本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及人ugt1a4基因多態(tài)性檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、拉莫三嗪(lamotrigine，ltg)是一種用于治療癲癇和雙相情感障礙的抗驚厥藥物。常見的副作用包括嗜睡，頭痛，嘔吐，協(xié)調(diào)困難和皮疹。嚴(yán)重的副作用包括缺乏紅細(xì)胞，導(dǎo)致stevens-johnson綜合征和過敏反應(yīng)。中國癲癇診療指南、《拉莫三嗪個(gè)體化給藥臨床藥師指引》已列出拉莫三嗪治療癲癇的參考濃度范圍和預(yù)警值，以及治療雙相情感障礙的預(yù)警值，作為劑量調(diào)整和預(yù)判不良反應(yīng)的參考。

2、拉莫三嗪ltg主要在肝微粒體經(jīng)尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(ugt)代謝，其中主要的代謝酶為ugt1a4,參與多種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝。多項(xiàng)ugt1a4*3基因多態(tài)性與拉莫三嗪藥動(dòng)力學(xué)相關(guān)的研究，表明ugt1a4*3(142t>g)突變可降低拉莫三嗪血藥濃度。

3、針對ugt1a4*3(142t>g)基因多態(tài)性檢測的方法有多種，主要包含dna直接測序法、核酸質(zhì)譜分析法、多重pcr結(jié)合片段長短分析法。sanger測序法操作復(fù)雜,成本較高。cn110184345a和cn113249460a均采用核酸質(zhì)譜分析方法，發(fā)明提供了一種用于精神疾病或焦慮癥患者用藥指導(dǎo)的基因群檢測試劑盒pannel，cn109825574a采用多重pcr結(jié)合片段長短分析法，公開了一種用于抗癲癇治療藥物用藥指導(dǎo)的多重基因檢測試劑盒；其中均包含ugt1a4*3多態(tài)性位點(diǎn)的設(shè)計(jì)信息，但是此類設(shè)計(jì)復(fù)雜、包含檢測藥物很多、檢測費(fèi)用相對很高，更適合初步確診患者在選藥試藥前進(jìn)行大檢查，然而根據(jù)臨床信息基本鎖定幾種藥物時(shí)，選擇上面的設(shè)計(jì)和檢查方案可能存在較高的經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)。

4、taqman探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，在pcr反應(yīng)中加入兩條兩端帶有不同熒光標(biāo)記的特異探針來識別不同的等位基因。其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號可被淬滅。在pcr擴(kuò)增過程中，若taqman探針與靶標(biāo)序列完全匹配，探針則可結(jié)合在dna模板上，此時(shí)taq酶延伸至探針位置時(shí)，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號越來越強(qiáng)，從而可通過儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化過程。目前市面上暫沒有針對單個(gè)位點(diǎn)ugt1a4*3基因多態(tài)性的taqman試劑盒，那么開發(fā)一種檢測ugt1a4*3基因多態(tài)性的產(chǎn)品，以實(shí)現(xiàn)高靈敏度高特異性、快速且低成本、更方便快捷的ugt1a4*3基因多態(tài)性檢測是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供了一種采用pcr熒光探針法(改良版)檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。該試劑盒能夠精確區(qū)分ugt1a4*3位點(diǎn)的三種基因型，顯著提升了檢測的準(zhǔn)確性，并降低了最低檢出限。這一改進(jìn)使得該試劑在基因分型檢測中的應(yīng)用更加可靠和高效。用藥前通過基因檢測結(jié)合患者臨床及診斷信息，有助于醫(yī)生快速確定給藥方案和藥物劑量，減少患者前期試藥和劑量調(diào)整等過程。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

5、本發(fā)明在一方面，提供了一種用于檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的引物和探針組合物，用于檢測ugt1a4142t>g位點(diǎn)。包含正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型檢測探針。還包含內(nèi)標(biāo)上游引物、內(nèi)標(biāo)下游引物和內(nèi)標(biāo)探針。

6、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型檢測探針的具體序列：正向引物f選自seq?id?no:1-3所示的核苷酸序列；反向引物r選自seq?idno:4-6所示的核苷酸序列；野生型檢測探針選自seq?id?no:7-8所示的核苷酸序列；突變型檢測探針選自seq?id?no:9-10所示的核苷酸序列。

7、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了內(nèi)標(biāo)上游引物、內(nèi)標(biāo)下游引物和內(nèi)標(biāo)探針的具體序列：內(nèi)標(biāo)上游引物為seq?id?no:11所示的核苷酸序列；內(nèi)標(biāo)下游引物為seq?id?no:12所示的核苷酸序列；內(nèi)標(biāo)探針為seq?id?no:13所示的核苷酸序列。

8、在一個(gè)方面，所有檢測探針5’端均連接發(fā)光報(bào)告基團(tuán)，發(fā)光報(bào)告基因選自rox、fam或vic；所有檢測探針3’端均連接磷酸基團(tuán)和能夠吸收5’端發(fā)射熒光信號的淬滅基團(tuán)，淬滅基團(tuán)選自bhq2或nfq。

