本實用新型屬于核酸分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種核酸檢測前處理自動化處理裝置。本實用新型實現(xiàn)了核酸檢測前處理全自動，即自動實現(xiàn)核酸提取、擴增、純化等前處理，處理完畢樣本可經(jīng)外部配套測序儀進行檢測，本實用新型簡化了試驗流程，減少了出錯機會，提高了整體檢測的穩(wěn)定性。

背景技術(shù)：

高通量測序技術(shù)是最近十年開始發(fā)展的新型分子檢測技術(shù)。市場上主流的高通量測序儀主要由Illumina、ThermoFisher等提供，任何一種高通量測序平臺在進行檢測前都會首先要求從生物樣本中抽提DNA或RNA，然后把待測DNA樣本構(gòu)建測序文庫，即在待測DNA兩端連接上測序儀通用的接頭DNA序列，在整個構(gòu)建文庫的過程中添加了不少工具酶和緩沖體系，不利于后期的反應(yīng)，所以需要進行一次DNA純化操作去除各種酶和緩沖液，從而讓該待測片段DNA可以在測序儀不同的芯片上進行測序反應(yīng)。

常規(guī)的高通量測序檢測前處理包括核酸提取，文庫構(gòu)建、純化三個步驟。

核酸提取。核酸檢測首先要進行樣本核酸提取。常見的方法有乙醇沉淀法、硅膠柱結(jié)合法、玻璃珠法、磁性顆粒結(jié)合分離法。所有方法的基本原理就是裂解樣本——結(jié)合——清洗——洗脫等四個步驟。單一樣本整個過程約需40分鐘。

文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建的基本概念是在待測DNA加上和后續(xù)測序儀器配套的DNA接頭?；玖鞒淌牵?.末端補平；2.堿基最后增加一個A；3.連接接頭；4.PCR擴增。由于每一步都有獨立的酶和緩沖體系，所以在常規(guī)的高通量測序文庫構(gòu)建過程中，每一次反應(yīng)中間都需要進行基于硅膠柱或磁性顆粒的DNA純化。也就說常規(guī)的高通量測序文庫構(gòu)建流程有：1.末端補平；2.純化；3.堿基最后增加一個A；4.純化；5.連接接頭；6.純化；7.PCR擴增等7個步驟。

純化。文庫構(gòu)建過程中加入了各種工具酶，DNA溶液和磁性顆粒、硅膠膜、玻璃珠等介質(zhì)結(jié)合，清洗液清洗兩次去除各種雜質(zhì)，最終用洗脫液洗脫DNA。

自此完成一個從原始樣本到最終測序文庫的所有試驗環(huán)節(jié)。整個試驗流程需要5～8個小時，在每個實驗環(huán)節(jié)都需要標記試管以免弄錯樣本，費時費力。

針對上述的復雜試驗步驟，市場上有一些儀器代替人工操作。由于高通量測序為目前市場上全新的技術(shù)，有針對每個步驟的單一設(shè)備，比如核酸提取可以有多種類型的核酸提取儀，文庫構(gòu)建可以通過自動移液工作站完成，文庫的純化可以由手工完成，也可以通過自動移液工作站完成。核酸提取儀，一次可實現(xiàn)12-96個不等的核酸提取。操作者需要把樣本放入儀器中，40分鐘后，取出提取完的樣本，標記后以待后續(xù)實驗使用。核酸前處理，反應(yīng)配置、溫控、混勻可由移液工作站實現(xiàn)，開始前操作者把需要的配套試劑放置在工作站臺面上，設(shè)置好程序，標記好投入產(chǎn)出的試驗管位置，開始運行。由于移液工作站為開放平臺，在整個多步試驗操作過程中，操作者需要不定期進行96孔板封膜、開膜，或者不定期進行大量的管蓋開閉工作，雖然一部分工作由工作站來完成，但整體仍然需要人工大量介入，無法實現(xiàn)整個過程的無人值守，多個步驟需要人工來標記、排序、設(shè)置。同時由于試驗一旦開始，無法再臨時增加或改變試驗流程，一旦臨時有樣本需要處理，或者改變試驗流程，將對整體參與試驗的樣本產(chǎn)生影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，提供一種核酸檢測前處理自動化裝置，可實現(xiàn)核酸檢測前處理的全自動，包括提取、文庫構(gòu)建、產(chǎn)物純化，最終產(chǎn)物可直接用于高通量測序，全程無人值守。

