本實用新型涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒。

背景技術(shù)：

T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR與CD3分子通過非共價鍵結(jié)合，形成TCR/CD3復(fù)合體，識別特異性抗原后引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致T細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。中心記憶T細胞是T細胞經(jīng)過抗原激活后，產(chǎn)生的具有長期記憶性的，并能夠歸巢到淋巴結(jié)接受抗原再刺激的T細胞。在功能上，和其他類型的T細胞相比，Tcm細胞回輸?shù)襟w內(nèi)可被腫瘤抗原再激活起到直接殺傷腫瘤的作用。同時Tcm細胞具有自我更新及復(fù)制能力，在體內(nèi)存活時間長，可起到長期抗腫瘤作用。并且Tcm在體外能夠高效率擴增保證T細胞的回輸數(shù)量，也可被定量化的監(jiān)測為臨床規(guī)范化治療提供參考指標。因此，Tcm細胞在免疫治療中顯示很好的應(yīng)用前景。目前免疫治療的手段有很多，最根本最基礎(chǔ)的還是T細胞活化技術(shù)。

IL-2最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T細胞生長因子，是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。IL-12是最為強的誘導(dǎo)T細胞特別是活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生IFN-γ的細胞因子。IL-15生物學(xué)作用與IL-2相似。其細胞來源和靶細胞分布較IL-2廣，故能在不表達IL-2的部位發(fā)揮類似IL-2的效應(yīng)，和IL-2合用起協(xié)同作用。L-Glu，谷氨酞胺具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，它是淋巴細胞分泌、增殖及其功能維持所必需的。

現(xiàn)有T細胞活化技術(shù)對于初始T細胞的數(shù)量要求多，而目前應(yīng)用細胞治療的大多數(shù)為腫瘤患者，經(jīng)過放化療后，一些人身體狀況差，外周血像差，能采集到的PBMC少；另外，現(xiàn)有激活方法效率低，細胞擴增倍數(shù)小，只有200倍左右，CD3+CD8+雙陽性比例低，只有20％左右，為此，我們提出了一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒來解決上述問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，而提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒。

為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用了如下技術(shù)方案：

一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒，包括盒體，所述盒體上鉸接有盒蓋，所述盒體內(nèi)設(shè)有第一凹槽、第二凹槽、第三凹槽、第四凹槽、第五凹槽、第六凹槽、第七凹槽，所述第一凹槽和第二凹槽內(nèi)設(shè)有第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶，所訴第三凹槽內(nèi)設(shè)有第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶，所述第四凹槽內(nèi)設(shè)有細胞培養(yǎng)添加試劑瓶，所述第五凹槽內(nèi)設(shè)有細胞激活添加試劑瓶，所述第六凹槽內(nèi)設(shè)有第一細胞因子添加試劑瓶，所述第七凹槽內(nèi)設(shè)有第二細胞因子添加試劑瓶。

優(yōu)選地，所述第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量為100-500mL，所述第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶的容量為10-50mL，所述細胞培養(yǎng)液添加試劑瓶的容量為1-50mL，所述細胞激活添加試劑瓶的容量為2-5mL，所述第一細胞因子添加劑試劑瓶的容量為0.5-2mL，所述第二細胞因子添加劑試劑瓶的容量為0.5-2mL。

優(yōu)選地，所述第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶內(nèi)設(shè)有第一細胞培養(yǎng)液，所述第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶內(nèi)設(shè)有第二細胞培養(yǎng)液，所述細胞培養(yǎng)添加試劑瓶內(nèi)設(shè)有細胞培養(yǎng)添加劑，所述細胞激活添加試劑瓶內(nèi)設(shè)有細胞激活添加劑，所述第一細胞因子添加試劑瓶和第二細胞因子添加試劑瓶內(nèi)設(shè)有第一細胞因子添加劑和第二細胞因子添加劑。