9、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種擴(kuò)增pcr反應(yīng)溶液，pcr反應(yīng)溶液包含引物、探針、dntp、tris-hcl、抗體修飾taqdna聚合酶、mgcl2、dutp、37℃非熱敏udg酶、kcl、glycerol、dmso、formamide、triton100等組成成分。

10、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒，所述試劑盒包括如下組分：樣本裂解液、正向引物、反向引物、野生型檢測探針、突變型檢測探針、內(nèi)標(biāo)上游引物、內(nèi)標(biāo)下游引物、內(nèi)標(biāo)探針、2*pcr反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照。

11、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種人ugt1a4*3基因多態(tài)性的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：將樣本裂解液、正向引物、反向引物、野生型檢測探針、突變型檢測探針、內(nèi)標(biāo)上游引物、內(nèi)標(biāo)下游引物、內(nèi)標(biāo)探針、2*pcr反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照分裝到合適的容器中。

12、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測人ugt1a4*3基因多態(tài)性的引物和探針組合物、pcr反應(yīng)液和試劑盒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為在制備檢測基因多態(tài)性的檢測試劑或在制備拉莫三嗪用藥指導(dǎo)的試劑中的應(yīng)用。

13、在一個(gè)實(shí)施例中，正向引物f優(yōu)選seq?id?no:2所示的核苷酸序列，反向引物r優(yōu)選seq?id?no:6所示的核苷酸序列，野生型檢測探針優(yōu)選seq?id?no:7所示的核苷酸序列，突變型檢測探針優(yōu)選seq?id?no:9所示的核苷酸序列。

14、在一個(gè)實(shí)施例中，內(nèi)標(biāo)探針的5’端連接熒光基團(tuán)rox，野生型檢測探針的5’端連接熒光基團(tuán)fam，突變型檢測探針的5’端連接熒光基團(tuán)vic。內(nèi)標(biāo)探針的3’端連接淬滅基團(tuán)bhq2；野生型檢測探針和突變型檢測探針的3’端連接淬滅基團(tuán)nfq，探針的3’端加入一個(gè)能插入dna小溝的小溝結(jié)合物(mgb)。

15、在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒中正向引物f、反向引物r、野生型檢測探針和突變型探針的比例優(yōu)選f:r:fam:vic＝(0.8):(0.8):(0.125):(0.25)。試劑盒中的防污染系統(tǒng)為37℃非熱敏udg酶和dutp。pcr反應(yīng)液中dntp的濃度為0.3mm，mgcl2的濃度3mm。pcr反應(yīng)液還含有5％glycerol、4％dmso、2％formamide和0.3％triton?100。

16、在一個(gè)實(shí)施例中，陽性對照包括陽性對照w(ugt1a4*1野生型質(zhì)粒)、陽性對照m(ugt1a4*3突變型質(zhì)粒)。ugt1a4*1野生型質(zhì)粒為seq?id?no:14所示的核苷酸序列，ugt1a4*3突變型質(zhì)粒為seq?id?no:15所示的核苷酸序列。陰性對照為不含核酸的樣本裂解液。

17、在一個(gè)實(shí)施例中，試劑盒中樣本裂解液的使用方法為：在樣本中添加樣本裂解液，混合均勻后瞬離，置95℃加熱5min，等待冷卻至室溫12000rpm離心2min，上清即可作為上樣溶液。

18、(三)有益效果

19、本發(fā)明提供了人ugt1a4基因多態(tài)性檢測試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，具備以下有益效果：

20、1.ugt1a家族基因同源性高度相似，ugt1a4*3多態(tài)性位點(diǎn)野生型和突變型分別設(shè)計(jì)高特異性探針，3’末端倒數(shù)第二或第三位單堿基、末端連續(xù)堿基與同源性序列存在差異點(diǎn)的特殊引物，能夠?qū)gt1a4*3位點(diǎn)的三種基因型明確區(qū)分，大大提高了檢測試劑的準(zhǔn)確度和特異性均能達(dá)到100％。

21、2.樣本前處理操作簡便快捷，僅需95℃加熱5min，4000rpm或12000rpm離心2min即可用于后面擴(kuò)增基因檢測分型。不需要對樣本進(jìn)行柱式或磁珠法提取核酸，精減樣本前處理復(fù)雜的操作過程、降低由長時(shí)間開管造成交叉污染幾率、縮短檢測時(shí)間同時(shí)也節(jié)約樣本處理的經(jīng)濟(jì)成本。

22、3.由于檢測試劑的高特異性高靈敏度和樣本處理試劑釋放細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)，最低檢出限lod值極低。無論正常血液樣本白細(xì)胞10^9稀釋1000倍后再進(jìn)行樣本處理，還是血液樣本經(jīng)處理后含核酸的上樣溶液稀釋500倍，基因分型檢測仍然能夠精準(zhǔn)檢出，靈敏度能夠達(dá)到10pg/μl。