本發(fā)明涉及一種新7β-羥基類固醇脫氫酶基因及其在制備熊去氧膽酸中的應(yīng)用，屬于基因工程與生物催化領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、熊去氧膽酸(udca)作為美國食品和藥物管理局(fda)批準(zhǔn)的用于治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的唯一藥物，具有溶解膽結(jié)石，治療膽汁淤積、膽源性胰腺炎、原發(fā)性膽管炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、藥物性肝炎和改善肝移植效果的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，熊去氧膽酸還介導(dǎo)并影響癌癥基因組中致癌信號通路調(diào)控，用于癌癥治療。在治療進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病時，熊去氧膽酸能夠改善受損線粒體功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

2、目前，熊去氧膽酸的制備方法主要包括是化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法。其中通過化學(xué)合成的熊去氧膽酸僅占總合成路線的30％，還遠(yuǎn)不能滿足市場對熊去氧膽酸的用量及質(zhì)量的需求。另外化學(xué)合成熊去氧膽酸過程復(fù)雜，且涉及有毒物質(zhì)的使用和高溫高壓條件，在生產(chǎn)安全和環(huán)境保護(hù)方面具有危害，所以新的研究集中在以鵝去氧膽酸(cdca)為前體，以微生物轉(zhuǎn)化或生物酶催化的方式獲得熊去氧膽酸。

3、微生物全細(xì)胞催化法和酶催化法綠色環(huán)保，順應(yīng)當(dāng)今社會發(fā)展和保護(hù)環(huán)境的大趨勢，是今后的研究熱點。酶催化法主要利用不同來源的7α-hsdh和7β-hsdh這兩種酶通過兩步酶促反應(yīng)將鵝去氧膽酸轉(zhuǎn)化為熊去氧膽酸，然而兩步酶促反應(yīng)需要添加昂貴的輔因子nad(p)+，增加了合成的成本。而近年來，利用常見的微生物全細(xì)胞催化法合成化學(xué)產(chǎn)品已經(jīng)取得了不錯的進(jìn)展，因為它不僅轉(zhuǎn)化效率高、特異性好，還可以利用微生物自身的輔酶再生系統(tǒng)，而且避免了純化蛋白的步驟，對于研究全細(xì)胞催化合熊去氧膽酸對于實驗階段性研究和工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。另外，7β-hsdh種類少、活性低及穩(wěn)定性差等因素也是目前酶法合成的瓶頸。因此，高催化活性和高轉(zhuǎn)換率的7β-hsdh的篩選及催化工藝的優(yōu)化對于熊去氧膽酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一個新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，可與7α-羥基類固醇脫氫酶基因利用大腸桿菌和畢赤酵母作為底盤細(xì)胞進(jìn)行異源表達(dá)，從而得到不同轉(zhuǎn)化熊去氧膽酸的重組菌株。

2、為了解決7β-羥基類固醇脫氫酶的低催化活性、低轉(zhuǎn)化率和催化工藝不成熟的問題，本發(fā)明通過比對檢索ncbi數(shù)據(jù)庫，篩選出了一種源自無害梭菌(clostridiuminnocuum)的7β-羥基類固醇脫氫酶，在參與熊去氧膽酸的催化生產(chǎn)工藝方面有著更好的催化潛力，為全細(xì)胞催化生產(chǎn)熊去氧膽酸的工藝提供了一種新的選擇方向，同時選擇不同的底盤細(xì)胞作為高效生產(chǎn)熊去氧膽酸的平臺。

3、本發(fā)明提供了一種催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)載體以大腸桿菌的petduet-1雙啟動子質(zhì)粒以及畢赤酵母的ppic3.5k和ppiczx為基礎(chǔ)載體，連接有e7α-hsdh和cin7β-hsdh兩個脫氫酶基因。

4、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

5、pcr分別擴增e7αhsdh和cin7β-hsdh基因，將雙啟動子載體進(jìn)行酶切，分別取2μl酶切產(chǎn)物、2μl?pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證其條帶大小。pcr產(chǎn)物經(jīng)消化、純化后，目的片段與骨架進(jìn)行同源重組，重組體系化轉(zhuǎn)大腸桿菌jm109感受態(tài)，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，測序驗證正確，即得到重組質(zhì)粒。其它重組質(zhì)粒均由以上述方法進(jìn)行構(gòu)建。

