本發(fā)明涉及一種靶向病原卵菌保守關(guān)鍵膜蛋白的多肽配體sr-22及其應(yīng)用，屬于農(nóng)學(xué)植物保護(hù)學(xué)科中的作物病害防控領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、卵菌(oomycetes)隸屬于色菌界(chromista)卵菌門(oomycota)卵菌綱(oomycetes)，是一類形態(tài)類似真菌(單倍體)、但親緣關(guān)系更靠近硅藻和褐藻的二倍體真核微生物。卵菌綱目前下轄15個(gè)目、24個(gè)科、近100個(gè)屬、約1500個(gè)種，數(shù)量眾多，大部分都是寄主范圍廣、危害性強(qiáng)的植物病原菌，危害糧食、蔬菜、花卉、果樹等重要作物。例如，疫霉屬(phytophthora)的致病疫霉、大豆疫霉、辣椒疫霉、樟疫霉等，可引起馬鈴薯、大豆、瓜果蔬菜、樹木等的腐爛和果實(shí)脫落等疫病，每年全世界由于作物疫病造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失高達(dá)數(shù)萬億美元；腐霉屬(pythium)的瓜果腐霉、終極腐霉、鐘器腐霉等攻擊作物根部，造成作物死亡；霜疫霉屬(peronophythora)的荔枝霜疫霉靠氣傳危害荔枝，造成花腐、果腐，這些病原卵菌都給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。目前，我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)飛速發(fā)展，種植結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)型升級(jí)，卵菌病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)面臨的重大挑戰(zhàn)。

2、卵菌可經(jīng)土壤、雨水、氣流等多種途徑傳播，具有潛伏期短、擴(kuò)散速度快、侵染力強(qiáng)、多部位危害等特點(diǎn)。病原菌侵入寄主后，很快就能形成大量的游動(dòng)孢子囊并釋放游動(dòng)孢子，形成再侵染源，導(dǎo)致病害迅速擴(kuò)散，防控十分困難。目前，針對(duì)卵菌病害的化學(xué)防治和農(nóng)業(yè)防治的效果都不理想，一方面是因?yàn)槁丫厥獾膫鞑ズ颓秩緸楹μ攸c(diǎn)，二是針對(duì)卵菌的殺菌劑種類少，三是卵菌在田間變異快、遺傳多樣性高，容易導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性和品種“抗性喪失”等問題。而且，單一化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致出現(xiàn)“3r”問題。這些問題不利于我國當(dāng)前農(nóng)藥“雙減”政策的落實(shí)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，探索新型、高效、綠色的卵菌病害防治方法尤為重要。

3、研究已發(fā)現(xiàn)，卵菌與真菌在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、遺傳學(xué)、生理生化、侵染致病等方面存在明顯差異。因此，挖掘出卵菌生長發(fā)育和致病過程中的關(guān)鍵蛋白，可作為病害防控藥劑的新靶點(diǎn)，用于新藥物的研發(fā)。

4、多肽配體是一種篩選自人工合成的隨機(jī)氨基酸文庫、高特異性高親和力結(jié)合靶標(biāo)蛋白質(zhì)的短肽(亦稱多肽、小肽)，通過干擾和破壞靶標(biāo)蛋白質(zhì)的功能以實(shí)現(xiàn)特定作用。自1990年問世以來，多肽配體作為靶向藥物已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床基礎(chǔ)研究、藥物設(shè)計(jì)、疾病靶向治療等方面，多肽藥物市場前景廣闊。近年來，隨著該技術(shù)的發(fā)展，多肽配體在作物病害防控中的應(yīng)用潛力逐漸得到重視，但是全球尚無防控作物卵菌病害的多肽靶向藥物面世，我國也無研發(fā)的多肽靶向藥物獲得登記和報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種靶向病原卵菌保守關(guān)鍵膜蛋白的多肽配體sr-22及其應(yīng)用，該多肽配體可顯著抑制作物卵菌病害的發(fā)生。

2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種靶向病原卵菌保守關(guān)鍵膜蛋白的多肽配體sr-22，其氨基酸序列為sritrllrgsgsgssritrllr。

3、本發(fā)明還提供了獲得所述多肽配體sr-22的方法，包括以下步驟：

4、1、卵菌保守蛋白的篩選

5、下載7種卵菌(phytophthora?sojae、phytophthora?ramorum、phytophthorainfestans、phytophthora?capsici、pythium?ultimum、pythium?aphanidermatum、hyaloperonospora?arabidopsidis)的蛋白序列，利用生物信息學(xué)手段比較7種卵菌與植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲的全基因組序列，篩選出卵菌特有并高度保守的蛋白pcmem1，預(yù)測(cè)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

6、2、pcmem1的功能分析

7、將辣椒疫霉(phytophthora?capsici)的pcmem1基因全長正向克隆于載體pgfpn，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其轉(zhuǎn)入辣椒疫霉菌株中，獲得pcmem1過表達(dá)轉(zhuǎn)化子。觀察過表達(dá)轉(zhuǎn)化子生長發(fā)育階段(菌絲、游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子)的形態(tài)特征和致病力變化。