優(yōu)選地，所述盒蓋上設(shè)有限位槽，所述限位槽內(nèi)鉸接有提手。

優(yōu)選地，所述盒蓋上設(shè)有鎖扣，所述盒體上設(shè)有和鎖扣對應(yīng)的鎖孔。

本實用新型中，試劑盒使用時，一、病人簽署知情同意書后，采集外周血30mL，利用Ficoll-Hypaque梯度離心法進行PBMC的分離，分出單個核細胞層；二、吸取單個核細胞層中的液體至離心管中，加入第一細胞培養(yǎng)液，然后離心、洗滌，洗滌后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分離柱中去除非T細胞，再次離心洗滌；離心和洗滌操作依次交替進行兩次，第一次1200rpm離心6min，第二次1500rpm離心10min；也就是說，在步驟二中，要依次進行四次離心和洗滌的操作，以保證實驗的順利進行和最終成品的品質(zhì)；三、使用含有0.5％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液重懸步驟二得到的細胞，得到細胞懸液，細胞懸液中的細胞濃度為5X10⁵cells/ml；四、在多孔板中，加入D-PBS、細胞激活添加劑B，混合均勻，并在5℃保存20h，得到單抗稀釋液；五、將單抗稀釋液加入步驟三細胞懸液中，并補加0.5％的細胞因子添加劑F，混合均勻后置于39℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h，得到細胞培養(yǎng)液Ⅰ；培養(yǎng)3天后，將細胞轉(zhuǎn)移至T175培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，以保證細胞有充足的生長空間；六、向細胞培養(yǎng)液Ⅰ中補加0.5％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液，并補加IL-1α、細胞激活添加劑B；得到細胞培養(yǎng)液Ⅱ；七、從步驟五開始，每隔兩天用培養(yǎng)液半量換液；所述半量換液為：取一半含細胞的培養(yǎng)基，離心收集細胞后去除培養(yǎng)基，加入1％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液至細胞濃度為5X10⁵cells/ml；八、從步驟五開始，培養(yǎng)14天后，收集T細胞，將T細胞離心后，生理鹽水洗滌三次，即得到活化的中心記憶T細胞。

經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果表明，刺激活化T細胞的方法能夠激活擴增T細胞1000倍，CD3+CD8+雙陽性的T細胞比例可達60％，明顯高于現(xiàn)有技術(shù),本實用新型提供的試劑盒只需要20mL-80mL的外周血，或者2X10⁷-5X10⁷個細胞即可，對人幾乎無影響，試劑盒使用方便、可操作性強，組分明確，流程簡單，經(jīng)濟實用，利用其刺激活活的中心記憶T細胞，可用于臨床前研究或入庫保存。

附圖說明

圖1為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的外觀結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的細胞培養(yǎng)添加試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的細胞激活添加試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的第一細胞因子添加試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖；

圖8為本實用新型提出的一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒的第二細胞因子添加試劑瓶結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中：1盒蓋、2盒體、3第一凹槽、4第二凹槽、5第三凹槽、6第四凹槽、7第五凹槽、8第六凹槽、9第七凹槽、10第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶、11第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶、12細胞培養(yǎng)添加試劑瓶、13細胞激活添加試劑瓶、14第一細胞因子添加試劑瓶、15第二細胞因子添加試劑瓶。

具體實施方式

下面將結(jié)合本實用新型實施例中的附圖，對本實用新型實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本實用新型一部分實施例，而不是全部的實施例。

參照圖1-8，一種高效刺激活化中心記憶T細胞的試劑盒，其包括盒體2，可開啟的盒蓋1，位于盒體2內(nèi)部的凹槽和存放于凹槽內(nèi)的試劑瓶，如圖2所示，第一細胞培養(yǎng)液試劑瓶10存放于盒體2的第一凹槽3和第二凹槽4內(nèi)，總?cè)萘繛?00mL，用于盛放第一細胞培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液為RPMI-1640液體培養(yǎng)基。第二細胞培養(yǎng)液試劑瓶11存放于盒體2的第三凹槽5內(nèi)，總?cè)萘繛?0ml，用于盛放第二細胞培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液為人血白蛋白。