6、本發(fā)明還提供了一種催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組工程菌株，所述重組工程菌株通過重組表達(dá)質(zhì)粒分別通過化轉(zhuǎn)入大腸桿菌及電轉(zhuǎn)整合畢赤酵母而得到。

7、本發(fā)明還提供了一種全細(xì)胞催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的方法，包括以下步驟：

8、將所述重組大腸桿菌接種到tb液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)菌體濃度od600達(dá)到0.8時，添加2mm的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度為25℃，繼續(xù)發(fā)酵18h，之后投入6g/l鵝去氧膽酸作為底物繼續(xù)發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到熊去氧膽酸。

9、將所述重組畢赤酵母接種到y(tǒng)pg液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將適量菌液轉(zhuǎn)接于bmgy繼續(xù)培養(yǎng)，使得菌液密度值達(dá)到7-8時進(jìn)行收集菌體，棄上清、取沉淀。將其菌泥轉(zhuǎn)移至bmmy培養(yǎng)基中，將發(fā)酵培養(yǎng)液與底物鵝去氧膽酸和誘導(dǎo)劑甲醇混合；鵝去氧膽酸的投加量為6g/l，甲醇投加的體積百分含量為3.3％；所述發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的條件為28～30℃進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，得到熊去氧膽酸。

10、最后利用乙酸乙酯從發(fā)酵液中萃取發(fā)酵產(chǎn)物，通過tlc和hplc分析發(fā)酵產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化情況。

11、利用本發(fā)明篩選獲得的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因及全細(xì)胞催化法在重組大腸桿菌和畢赤酵母中高效表達(dá)后可生產(chǎn)熊去氧膽酸。在投料量6g/l的情況下，重組大腸桿菌反應(yīng)催化24h，轉(zhuǎn)化率為87.6％，畢赤酵母轉(zhuǎn)化率可以高達(dá)97.8％。

12、通過對數(shù)據(jù)庫的挖掘與分析，本發(fā)明提供了一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因及其應(yīng)用，可促進(jìn)其在醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用；此外，本發(fā)明發(fā)酵使用的培養(yǎng)基簡單，無需添加昂貴的輔因子，經(jīng)濟成本低，對今后的工業(yè)應(yīng)用具有非常大的借鑒意義。

技術(shù)特征：

1.一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，所述7β-羥基類固醇脫氫酶基因核苷酸序列如seq?id?no.1所示，構(gòu)建了能夠高效制備熊去氧膽酸的重組菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于：同時表達(dá)7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶，并構(gòu)建了高效轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組大腸桿菌bl21(de3)和重組畢赤酵母gs115。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，高效轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組大腸桿菌bl21包括下列步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，高效轉(zhuǎn)化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組畢赤酵母gs115包括下列步驟：

5.一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于，將該新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因在制備熊去氧膽酸中的應(yīng)用，包括下列步驟：

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用得到的熊去氧膽酸。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種新型7β?羥基類固醇脫氫酶基因及其應(yīng)用，屬于酶工程和生物催化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從數(shù)據(jù)庫中挖掘出一種具有高轉(zhuǎn)化率的7β?羥基類固醇脫氫酶基因，與7α?羥基類固醇脫氫酶基因，在不同底盤細(xì)胞中異源表達(dá)，并構(gòu)建了高效制備熊去氧膽酸的重組菌。本發(fā)明將構(gòu)建的重組菌用于全細(xì)胞催化鵝去氧膽酸生產(chǎn)熊去氧膽酸，投料量為6g/L，催化反應(yīng)時間為24h，重組大腸桿菌、畢赤酵母的轉(zhuǎn)化率分別為87.6％和97.8％。

技術(shù)研發(fā)人員：何希宏,楊梅,劉曉光,陳天紅,管位山,趙化冰,金鵬,王碩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19