一種核酸檢測前處理自動化裝置，其特征在于，包括

用于放置樣本和前處理試劑的試劑盤；

用于放置試劑盤的底座，底座上設(shè)有溫控模塊和旋轉(zhuǎn)模塊；

用于實現(xiàn)磁性顆粒分離、清洗和洗脫的磁力分選模塊；

用于轉(zhuǎn)移試劑盤內(nèi)試劑的移液裝置，移液裝置設(shè)有移液模塊和移液槍頭；和

用于控制溫控模塊、旋轉(zhuǎn)模塊、磁力分選模塊和移液模塊運行的主機。

本實用新型的核酸檢測前處理自動化裝置，在一個獨立試劑盤內(nèi)全自動運行核酸提取、建庫、純化等處理，每臺裝置作為一個單元獨立封閉運行，可通過串聯(lián)方式無限擴展數(shù)量，實現(xiàn)多個樣品同時檢測。

所述試劑盤包括蓋板和試劑托盤，試劑托盤上設(shè)有若干試劑孔，試劑孔內(nèi)分裝有核酸測序前處理試劑，試劑孔開口處設(shè)置鋁箔封膜。

進一步地，鋁箔封膜上設(shè)置管道支架，管道支架和蓋板之間設(shè)有硅膠層。在進行核酸檢測自動化前處理的時候，先移除試劑盤的蓋板，裝置的移液裝置(例如移液槍頭)可直接戳破硅膠和鋁箔封膜，進入腔室進行移液操作，操作結(jié)束后，移液裝置退出鋁箔和硅膠。鋁箔封膜會留有穿透孔，而硅膠回彈后，使試劑孔仍然處于密封狀態(tài)，試劑孔內(nèi)試劑不會揮發(fā)影響整體試驗。

所述試劑盤為圓形。試劑孔可根據(jù)試劑盤的形狀作優(yōu)化排布，優(yōu)選為等徑分布。多孔試劑盤優(yōu)選采用一次性獨立試劑盤，待檢測樣本加入試劑盤后在該試劑盤內(nèi)完成從初始樣本、核酸提取、核酸檢測前處理的全部流程。

所述核酸測序前處理試劑包括核酸提取試劑、文庫構(gòu)建試劑和DNA純化試劑，包括但不限于核酸末端補平、加A、連接、純化等步驟試劑。

所述試劑孔包括裂解孔、磁珠孔、提取孔、文庫構(gòu)建孔、PCR反應(yīng)孔、純化孔、最終樣本孔和廢液孔。

所述底座上設(shè)有旋轉(zhuǎn)模塊，旋轉(zhuǎn)模塊旋轉(zhuǎn)時帶動溫控模塊一起旋轉(zhuǎn)。試劑盤可通過底座上的旋轉(zhuǎn)模塊進行轉(zhuǎn)動、移動。這樣儀器整體結(jié)構(gòu)簡單，頂部移液模塊不需要移動，底部在轉(zhuǎn)動的同時還能同時實現(xiàn)溫控。

所述移液模塊包括移液泵。

所述磁力分選模塊包括設(shè)于底座和試劑盤旁邊的活動磁鐵。

本實用新型裝置具有溫控模塊、移液模塊和磁力分選模塊，可實現(xiàn)溫控、移液、混勻、磁力分選功能。溫控模塊可以在一個或多個步驟，對試劑盤內(nèi)試劑進行加熱、低溫、升變溫處理。移液模塊可實現(xiàn)在試劑盤不同試劑孔之間液體的轉(zhuǎn)移，可由儀器內(nèi)置或試劑盤內(nèi)含一個或多個移液槍頭實現(xiàn)。磁力分選模塊可通過設(shè)置電磁鐵或永磁鐵實現(xiàn)磁性顆粒分離、清洗、洗脫。

在一個具體實施中，核酸檢測前處理自動化裝置采用一次性丟棄的試劑盤，試劑盤內(nèi)含有提取試劑、文庫構(gòu)建試劑、DNA純化試劑。樣本加入試劑盤樣本孔以后，儀器內(nèi)部移液加入裂解液；利用儀器進行混勻10分鐘；移液加入結(jié)合液和磁珠，混勻10分鐘；利用磁力分選模塊吸附磁珠，移液模塊去除上清，加入500ul清洗液，混勻磁珠2分鐘，磁力分選去除清洗液，重復三次；加入30ul洗脫液和磁珠混合，60度加熱5分鐘；移液模塊移液上清去文庫構(gòu)建孔；移液加入末端補平酶，37度30分鐘，75度滅活20分鐘；移液加入DNA接頭，DNA連接酶，20度30分鐘，75度20分鐘滅活；移液去純化孔，加入磁珠和純化結(jié)合液，混勻10分鐘；加磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗兩次磁珠；50ul洗脫液加入磁珠，60度加熱5分鐘，移液DNA到最終樣本室，樣本核酸前處理結(jié)束。

