專利名稱：核酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供一種通過(guò)同時(shí)進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增和可檢測(cè)信號(hào)的生成來(lái)檢測(cè)樣品中靶核酸的方法。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床微生物學(xué)、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。這些技術(shù)將是新興的藥理基因組學(xué)、產(chǎn)前診斷和分子水平癌癥診斷和治療的重要組成部分。擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)非常重要，它決定核酸檢測(cè)的特異性、靈敏度、可靠性及成本。
借助核酸序列特異性擴(kuò)增能夠進(jìn)行序列的靈敏檢測(cè)。隨著聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的發(fā)明，出現(xiàn)了很多其他擴(kuò)增方法，這些方法要么是熱循環(huán)擴(kuò)增方法，要么是等溫?cái)U(kuò)增方法。擴(kuò)增產(chǎn)物的分析或檢測(cè)對(duì)這些方法來(lái)說(shuō)都很重要。一種好的檢測(cè)手段應(yīng)該具有以下特征(a)特異性強(qiáng)。檢測(cè)方法應(yīng)該具有序列特異性。為此可以使用序列特異性探針。
(b)對(duì)擴(kuò)增過(guò)程無(wú)干擾。檢測(cè)過(guò)程應(yīng)對(duì)擴(kuò)增過(guò)程無(wú)影響或影響很小，不應(yīng)使特異性或靈敏度降低。
(c)簡(jiǎn)便易行。檢測(cè)方法應(yīng)盡量減少擴(kuò)增后操作、易于使用、高產(chǎn)出、低成本。這些要求都至少部分取決于該方法是否簡(jiǎn)便。
(d)同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。這樣才能夠?qū)U(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。實(shí)時(shí)檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)在很大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
(e)封閉均相系統(tǒng)。這樣的系統(tǒng)能夠大大減少產(chǎn)物夾帶造成的交叉污染。為了盡量減少對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增后操作時(shí)嚴(yán)重交叉污染的危險(xiǎn)，擴(kuò)增和檢測(cè)應(yīng)在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行。
等溫?cái)U(kuò)增指的是在基本恒定的溫度下進(jìn)行的一類擴(kuò)增。等溫?cái)U(kuò)增的例子有基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、單引物等溫?cái)U(kuò)增(SPIATM)和指數(shù)單引物等溫?cái)U(kuò)增(X-SPIATM)(公開于美國(guó)專利5130238、5409818、5554517、6063603、5399491、5437990、5480784、5888779、6090591、5270184、5916779、5854033、6183960、6210884、6344329、6251639)、3SR(自動(dòng)維持序列擴(kuò)增)(Guatelli，1990)和環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)(Notomi，2000，美國(guó)專利6410278)?，F(xiàn)有技術(shù)中已研究了各種實(shí)時(shí)檢測(cè)手段，包括熒光極化(FP)(Walker，1996；Spears，1997)、限制性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的FRET探針切割(Nadeau，1999)、分子燈塔(Leone，1998；Nilsson，2002)。
美國(guó)專利6350580公開了一種用含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針和一種FEN核酸酶檢測(cè)靶核酸的方法。在有靶分子存在時(shí)，探針與靶分子結(jié)合并被FEN核酸酶切割。如果沒有靶分子存在，探針則以所述二級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象存在。但該方法的許多步驟有以下缺點(diǎn)(a)探針的設(shè)計(jì)更為困難。這類探針有兩個(gè)熔點(diǎn)，即二級(jí)結(jié)構(gòu)的熔點(diǎn)和靶雜交的熔點(diǎn)。在有靶序列存在時(shí)，探針可以維持兩種形式，即二級(jí)結(jié)構(gòu)形式或雜交形式。這兩種形式彼此競(jìng)爭(zhēng)。雜交熔點(diǎn)受二級(jí)結(jié)構(gòu)熔點(diǎn)的影響。關(guān)鍵是設(shè)計(jì)出其熔點(diǎn)對(duì)任何靶檢測(cè)都適合的探針，而二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在使得雜交熔點(diǎn)的預(yù)測(cè)更加復(fù)雜。