細胞培養(yǎng)液添加試劑瓶12存放于盒體2的第四凹槽6內(nèi)，總?cè)萘繛?ml，用于盛放細胞培養(yǎng)添加劑，細胞培養(yǎng)添加劑為含200mM L-谷氨酰胺、200mM丙酮酸鈉、200mM非必須氨基酸、100mM Hepes、10KU/mL的青霉素和10mg/mL的鏈霉素濃度為0.85％的生理鹽水，細胞激活添加試劑瓶13存放于盒體2的第五凹槽7內(nèi)，總?cè)萘繛?mL，用于盛放細胞激活添加劑，細胞激活添加劑選用包被有單克隆抗體OKT3和單克隆抗體CD28的納米微粒，濃度為2X10⁸個納米微粒/mL的DPBS溶液，第一細胞因子添加試劑瓶14存放于盒體2的第六凹槽8內(nèi)，總?cè)萘繛?.4mL，用于盛放細胞因子添加劑，細胞因子添加劑為含10μg/mL的白細胞介素2IL-2無菌蒸餾水溶液，第二細胞因子添加試劑瓶15存放于盒體2的第七凹槽9內(nèi)，總?cè)萘繛?.4mL，用于盛放細胞因子添加劑，細胞因子添加劑為含25μg/mL的白細胞介素12IL-12和25μg/mL的白細胞介素15IL-15無菌蒸餾水溶液。

本實用新型中，試劑盒使用時，一、病人簽署知情同意書后，采集外周血30mL，利用Ficoll-Hypaque梯度離心法進行PBMC的分離，分出單個核細胞層；二、吸取單個核細胞層中的液體至離心管中，加入第一細胞培養(yǎng)液，然后離心、洗滌，洗滌后去除上清液，加入磁珠混合10min，混合后在分離柱中去除非T細胞，再次離心洗滌；離心和洗滌操作依次交替進行兩次，第一次1200rpm離心6min，第二次1500rpm離心10min；也就是說，在步驟二中，要依次進行四次離心和洗滌的操作，以保證實驗的順利進行和最終成品的品質(zhì)；三、使用含有0.5％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液重懸步驟二得到的細胞，得到細胞懸液，細胞懸液中的細胞濃度為5X10⁵cells/ml；四、在多孔板中，加入D-PBS、細胞激活添加劑B，混合均勻，并在5℃保存20h，得到單抗稀釋液；五、將單抗稀釋液加入步驟三細胞懸液中，并補加0.5％的細胞因子添加劑F，混合均勻后置于39℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28h，得到細胞培養(yǎng)液Ⅰ；培養(yǎng)3天后，將細胞轉(zhuǎn)移至T175培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，以保證細胞有充足的生長空間；六、向細胞培養(yǎng)液Ⅰ中補加0.5％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液，并補加IL-1α、細胞激活添加劑B；得到細胞培養(yǎng)液Ⅱ；七、從步驟五開始，每隔兩天用培養(yǎng)液半量換液；半量換液為：取一半含細胞的培養(yǎng)基，離心收集細胞后去除培養(yǎng)基，加入1％細胞因子添加劑E，1％細胞培養(yǎng)添加劑和5wt％人血白蛋白的無血清培養(yǎng)液至細胞濃度為5X10⁵cells/ml；八、從步驟五開始，培養(yǎng)14天后，收集T細胞，將T細胞離心后，生理鹽水洗滌三次，即得到活化的中心記憶T細胞。

經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果表明，刺激活化T細胞的方法能夠激活擴增T細胞1000倍，CD3+CD8+雙陽性的T細胞比例可達60％，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。

以上，僅為本實用新型較佳的具體實施方式，但本實用新型的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本實用新型揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本實用新型的技術(shù)方案及其實用新型構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。