本實用新型實現(xiàn)了在一個封閉的獨立試劑盤，全自動無人值守的核酸檢測前處理的自動化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動運行，產(chǎn)物可直接用于后期測序分析。大大簡化了試驗流程，避免了常規(guī)手工操作的繁瑣，也避免了利用核酸提取儀、移液工作站等儀器配套使用時候，需要多次標記試管，人工來移動試管等環(huán)節(jié)，從試驗流程上杜絕了樣本混淆的可能。

本實用新型的核酸檢測前處理自動化裝置具有以下優(yōu)點：

(1)全自動。儀器全自動實現(xiàn)了核酸檢測前處理全自動，包括核酸提取、末端補平、加A、連接接頭、產(chǎn)物純化等步驟。全自動無人值守，整個過程手工操作不超過5分鐘，把樣本放入試劑盤，試劑盤放入儀器內(nèi)即可全自動運行。

(2)封閉。試劑盤在一個封閉體系內(nèi)運行，保證了樣本不會混淆，也保證了樣本之間不會互相污染。

(3)快速。由于通過儀器實現(xiàn)的不同試驗步驟之間的直接連接，減少了多個環(huán)節(jié)需要的樣本標記工作，大大加快了整體試驗速度。

(4)可編程。由于儀器具有混勻、移液、溫控、磁力分選等模塊，因此設(shè)備可根據(jù)實際需要進行再次開發(fā)，擴展性大。

(5)通量高。儀器為單一樣本一個操作單元，但可通過串聯(lián)形式無限放大，從而靈活實現(xiàn)高通量操作。

附圖說明

圖1是核酸檢測前處理自動化裝置結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是試劑盤示意圖。

圖3是試劑盤局部剖視圖。

圖4是多個核酸檢測前處理自動化裝置實現(xiàn)串聯(lián)擴展示意圖。

具體實施方式

實施例1

如圖1所示的核酸檢測前處理自動化裝置，由旋轉(zhuǎn)裝置1、底座2、活動磁鐵3、移液泵4和移液槍頭5構(gòu)成。移液槍頭5設(shè)于移液泵4上。旋轉(zhuǎn)裝置1設(shè)于底座2上，底座2對應(yīng)試劑盤位置設(shè)有溫控模塊，旋轉(zhuǎn)裝置1旋轉(zhuǎn)時帶動溫控模塊一起旋轉(zhuǎn)。底座2和試劑盤貼合，溫控模塊提供溫度控制。試劑盤可通過底座2上的旋轉(zhuǎn)裝置1進行轉(zhuǎn)動、移動。

如圖2-3所示的試劑盤，包括蓋板6和試劑托盤7，試劑托盤7上設(shè)有若干試劑孔8，試劑孔8內(nèi)分裝有核酸測序前處理試劑，試劑孔開口處設(shè)置鋁箔封膜9。鋁箔封膜9上設(shè)置管道支架10，管道支架和蓋板之間設(shè)有硅膠層11。試劑孔包括：1—裂解孔(6M鹽酸胍、20％異丙醇)；2—磁珠孔(40ul硅烷化磁珠)；3—清洗液(80％乙醇)；4—結(jié)合液(60％異丙醇)；5—洗脫液(純水pH8.0)；6—提取孔；7—文庫構(gòu)建孔；8—末端補平酶混合孔(Klenow DNA聚合酶I，T4多聚核苷酸激酶)；9—連接反應(yīng)混合孔(T4DNA連接酶)；10—純化孔(40ul硅烷化磁珠)；11、14、15—預留孔；12—最終樣本孔；13—廢液孔。

如圖4所示是4個核酸檢測前處理自動化裝置串聯(lián)示意圖，可根據(jù)需要任意串聯(lián)，實現(xiàn)多個樣品同時檢測。

實施例2

血漿游離DNA為小片段、碎片化DNA，片段長度100～300bp之間，峰值在160bp左右。1997年，盧煜明教授發(fā)現(xiàn)在孕婦外周血漿中含有胎兒的游離DNA，從而開創(chuàng)以游離DNA為檢測來源，分析孕婦所懷胎兒是否有染色體異常。血漿中也存在來源于腫瘤細胞的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)，ctDNA被廣泛用來做腫瘤液態(tài)活檢，可以無創(chuàng)傷性的早期診斷、伴隨診斷、預后隨訪等。