(b)制備這樣的探針更加困難。由于固相寡核苷酸合成的偶合效率低于100％，化學(xué)合成的寡核苷酸/探針是正確長(zhǎng)度的和短于正確長(zhǎng)度的寡核苷酸/探針的混合物。探針越長(zhǎng)，它所含的短于正確長(zhǎng)度的寡核苷酸/探針就越多。加入形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列使探針比沒有這一序列的探針要長(zhǎng)。結(jié)果降低了產(chǎn)率，提高了成本。
(c)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸難于純化。探針合成后的純化非常重要。純化寡核苷酸時(shí)，其穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)使純化復(fù)雜化，這是公知的事實(shí)。
(d)含有二級(jí)結(jié)構(gòu)的探針被FEN核酸酶非特異性切割降低了基于這一機(jī)制的所有檢測(cè)的可靠性。用該方法進(jìn)行檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生很高的背景，從而嚴(yán)重限制檢測(cè)靈敏度或產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)同時(shí)進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增和可檢測(cè)信號(hào)的生成來(lái)檢測(cè)樣品中的靶核酸的方法。本發(fā)明方法能夠在密閉均相系統(tǒng)中特異而靈敏地定量檢測(cè)樣品中的靶核酸，無(wú)須對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增后處理，最大限度地減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)。實(shí)時(shí)操作時(shí)，可以在很大的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量靶核酸。該方法能夠?qū)γ恳话泻怂岫籍a(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的可檢測(cè)信號(hào)，從而對(duì)多個(gè)核酸同時(shí)進(jìn)行定量。除了實(shí)時(shí)操作外，也可以進(jìn)行擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析。
因此，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)靶核酸的方法，所述方法包括(1)用一種不具有顯著的5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶擴(kuò)增所述靶核酸，生成單鏈核酸；(2)使擴(kuò)增后的靶核酸與一種標(biāo)記探針形成一種切割結(jié)構(gòu)；(3)用一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割所述切割結(jié)構(gòu)內(nèi)的所述標(biāo)記探針，產(chǎn)生一種可檢測(cè)的信號(hào)；(4)測(cè)量所述可檢測(cè)信號(hào)，從而測(cè)定所述靶核酸。


圖1是被結(jié)構(gòu)特異性核酸酶識(shí)別和切割的示例性結(jié)構(gòu)的示意圖。左邊一組表示由不帶5′懸垂的探針形成的切割結(jié)構(gòu)。右邊一組表示由帶5′懸垂的探針形成的切割結(jié)構(gòu)。包括一個(gè)模板分子和一個(gè)探針分子的雙分子切割結(jié)構(gòu)見圖1A。由一個(gè)模板分子、一個(gè)探針和第三個(gè)寡核苷酸形成的三分子切割結(jié)構(gòu)見圖1B-1J。與模板雜交時(shí)，在探針和第三個(gè)寡核苷酸之間可以有缺口、切口或重疊結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)分別示于圖1B、1E、1H；1C、1F、1I；和1D、1G、1J。圖1B-1D為由參與擴(kuò)增的寡核苷酸或其延伸形式與探針和模板分子一起形成的切割結(jié)構(gòu)。圖1E-1J畫出了由不參與擴(kuò)增的非延伸性寡核苷酸、探針和模板分子形成的切割結(jié)構(gòu)。非延伸性寡核苷酸可以有3′懸垂(圖1 H-1J)，也可以沒有(圖1E-1G)。圖1中“→”表示5′→3′方向的核酸/寡核苷酸鏈；“●”表示標(biāo)記探針的5′端；“■”表示標(biāo)記探針的3′端；“-”表示非延伸性寡核苷酸。
圖2示出用一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶和一種具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶進(jìn)行核酸檢測(cè)(實(shí)施例2)。所用的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶是來(lái)源于Archaeglobus fulgidus的懸垂核酸內(nèi)切酶-1(Afu FEN-1)。所用的具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶LF，它是來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)的DNA聚合酶的一種缺失突變體，不具有5′內(nèi)切/外切核酸酶結(jié)構(gòu)域。圖2A和圖2B分別顯示的是在沒有和有模板分子存在時(shí)加入不同量的Afu FEN-1的熒光變化情況。圖2B的熒光信號(hào)減去圖2A的熒光信號(hào)即反映熒光信號(hào)的凈增加。結(jié)果如圖2C所示。FRET探針在5′端有一個(gè)6Fam熒光基團(tuán)，3′端有一個(gè)黑洞淬光劑-1(BHQ-1)。當(dāng)探針完整時(shí)，熒光信號(hào)較低。用Bst DNA聚合酶LF進(jìn)行引物延伸形成一種可以被Afu FEN-1識(shí)別的切割結(jié)構(gòu)。在這種切割結(jié)構(gòu)內(nèi)FRET探針的切割使6Fam和BHQ-1在物理上隔開，結(jié)果增強(qiáng)了6Fam熒光信號(hào)。圖2A表明，在沒有模板存在時(shí)Afu FEN-1不切割探針分子。若無(wú)模板，即使加40ng AfuFEN-1，熒光強(qiáng)度也與不加Afu FEN-1/Bst DNA LF(E-)和不加Afu FEN-1(0ng)時(shí)相同。這證明模板對(duì)產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)是必要的。
