本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體本發(fā)明涉及一種廣譜抑制流感病毒的多肽及其在預(yù)防和/或治療流感病毒感染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，傳播速度快，遺傳變異性強(qiáng)。流感的防治是當(dāng)前醫(yī)學(xué)及藥學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。治療流感的藥物研究和發(fā)明具有重要的潛在應(yīng)用價值。

2、流感是人、禽、畜共患病，抗流感藥物的研發(fā)是我國藥物研發(fā)的重點。

3、流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)內(nèi)部蛋白抗原性的不同，分為甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，三種類型沒有共同的抗原。甲型流感病毒是感染人、禽和其他動物的主要流感病毒亞型，其基因組為8條節(jié)段式單鏈負(fù)鏈rna，其中包膜蛋白包括血凝素(hemagglutinin,ha)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,na)和m2離子通道蛋白。根據(jù)表面結(jié)構(gòu)蛋白ha和na的抗原性不同，又將甲型流感病毒分為不同血清亞型，ha包括h1～h18共18種亞型，na包括ni～n10共10種亞型，故理論上共有180種亞型組合。禽類是流感病毒的天然宿主，不是所有亞型都能感染人類，目前發(fā)現(xiàn)h1n1、h2n2和h3n2亞型以人類為宿主，但高致病的h5n1、h7n7、h9n2、h7n2和h7n3等亞型也已出現(xiàn)感染人的病例。高致病流感病毒是主要由野生禽類傳播的惡性流感，在人際間進(jìn)行傳播并造成新一輪的世界大流行的可能性使得世界各國對高致病流感病毒實時嚴(yán)格監(jiān)控。

4、流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是其感染機(jī)體的第一步。流感病毒通過其包膜表面的血凝素蛋白(hemagglutinin,ha)與宿主細(xì)胞表面的唾液酸(sialic?acid,sa)受體進(jìn)行相互識別并結(jié)合，從而完成病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的過程。流感病毒的血凝素蛋白(ha)由兩個亞基組成，ha1和ha0。其中，ha1亞基負(fù)責(zé)病毒與宿主唾液酸受體的識別結(jié)合作用，ha1亞基的110位-261位殘基受體結(jié)合區(qū)域，包含三個二級結(jié)構(gòu)元件：130-1oop區(qū)(134-138位殘基)、190-helix區(qū)(188-198位殘基)和220-1oop區(qū)(221-228位殘基)，是主要受體結(jié)合域。當(dāng)ha1亞基與唾液酸受體結(jié)合后，會觸發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，整個病毒顆粒和細(xì)胞膜形成內(nèi)含體內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞漿，在內(nèi)含體中，ha2亞基發(fā)揮ph依賴的病毒膜與內(nèi)含體膜的融合作用，釋放病毒的遺傳物質(zhì)至細(xì)胞漿中，完成病毒的進(jìn)入過程。目前沒有以流感病毒進(jìn)入環(huán)節(jié)靶位的抗流感藥物問世。

5、在流感的預(yù)防方面，季節(jié)性流感的預(yù)防主要依靠疫苗接種，但由于流感病毒表面抗原血清學(xué)亞型眾多，常常使得流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，無法提供有效保護(hù)；流感病毒具有變異性強(qiáng)的特點，疫苗研發(fā)制備速度落后于病毒變異速度，新型株系病毒出現(xiàn)后，對應(yīng)疫苗的制備至少需要6個月的時間，使得對于流感的預(yù)防處于被動狀態(tài)。而且，流感疫苗的保護(hù)期僅有半年到一年，需要每年接種注射，給人們的生活造成不便。

6、高致病流感不同于季節(jié)性流感，由于病毒惡性程度過強(qiáng)，目前沒有可用的人用疫苗，并且為避免宿主選擇性壓力導(dǎo)致的快速病毒抗原變異，多數(shù)國家采取禁止或不提倡使用該疫苗的政策。

7、日前臨床應(yīng)用的抗流感藥物，按作用機(jī)理主要分為三類：m2離子通道阻滯劑，神經(jīng)氨酸酶(na)抑制劑和rna酶抑制劑。m2離子通道阻滯劑，以金剛烷胺和金剛乙胺為代表；另一類是抑制流感病毒釋出的神經(jīng)氨酸酶抑制劑，奧司他韋和扎納米韋；還有一類rna酶抑制劑，如法匹拉韋主要用于治療流感病毒耐藥株的感染。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，目前所有已上市的抗流感藥物均出現(xiàn)了耐藥病毒株，由于耐藥性過于嚴(yán)重，美國疾病控制與預(yù)防中心已建議金剛烷胺、金剛乙胺類藥物不作為臨床治療使用。目前耐藥程度最輕的扎納米韋應(yīng)用流感病毒敏感株mdck細(xì)胞的體外實驗數(shù)據(jù)顯示：扎納米韋對h5n1、h6n1、h9n2三種亞型病毒的半數(shù)抑制濃度(ic50)為8.5-14.0μm。

