559、leu365、leu468、thr560、val369、val418、val463、val467、val512、val514、val561中的一種或多種。

8、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽valalare與val512、val467、gly564、gln563、arg326、val418、leu468、ala607、ala466、cys368、ala366、asn469、thr560和his562結合。

9、優(yōu)選地，所述的抗氧化肽leaspev與val514、arg326、val512、val467、val561、ala607、cys368、ile559、val369、val418、val608、val463、gly509、leu365和ala466結合。

10、優(yōu)選地，所述的肽與keap1活性位點的結合方式包括：氫鍵、范德華力和烷基相互作用中的一種或多種。

11、第二方面，本發(fā)明提供了上述方法篩選得到的抗氧化肽，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare，具有如seq?id?no.1所示的氨基酸序列。

12、第三方面，本發(fā)明提供了上述方法篩選得到的抗氧化肽，所述的抗氧化肽為抗氧化肽leaspevi，具有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列。

13、第四方面，本發(fā)明提供了編碼上述抗氧化肽的核苷酸，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

14、第五方面，本發(fā)明提供了上述抗氧化肽的制備方法，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

15、優(yōu)選地，所述的制備方法為：通過固相合成法制備。

16、第六方面，本發(fā)明提供了上述抗氧化肽在制備抗氧化產(chǎn)品或抗衰老產(chǎn)品中的應用，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

17、優(yōu)選地，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品。

18、優(yōu)選地，所述的抗衰老產(chǎn)品包括藥品或化妝品。

19、第七方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化產(chǎn)品，所述的抗氧化產(chǎn)品包含上述抗氧化肽，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

20、第七方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化產(chǎn)品，所述的抗氧化產(chǎn)品包含上述抗氧化肽，所述的抗氧化產(chǎn)品包括食品添加劑、保健品、藥品或化妝品，所述的抗氧化肽為抗氧化肽valalare和/或抗氧化肽leaspevi。

21、本發(fā)明的有益效果為：

22、(1)本發(fā)明采用分子對接的方法驗證兩種抗氧化肽valalare和leaspevi與keap1活性位點的結合模式，結果表明，抗氧化多肽與keap1蛋白匹配較好，結合能力強，說明兩種多肽是潛在的抗氧化多肽，其中多肽與keap1的ala607、val514和asn469氨基酸殘基的結合未見報道過。

23、(2)以往的專利所分離的抗氧化肽大多數(shù)為混合物，同時在細胞層面的抗氧化活性也未體現(xiàn)，而本發(fā)明所分離純化的抗氧化多肽在細胞層面的活性評價較好，從而證明了本發(fā)明所提供的抗氧化多肽的功能性更加完善，使發(fā)明更具有說服性。