圖3顯示的是用結(jié)構(gòu)特異性核酸酶和逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行核酸檢測(cè)(實(shí)施例3)。逆轉(zhuǎn)錄酶是NASBA、TMA及3SR核酸擴(kuò)增方法中的關(guān)鍵酶。此處所用的逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)自莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV RT)。所用的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶是Afu FEN-1。圖3A示出在不同量的MMLV RT存在下的差示熒光光譜(有模板-無(wú)模板)。圖3B顯示MMLV RT的量對(duì)熒光強(qiáng)度增加的影響。與用Bst DNA聚合酶LF時(shí)一樣，切割是以模板指導(dǎo)方式進(jìn)行的。在這種反應(yīng)條件下，熒光強(qiáng)度的增加依賴于所加的逆轉(zhuǎn)錄酶的量。
圖4顯示的是用一種高保真DNA聚合酶即Pfu DNA聚合酶進(jìn)行的人類基因組DNA的PCR擴(kuò)增(實(shí)施例4)。用結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)。圖4A顯示擴(kuò)增曲線，表明熒光強(qiáng)度(Rn)隨著擴(kuò)增的進(jìn)行而增加，其中X軸為擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，Y軸為Rn。圖4B顯示循環(huán)閾值(Ct)與DNA量的關(guān)系圖，其中并列的空白柱和陰影柱分別表示兩次平行試驗(yàn)的結(jié)果。循環(huán)閾值是用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行靶核酸定量的關(guān)鍵參數(shù)，當(dāng)靶擴(kuò)增達(dá)到一定水平時(shí)，熒光強(qiáng)度的增加達(dá)到一個(gè)具有統(tǒng)計(jì)顯著性的閾值。相應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為循環(huán)閾值。樣品中的靶序列數(shù)量越多，達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)就越少，循環(huán)閾值也就越低。
圖5顯示了用一種無(wú)核酸酶DNA聚合酶即Stoffel DNA聚合酶進(jìn)行人類基因組DNA的PCR擴(kuò)增。PCR加入結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1，使擴(kuò)增和檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行成為可能。用Stoffel DNA聚合酶擴(kuò)增了來(lái)自HaCat細(xì)胞基因組DNA的人18S核糖體RNA基因的一個(gè)片段。圖5A顯示擴(kuò)增曲線。圖5B顯示用連續(xù)稀釋的人類基因組DNA制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖6顯示切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳(CE)檢測(cè)---Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1(實(shí)施例6)。探針的切割導(dǎo)致探針分子的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，如大小、所帶電荷及遷移率等的改變。檢測(cè)切割情況的一種方法是監(jiān)測(cè)帶熒光基團(tuán)片段在毛細(xì)管電泳中的遷移情況。未切割探針只觀察到一個(gè)峰(6A)。用Bst DNA聚合酶LF進(jìn)行引物延伸觸發(fā)了探針被Afu FEN-1切割，這是由多個(gè)峰的存在得到證實(shí)的(圖6B)。
圖7顯示切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---Stoffel DNA聚合酶和AfuFEN-1(實(shí)施例7)。圖7A顯示未切割探針。無(wú)模板對(duì)照沒有產(chǎn)生任何其它峰(圖7B)，而有模板的反應(yīng)產(chǎn)生多個(gè)切割產(chǎn)物(圖7C)。
圖8顯示切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Afu FEN-1(實(shí)施例8)。未切割探針觀察到單個(gè)峰(圖8A)。用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行引物延伸，用Afu FEN-1進(jìn)行探針切割，產(chǎn)生一種主要切割產(chǎn)物(圖8B)。