8、利用生物技術(shù)研發(fā)的抗流感藥物，例如寡核苷酸、唾液酸酶融合蛋白(das181)、多肽(成纖維細(xì)胞生長因子4的信號序列衍生肽eb)等，在實驗室研究中顯示了不同程度的抗流感活性，但目前還沒有商品化的藥物問世。上述表明，目前已上市的抗流感病毒藥物數(shù)量少，且都出現(xiàn)了耐藥株，對于致死率高的流感病毒，如高致病h5n1流感病毒，尚未有特效疫苗和藥物。

9、多肽是以氨基酸為基本單位組成的分子，其主要特點是選擇性高、作用濃度低。與抗體或其他治療性蛋白相比，多肽有相似的作用模式，但多肽的免疫原性更低。與小分子藥物相比，多肽的分子量較大，可以更有效地抑制蛋白與蛋白相互作用，選擇性和特異性更高，作用濃度及副作用更低。當(dāng)前，小分子藥物研發(fā)日趨困難，新興的抗體等大分子藥物研發(fā)周期長，需要重新審視并重視多肽藥物。

10、流感病毒的血凝素ha以三聚體的形式存在于病毒包膜上，即ha纖突由三個ha單體分子組成，每個單體ha分子由ha1和ha2兩個亞基組成，球狀頭部由ha1組成，含有受體結(jié)合位點和抗原決定簇，桿狀柄部由ha2和部分ha1組成，與病毒包膜相連。ha1亞基與ha2亞基之間依靠二硫鍵連接，以高致病h5n1株系例，ha1亞基長度為345個氨基酸殘基，ha2亞基長度為225個氨基酸殘基，不同流感病毒ha蛋白長度略有差異。雖然流感病毒株系眾多，但ha2部分都是高度保守的。在功能上，hai亞基負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體識別并結(jié)合，使病毒駐留并吸附在宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用。當(dāng)整個病毒顆粒被內(nèi)吞入細(xì)胞的內(nèi)含體中之后，在內(nèi)含體的酸性環(huán)境中，ha2亞基發(fā)生變構(gòu)，其疏水性融合肽釋放并插入到細(xì)胞的內(nèi)含體膜中，將內(nèi)含體膜與病毒包膜拉近，并最終完成細(xì)胞內(nèi)含體膜與病毒包膜的融合，使得病毒基因組釋放到細(xì)胞漿中，完成病毒對宿主細(xì)胞的侵入。相對保守的ha2亞基的膜融合功能是通過高度保守區(qū)—七肽重復(fù)區(qū)(heptad?repeat,hr)完成的，該區(qū)域是抗病毒藥物研發(fā)的熱門靶標(biāo)。hr區(qū)在包膜病毒中普遍存在，如正粘病毒(如流感病毒等)、冠狀病毒(如sars病毒等)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如hiv病毒等)中都有hr域，且高度保守，均含有兩段稱為七肽重復(fù)(hr)序列，n端的七肽重復(fù)序列稱謂hr1，c端的七肽重復(fù)序列稱謂hr2，在膜融合過程中，hr2以反向平行方式附著到hr1形成的溝槽中，形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。對于高度保守的hr區(qū)，有很多包膜病毒藥物的研究報道，對hiv-1，sars冠狀病毒(sars-cov)，人呼吸道合胞病毒(hrsv)等病毒的研究表明，外源加入hr1或hr2多肽能抑制病毒感染，其作用機(jī)理為：外源多肽能阻礙病毒融合蛋白上的hr2與hr1之間的相互作用，進(jìn)而阻斷病毒膜融合蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，阻斷病毒包膜和細(xì)胞膜間的融合。其中，源于hiv-1融合蛋白gp41的hr2區(qū)的多肽恩夫韋地(t-20)，作為第一個hiv-1進(jìn)入抑制劑，已于2003年上市。中國專利(發(fā)明名稱：抑制流感病毒感染的方法及其藥物，授權(quán)公告號cn101186637b，申請日2007.12.18)中，發(fā)明主體也為來源于流感病毒的hr1和hr2區(qū)域的多肽。該專利涉及的hr1和hr2區(qū)域的多肽通過阻斷病毒hr1和hr2區(qū)之間的結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞內(nèi)含體膜的融合過程。與ha2高保守性相反，ha1保守性差，是流感病毒抗原變異的主要原因，因此對于針對ha1亞基研發(fā)抗流感藥物的策略往往不作為本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮的研發(fā)方向，本領(lǐng)域技術(shù)人員一般都以高保守的ha2為基礎(chǔ)，進(jìn)行抗流感病毒感染的研究。而流感病毒的復(fù)制階段開始于流感病毒基因組釋放進(jìn)入細(xì)胞核后。流感病毒的基因組是負(fù)鏈rna，因此，必須利用病毒自身的rna聚合酶對基因組先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。流感病毒聚合酶是由三個亞單位(pb1/pb2/pa)組成的三聚體，其可以作為目前研發(fā)抗病毒藥物的潛在靶點。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決流感病毒因耐藥性變異產(chǎn)生的預(yù)防及治療問題，一種廣譜抑制流感病毒的多肽及其在預(yù)防和/或治療流感病毒感染中的應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為

