本發(fā)明涉及細胞生物學，特別涉及一種椎間盤突出后自吸收細胞模型及其構建方法和應用。

背景技術：

1、腰椎間盤突出癥是一種脊柱退行性病變，是導致成年人勞動力喪失的最主要原因之一，具有高發(fā)病率和高致殘率的特征，給患者和社會造成了巨大的負擔。椎間盤外層是很多層呈同心圓排列的膠原纖維構成的纖維環(huán)，鄰近上下椎體由一層軟骨終板連接，纖維環(huán)內包裹著含水量較高、富含蛋白聚糖的髓核組織，這種結構賦予了椎間盤具有優(yōu)良的力學性能以負載重力負荷。當椎間盤出現(xiàn)退行性改變時，首先是髓核組織含水量和蛋白聚糖成分下降，導致力學性能下降，進而使得纖維環(huán)組織承受過高的重力負荷，其結果是外部的纖維環(huán)撕裂和破裂，內部的髓核組織向外突出，成為壓迫神經(jīng)的原因。

2、當前大量的治療技術，包括各種微創(chuàng)技術、融合技術、動態(tài)技術、消融技術等治療策略被用來治療癥狀嚴重的腰椎間盤突出癥，但均是有創(chuàng)的操作，是一種對癥治療策略，會給患者造成新的創(chuàng)傷，同時在一定程度上可能影響患者的運動功能和生活質量。相比較保守治療的患者而言，手術治療只是快速地緩解了患者的癥狀，但是與保守治療、臥床休息相比較而言，手術對于緩解疼痛等也無顯著的優(yōu)勢。手術的大量開展，導致響應的治療費用急劇升高，全球的相關費用高達數(shù)百億美元。而目前普遍采用的保守治療策略，包括牽引、按摩等物理治療以及服用消炎止痛藥、肌松藥等治療措施，雖然可以在一定程度上緩解患者的癥狀，但是這些治療并不能促使突出的間盤組織吸收，因而，對神經(jīng)的壓迫還是持續(xù)存在的。臨床中存在一種現(xiàn)象：在部分腰椎間盤突出的患者進行保守治療過程中會出現(xiàn)突出的椎間盤組織自吸收的現(xiàn)象，患者也因為間盤組織的吸收而癥狀得到部分或是完全的緩解，此現(xiàn)象被稱為椎間盤突出自吸收。導致此現(xiàn)象發(fā)生的具體機制尚不明朗，主要的假說有3種：一是，突出椎間盤自身的脫水收縮使其體積減??；二是，后縱韌帶的張力將突出的椎間盤回縮至椎間隙內；三是，炎癥反應及免疫細胞介導的酶解反應和吞噬作用使突出的椎間盤逐漸吸收。其中第三點假說受到最多的臨床現(xiàn)象和基礎研究證據(jù)支持，但當前尚無可用于椎間盤突出癥自吸收的細胞模型，因此，需要開發(fā)更多體外實驗用于椎間盤突出癥自吸收的機制和病理生理過程的研究。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是構建一種操作相對簡單、穩(wěn)定性和可重復性高的腰椎間盤突出自吸收細胞模型，以期準確模擬出腰椎間盤突出自吸收的病理、生理特點，并對椎間盤突出后自吸收的效果進行評價。

2、本發(fā)明椎間盤突出后自吸收模型的建立方法，包括以下步驟：

3、1)制備椎間盤突出自吸收細胞模型，觀察椎間盤突出環(huán)境中髓核細胞生長及細胞外基質改變情況；

4、2)制備椎間盤突出后自吸收細胞-組織模型，通過巨噬細胞-破骨細胞與髓核組織共培養(yǎng)觀察自吸收情況，并對培養(yǎng)體系的相關蛋白及及基因的表達情況進行檢測。

5、步驟1)中，所述髓核細胞按照如下方法制備：取椎間盤髓核組織，修剪成約1mm?x1mm大小，消化液消化4小時，過濾并收集消化液；在4℃條件下離心濾液，棄上清液得到細胞沉淀，重懸后將細胞懸液接種入含10％fbs的dmem培養(yǎng)液中培養(yǎng)，即得髓核細胞。所述消化液是ii型膠原酶溶液，其中ii型膠原酶濃度為0.002g/ml。

6、步驟1)中髓核細胞炎癥環(huán)境采用脂多糖(lps)刺激誘導，具體方法為：將髓核細胞放入12孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至80％密度時，將每孔中原培養(yǎng)液替換為2ml含lps的培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為24小時。所述lps濃度為1μg/ml。

7、步驟1)中炎癥環(huán)境對髓核細胞生長情況通過edu細胞增殖實驗觀察細胞增殖情況。

8、步驟1)中炎癥環(huán)境對髓核細胞的毒性通過活/死細胞染色實驗觀察。

9、步驟1)中髓核細胞外基質通過阿利新藍染色和免疫熒光染色觀察。

10、步驟2)中所述巨噬細胞-破骨細胞培養(yǎng)體系按照如下方法制備：將raw?264.7巨噬細胞按照80％密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，將每孔中原培養(yǎng)液替換為2ml含核因子κb受體活化因子配體(rankl)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為5天，期間每隔一天更換含rankl的培養(yǎng)液。所述rankl濃度為50ng/ml。