8、同時(shí)，將pcmem1基因在本氏煙葉片中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，觀察葉片表型。

9、3、靶向多肽的篩選鑒定

10、將隨機(jī)組成的寡核苷酸片段組裝在pgadt7衍生質(zhì)粒plib2中，然后在大腸桿菌中擴(kuò)增，獲得多肽配體文庫；將膜蛋白pcmem1的編碼基因克隆于pgbkt7作為誘餌，通過酵母雙雜交篩選多肽文庫；從陽性菌落中提取質(zhì)粒dna并測(cè)序，獲得多肽序列；將多肽質(zhì)粒與誘餌蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化進(jìn)酵母中，進(jìn)行酵母雙雜交再驗(yàn)證。

11、本發(fā)明還提供一種含有所述多肽配體sr-22的試劑或藥物。

12、本發(fā)明還提供所述多肽配體sr-22或所述試劑或藥物在抑制卵菌生長中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明還提供所述多肽配體sr-22或所述試劑或藥物在防控作物卵菌病害中的應(yīng)用。

14、其中，所述卵菌為以保守關(guān)鍵膜蛋白pcmem1為生長發(fā)育和侵染致病的關(guān)鍵因子的卵菌。

15、其中，所述卵菌包括疫霉屬(phytophthora)、霜疫霉屬(peronophythora)、植物腐霉屬(phytopythium)或腐霉屬(pythium)的菌。

16、其中，所述卵菌包括辣椒疫霉(phytophthora?capsici)、致病疫霉(phytophthorainfestans)、大豆疫霉(phytophthora?sojae)、惡疫霉(phytophthora?cactorum)、荔枝霜疫霉(peronophythora?litchii)、旋柄植物腐霉(phytopythium?helicoides)、瓜果腐霉(pythium?aphanidermatum)、鐘器腐霉(pythium?vexans)或終極腐霉(pythium?ultimum)。

17、其中，所述多肽配體sr-22的有效抑制中濃度為0.0003～0.3517mm。

18、其中，所述作物包括馬鈴薯、辣椒或荔枝。

19、本發(fā)明還提供了所述多肽配體sr-22的平板抑菌試驗(yàn)：在黑麥v8固體培養(yǎng)基或pda培養(yǎng)基中添加多肽sr-22，制得多肽濃度分別為200、300、500μm的含藥平板。接種九種不同營養(yǎng)類型的植物病原卵菌(辣椒疫霉(phytophthora?capsici)、致病疫霉(phytophthorainfestans)、大豆疫霉(phytophthora?sojae)、惡疫霉(phytophthora?cactorum)、荔枝霜疫霉(peronophythora?litchii)、旋柄植物腐霉(phytopythium?helicoides)、終極腐霉(pythium?ultimum)、鐘器腐霉(pythium?vexans)、瓜果腐霉(pythium?aphanidermatum))，測(cè)定sr-22對(duì)它們生長的抑制作用。

20、本發(fā)明還提供了植物葉片噴施試驗(yàn)：選用溫室盆栽的馬鈴薯(solanumtuberosum)品種désirée，在葉面噴施500μm的sr-22多肽溶液，12h后接種致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液，測(cè)定sr-22對(duì)馬鈴薯晚疫病的防控效果。

21、本發(fā)明還提供了植株灌根試驗(yàn)：選用辣椒(capsicum?annuum)品種“韓育特大牛角椒”。在溫室盆栽辣椒幼苗的根部灌溉500μm多肽溶液，8h后再灌根接種辣椒疫霉游動(dòng)孢子懸浮液，測(cè)定sr-22防控辣椒根部疫病的效果。

22、本發(fā)明還提供了果實(shí)浸潤試驗(yàn)：選用荔枝(litchi?chinensis)品種“桂味”果實(shí)。用500μm的sr-22多肽溶液充分浸潤荔枝果實(shí)，2.5h后接種荔枝霜疫霉，測(cè)定sr-22防控荔枝霜疫病的效果。

23、本發(fā)明還提供了多肽抑菌特異性分析：選用非靶標(biāo)真菌—稻瘟病菌(magnaporthegrisea)和非靶標(biāo)細(xì)菌—大腸桿菌(escherichia?coli)dh5α菌株。往它們的培養(yǎng)基中添加sr-22，使終濃度分別為200、300、500μm，接種真菌或細(xì)菌。測(cè)算稻瘟病菌的菌落生長抑制率，每隔1小時(shí)測(cè)定大腸桿菌的吸光值od600，分析多肽對(duì)非靶標(biāo)微生物(真菌和細(xì)菌)的生長是否具有抑制作用。

24、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明針對(duì)一個(gè)參與卵菌生長發(fā)育和致病的保守關(guān)鍵膜蛋白pcmem1，利用生物技術(shù)手段首次開發(fā)出一個(gè)靶向螯合它的多肽配體sr-22；2、該多肽配體sr-22顯著抑制卵菌生長，但不抑制非靶標(biāo)的真菌和細(xì)菌生長，具有良好的特異性；3、該多肽配體sr-22具有良好的抑菌抗病效果，有望作為一種新型、安全、環(huán)保的多肽農(nóng)藥應(yīng)用于作物卵菌病害的綠色防控。