3、本發(fā)明通過篩選多肽庫的策略尋找雙功能的新型蛋白多肽類抗病毒融合抑制劑，在流感預(yù)防和治療領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)獨特功能的原創(chuàng)性突破，目前尚無類似的雙功能廣譜多肽類流感病毒融合抑制劑的報道。

4、一種廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：廣譜抑制流感病毒的多肽包括下述選擇：

5、(1).seq?id?no:1所示的氨基酸序列；

6、或，(2).具有與(1)所示氨基酸序列至少50％同源性的氨基酸序列；

7、或，(3).(1)、(2)所示氨基酸序列中任意位置進(jìn)行至少一個氨基酸殘基的替換和/或刪減和/或增加而獲得的氨基酸序列；

8、或，(4).(1)、(2)、(3)所示氨基酸序列進(jìn)行修飾所得氨基酸序列。

9、所述同源性優(yōu)選為50％、55％、61％、66％、72％、77％、83％、88％、94％同源性。

10、所述至少一個氨基酸殘基的替換和/或刪減和/或增加包括在肽或蛋白質(zhì)序列內(nèi)部的任意位置和序列兩端的增加和/或刪減。在變異的氨基酸殘基中，優(yōu)選突變?yōu)榕c原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸。側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別為親水性氨基酸(例如r、d、n、c、e、q、g、h、k、s、t)，疏水性氨基酸(例如a、i、l、m、f、p、w、y、v)，脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(例如g、a、v、l、i、p)，羥基側(cè)鏈的氨基酸(例如s、t、y)，含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(例如c、m)，含羧基和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(例如d、n、e、q)，含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(例如r、k、h)，含酸性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(例如e、d)，含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如h、f、y、w)。

11、所述修飾指在所述氨基酸序列上進(jìn)行常規(guī)修飾；或，連接有用于多肽或蛋白質(zhì)檢測或純化的標(biāo)簽。

12、所述常規(guī)修飾包括乙酰化、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇peg修飾、固定化修飾；所述的標(biāo)簽包括his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc、profinity?exact。

13、再進(jìn)一步的說，例如，對肽進(jìn)行化學(xué)修飾，如標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fitc)、生物素(biotin)、聚乙二醇修飾(peg)、固定化修飾等(包括但不限于此)；對肽進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)修飾，如乙?；?、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、引入非肽結(jié)構(gòu)等(包括但不限此)；或者在多肽或衍生物上連接有用于多肽或蛋白質(zhì)檢測和純化的標(biāo)簽，如組氨酸標(biāo)簽(his6)、谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)、n位點利用蛋白(nus)、血凝素標(biāo)簽蛋白(ha)、免疫球蛋白(igg)、flag標(biāo)簽蛋白、c-myc標(biāo)簽蛋白、profinity?exact融合標(biāo)簽蛋白等(包括但不限于此)。上述修飾手段均為多肽或蛋白質(zhì)的常規(guī)修飾方法，在機(jī)體內(nèi)可通過脫脂酶等方式降解。

14、所述廣譜抑制流感病毒的多肽為seq?id?no:1、seq?id?no:3-26所示的任意一個氨基酸所示序列。

15、所述多肽為上述任意一種所述多核苷酸序列，多核苷酸序列選自下列多核苷酸序列之一：

16、1)seq?id?no:1所示的氨基酸序列對應(yīng)的多核苷酸序列seq?id?no:2；

17、2).具有與1)所示多核苷酸序列至少50％同源性的多核苷酸序列；

18、3).(1)、(2)所示多核苷酸序列中任意位置進(jìn)行至少三個堿基的替換和/或刪減和/或增加而獲得的多核苷酸序列；

19、或，4).在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下，可與(1)、(2)、(3)所示多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列，及其至少50％同源性的多核苷酸序列。

20、一種克隆或表達(dá)載體，其包含所述多肽的多核苷酸。

21、一種宿主細(xì)胞，其包含所述的載體。

22、所述多肽的獲得方式，包括肽(或其衍生物)和/或多核苷酸表達(dá)或合成的多肽或蛋白質(zhì)，如人工合成或以重組蛋白方式純化而得的多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。所述多肽人工合成方式是生物合成領(lǐng)域技術(shù)人員所常規(guī)應(yīng)用的合成及修飾方法，所述的多肽或蛋白質(zhì)基因重組表達(dá)純化方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選擇的載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)化技術(shù)、表達(dá)純化技術(shù)，包括原核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)和真核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)。