11、步驟2)中接種的髓核組織為腰椎間盤突出癥患者手術治療中摘除的髓核組織。接種大小約為0.5cm×0.5cm大小左右。

12、步驟2)中接種髓核組織后，將培養(yǎng)體系置于活細胞工作站中實時觀察48小時。

13、步驟2)中相關蛋白和基因表達情況的檢測采用蛋白印跡法(wb)和實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式擴增(rt-qpcr)技術。所述相關蛋白為酒石酸酸性磷酸酶(trap)、組織蛋白酶k(ctsk)、金屬蛋白酶9(mmp9)。

14、本發(fā)明提供了前述方法建立的椎間盤突出后自吸收細胞模型。

15、本發(fā)明還提供了前述椎間盤突出后自吸收效果的評價方法。

16、本發(fā)明還提供了一種篩選促進椎間盤突出后自吸收藥物的方法，包括如下步驟：

17、a、按照前述的方法建立椎間盤突出后自吸收細胞模型；

18、b、將候選藥物施用于a步驟所述的椎間盤突出后自吸收細胞模型；

19、c、通過評價椎間盤突出后自吸收效果來篩選潛在的藥物。

20、本發(fā)明的有益效果在于：

21、本發(fā)明通過建立基于椎間盤突出實驗整合測試體系提供整合檢測策略，研發(fā)炎癥環(huán)境下的用于椎間盤突出自吸收功效檢測的椎間盤突出自吸收細胞模型。應用已經(jīng)構建的椎間盤模型建立一個規(guī)范化、安全、高效的體外椎間盤突出自吸收藥物評價體系，作為代替?zhèn)鹘y(tǒng)動物實驗的方法之一，對單個藥物的安全性及功效性的體外評價方法，驗證其實驗穩(wěn)定性、可重復性，以及作為替代方法的安全性，為腰椎間盤突出癥自吸收的研究提供重要的參考，為藥物誘導腰椎間盤自吸收能力提供預測和評估。

22、腰椎間盤突出癥自吸收是一種較為少見的臨床現(xiàn)象，現(xiàn)有研究表明，其在發(fā)生時會伴有炎癥反應，新生血管的浸潤等。自吸收現(xiàn)象在臨床的少見性也促進了對其機制研究的探索，體外構建的腰椎間盤突出自吸收細胞模型具有極高的應用價值。

23、本發(fā)明可以有效建立椎間盤突出后自吸收細胞模型，而且制備方法簡便可以用于誘導椎間盤突出自吸收藥物的篩選，具有良好的應用前景。

技術特征：

1.一種椎間盤突出后自吸收細胞模型的構建方法，其包括：

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟1)中還包括采用脂多糖(lps)刺激誘導髓核細胞炎癥環(huán)境，優(yōu)選地，所述髓核細胞炎癥環(huán)境是通過包括下述步驟的方法實現(xiàn)的：將髓核細胞放入12孔板中培養(yǎng)，待細胞生長至80％密度時，將每孔中原培養(yǎng)液替換為2ml含lps的培養(yǎng)液，培養(yǎng)時間為24小時；所述lps濃度為1μg/ml。

3.如權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟1)還包括檢測細胞增殖情況、炎癥環(huán)境對髓核細胞的毒性檢測、和/或髓核細胞外基質狀態(tài)檢測；

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，

5.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中接種的髓核組織為腰椎間盤突出癥患者手術治療中摘除的髓核組織，接種大小約為0.5cm×0.5cm。

6.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中接種髓核組織后，將培養(yǎng)體系置于活細胞工作站中實時觀察48小時。

7.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，步驟2)中相關蛋白和基因表達情況的檢測是通過蛋白印跡法(wb)和/或實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式擴增(rt-qpcr)實現(xiàn)的；優(yōu)選地，所述相關蛋白為酒石酸酸性磷酸酶(trap)、組織蛋白酶k(ctsk)、金屬蛋白酶9(mmp9)。

8.根據(jù)權利要求1-7中任一項所述的構建方法構建得到的椎間盤突出自吸收細胞模型。

9.如權利要求8所述的椎間盤突出自吸收細胞模型在篩選用于促進椎間盤突出自吸收的藥物中的應用。

10.一種篩選用于促進椎間盤突出后自吸收藥物的方法，包括：

技術總結
本發(fā)明提供了一種操作相對簡單、穩(wěn)定性和可重復性高的腰椎間盤突出自吸收細胞模型及其構建方法，并且提供了其在篩選用于促進椎間盤突出自吸收的藥物中的應用。本發(fā)明提供的構建椎間盤突出后自吸收細胞模型制備方法簡便可以用于誘導椎間盤突出自吸收藥物的篩選，應用前景優(yōu)良。

技術研發(fā)人員：侯天勇,楊明,楊凡,蔡娟,賀思豪,周江玲,于博,唐貞珍,楊錢冬
受保護的技術使用者：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19