常規(guī)的檢測方法是首先由臨床樣本包括血漿中抽提DNA，進行核酸檢測處理、檢測三個步驟。完成整個樣本檢測需要6～13個小時。其中樣本核酸提取和檢測前處理環(huán)節(jié)工作繁瑣。

采用本實用新型的核酸檢測前處理自動化裝置可實現(xiàn)在一個封閉的獨立試劑盤，全自動無人值守的核酸檢測前處理的自動化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動運行，產(chǎn)物可直接用于后期測序分析。具體操作方法如下：

600ul血漿樣本，放入核酸檢測前處理自動化裝置進行全自動高通量文庫構(gòu)建。

1.600ul血漿加入試劑盤裂解孔，裂解孔含有1.2ml血漿裂解液(6M鹽酸胍、20％異丙醇)；

2.混勻5分鐘，移液模塊，依次移液600ul至提取孔和磁珠(40ul硅烷化磁珠)結(jié)合；

3.活動磁鐵實現(xiàn)磁力分選，上清移至廢液孔；

4.500ul清洗液(80％乙醇)清洗磁珠三次，上清移至廢液孔；

5.60ul洗脫液移至提取孔，56度10分鐘洗脫DNA；

6.DNA移至建庫孔，加入補平酶(DNA聚合酶I、T4多聚核苷酸激酶)混合10ul；

7.37度30分鐘，75度20分鐘滅活；

8.加入DNA接頭5ul，加入DNA連接酶(T4核苷酸連接酶)混合物20ul；

9.16度20分鐘，75度20分鐘滅活；

10.移液模塊，移取所有的產(chǎn)物至純化試劑孔，純化孔含有純化反應(yīng)所需要的磁珠；

11.利用移液模塊上下混勻樣本和磁珠，靜置5分鐘，上活動磁鐵靜置5分鐘，移液模塊移上清至廢液孔；

12.500ul清洗液清洗磁珠兩次，上活動磁鐵，上清移至廢液孔；

13.40ul洗脫液去純化孔，洗脫DNA，利用移液模塊移液至最終樣本孔；

14.產(chǎn)物可直接用于后續(xù)的高通量測序檢測。

實施例3

轉(zhuǎn)錄組測序的研究對象為特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點，通過新一代高通量測序，能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息，已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。

常規(guī)的檢測方法是首先由臨床樣本包括全血、血漿中抽提RNA，進行核酸檢測處理、檢測三個步驟。完成整個樣本檢測需要6～30個小時。其中樣本核酸提取和檢測前處理環(huán)節(jié)工作繁瑣。

采用本實用新型的核酸檢測前處理自動化裝置可實現(xiàn)在一個封閉的獨立試劑盤，全自動無人值守的核酸檢測前處理的自動化，操作者把樣本放入試劑盤后就可讓儀器自動運行，產(chǎn)物可直接用于后期測序分析。具體操作方法如下：

200ul全血樣本，放入核酸檢測前處理自動化裝置實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組建庫全自動處理。

1.200ul樣本加入試劑盤樣本孔以后，移液加入300ul裂解液；

2.混勻；

3.移液加入200ul結(jié)合液和10ul磁珠，混勻10分鐘；

4.利用磁力分選模塊吸附磁珠，移液模塊去除上清；

5.加入500ul清洗液，混勻磁珠2分鐘，磁力分選去除清洗液，重復三次；

6.加入30ul洗脫液和磁珠混合，60度加熱5分鐘；

7.移液模塊移液上清至提取孔；

8.提取孔含有30ul oligo dT的磁珠，65度30分鐘；

9.磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗，磁力分選去除上清；

10.30ul洗脫液加入提取孔，60度加熱5分鐘，移液上清cDNA去文庫構(gòu)建孔；

11.移液加入末端補平酶和dATP，37度30分鐘，65度滅火5分鐘；

12.移液加入DNA接頭，連接酶，20度30分鐘，65度5分鐘滅活；

13.加入10ul磁珠和200ul純化結(jié)合液，混勻10分鐘；

14.加磁力分選，去除上清，500ul清洗液清洗兩次磁珠；

15.50ul洗脫液加入磁珠，60度加熱5分鐘；

16.移液DNA到最終樣本孔，本自動化處理裝置試驗結(jié)束；

17.最終DNA可以直接用于后續(xù)高通量測序檢測。