23、所述載體可包括本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物病毒載體、動物病毒載體及其他各種病毒載體。本發(fā)明適用的載體包括但不限于：原核細(xì)胞載體(如細(xì)菌克隆/表達(dá)載體等)、酵母細(xì)胞載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、昆蟲細(xì)胞載體(如桿狀病毒載體等)、哺乳動物細(xì)胞載體(如腺病毒載體、痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體等)、植物病毒載體及在哺乳動物器官特異性表達(dá)載體如乳腺表達(dá)載體等，即在宿主細(xì)胞中可穩(wěn)定復(fù)制傳代的任何載體都可使用。優(yōu)選的表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等；酵母細(xì)胞的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因；酵母細(xì)胞的缺陷選擇標(biāo)記，如his、leu、trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及組氨酸標(biāo)簽基因、熒光蛋白標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用本領(lǐng)域已知的生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建本發(fā)明所述的多核苷酸序列、轉(zhuǎn)錄和翻譯序列、啟動子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染適合的宿主細(xì)胞或生物，以便獲得所需的目的蛋白或多肽。

24、所述含有上述載體的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了含本發(fā)明所述的編碼能抑制流感病毒感染的多肽和蛋白的多核苷酸序列后，可用于生產(chǎn)所需蛋白或多肽，或?qū)⑵渲苯佑糜诳沽鞲胁《绢A(yù)防/治療給藥。本領(lǐng)域技術(shù)人員可恰當(dāng)選擇合適的載體、宿主細(xì)胞，并熟知載體高效轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的方法，所用方法包括但不限于，氯化鈣法、氯化銫法、電穿孔法等用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法和原生質(zhì)體融合法等用于酵母細(xì)胞，脂質(zhì)體法、磷酸鈣共沉淀法、電融合法、顯微注射法等用于哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等真核細(xì)胞的方法。

25、一種藥物組合物，以單獨或聯(lián)合的方式包含治療有效量的所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、和/或所述的載體、和/或所述的宿主細(xì)胞作為有效成分。

26、上述藥物組合物可以制成注射液、片劑或噴霧劑，藥物可依照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。需要時，還可在上述藥物中加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、粘合劑、濕潤劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等，必要時還可加入香味劑、甜味劑等。

27、所述給藥可通過所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的方式進(jìn)行給藥，如注射、口服、肺部、鼻腔、口腔給藥等，優(yōu)選方式為鼻腔、口腔和肺部給藥。給藥劑量可根據(jù)制劑形式和期望的作用時間以及預(yù)防/治療對象的情況而有所變化，實際預(yù)防/治療所需量(有效劑量)可由醫(yī)師根據(jù)實際情況(如受試者的病情、年齡、體重等)而確定。

28、一種的應(yīng)用，所述多肽和/或其衍生物、和/或多核苷酸、和/或載體、和/或宿主細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

29、一種用于治療流感病毒感染的試劑盒，包括所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、和/或所述的載體、和/或所述的宿主細(xì)胞、和/或所述的藥物組合物。所述試劑盒中含使用說明書，其包括說明書指示給藥的方法，如給藥次序、時間、劑量、給藥方式等。

30、本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

31、本發(fā)明所得具有特異性抗流感病毒及廣譜抑制作用的雙功能多肽將其作為融合抑制劑及揭示其新靶點；其是通過篩選短肽庫，在真核細(xì)胞水平流感病毒模型的實驗驗證，獲得廣譜抑制流感病毒的多肽，多肽均可有效抑制季節(jié)性h1n1人流感病毒、季節(jié)性h3n2人流感病毒。所用的流感病毒株系中，h1n1株系是季節(jié)性在人類中傳播的流感病毒亞型、h3n2株系是季節(jié)性在人類中傳播的流感病毒亞型。這兩株病毒對應(yīng)的ha亞型(h1、h3)的序列同源性很低，分別屬于不同的進(jìn)化分支，但在宿主結(jié)合特性上有共性。本發(fā)明涉及的多肽通過與ha結(jié)合，干擾流感病毒ha的正常功能，同時在入胞干擾病毒聚合酶功能，達(dá)到了廣譜抗多種不同種屬不同株系流感病毒感染的作用，其可抑制甲型流感、乙型流感及禽流感，具有超廣譜的特征。雙功能的靶點藥物具有較高的突變屏障，不容易引起耐藥性。通過探討該技術(shù)的新靶點及作用機(jī)制，為針對流感病毒的新型藥物研發(fā)提供了有力理論依據(jù)。