圖9顯示切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---用Stoffel DNA聚合酶和AfuFEN-1進(jìn)行PCR(實(shí)施例9)。用Stoffel DNA聚合酶和Afu FEN-1進(jìn)行2.4ng人類基因組DNA的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生多個(gè)產(chǎn)物(圖9B)。圖9A顯示未切割的探針對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
本說(shuō)明書中所用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”或“模板”，不僅是指樣品中天然存在的序列，而且也是指所有由化學(xué)合成和/或酶反應(yīng)創(chuàng)制的序列，包括單鏈核酸、雙鏈核酸或二者的混合物。
術(shù)語(yǔ)“核酸聚合酶”是指DNA聚合酶或RNA聚合酶。術(shù)語(yǔ)“不具有顯著的5′→3′核酸酶活性”是指(a)該酶不具有任何內(nèi)在的5′→3′核酸酶活性，其實(shí)例有只具有3′→5′核酸外切酶或校正活性的逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、DNA聚合酶。(b)或者該酶的5′→3′核酸酶活性大大降低，使得在沒有結(jié)構(gòu)特異性核酸酶存在下不能產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。5′→3′核酸酶活性的降低可以通過(guò)缺失突變或隨機(jī)突變或定位誘變來(lái)實(shí)現(xiàn)。這類酶的實(shí)例有大腸桿菌DNA聚合酶克列諾片段、KlenTaq(Barnes，1992)、Stoffel DNA聚合酶(Lawyer，1993)、AmpliTaq FS(Taq DNA聚合酶的點(diǎn)突變體，其5′核酸酶活性大大降低)、R25C和R74H突變體(Merkens，1995)。這類酶包括由中溫宿主或嗜熱宿主或過(guò)熱宿主原始分離或克隆的酶。(c)或者缺少功能上有意義的5′→3′核酸酶活性。在這種情況下，具有5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶可以與特異性抑制劑一起使用，以抑制其核酸酶活性。
本發(fā)明所用酶的選擇取決于不同的擴(kuò)增方法。對(duì)于SDA、RCA、LAMP、SPIATM及X-SPIATM，DNA聚合酶有強(qiáng)的鏈置換活性是最重要的因素。最常用的酶是Bst DNA聚合酶大片段。對(duì)于NASBA、3SR、TMA等，選用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶，因?yàn)樗鼈兡苁古cRNA模板退火的引物延伸而產(chǎn)生互補(bǔ)DNA(cDNA)鏈。迄今為止所鑒定的天然逆轉(zhuǎn)錄酶都來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒，如莫羅尼鼠白血病毒(MMLV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)、禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)、勞斯伴隨病毒(RAV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)。這些逆轉(zhuǎn)錄酶的很多遺傳工程突變體可從商業(yè)途徑獲得。NASBA、3SR、TMA還要求有RNA聚合酶。廣泛使用的RNA聚合酶包括來(lái)自SP6、T4和T7噬菌體的RNA聚合酶。對(duì)于PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，由于要求熱循環(huán)，所以需要熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。許多熱穩(wěn)定的DNA聚合酶都已經(jīng)被克隆并定性。這些聚合酶包括但不限于以下來(lái)源的聚合酶Pyrococcus abyssi、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus woesei、Thermococcus gorgonarius、Thermococcuskodakaraensis KOD1、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.9°N-7、Thermococcus sp.TY、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、Thermus flavus、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima。通過(guò)DNA重組產(chǎn)生各種突變體是本領(lǐng)域的公知技術(shù)，因此這些突變體也包括在本發(fā)明中。
術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)特異性核酸酶”是指具有5′內(nèi)切/外切核酸酶活性并以結(jié)構(gòu)特異性方式切割核苷酸的核酸酶。能被這種核酸酶識(shí)別的示例性結(jié)構(gòu)見圖1。核酸能夠形成各種不同的分子內(nèi)結(jié)構(gòu)和分子間結(jié)構(gòu)，例如雙螺旋、發(fā)夾、霍利迪連結(jié)體、假Y、三葉草、5′懸垂結(jié)構(gòu)、復(fù)制叉、凹陷5′末端等，其中一些分子間結(jié)構(gòu)示于圖1?！敖Y(jié)構(gòu)特異性核酸酶”是指能夠識(shí)別某些類型的上述結(jié)構(gòu)，并在識(shí)別后對(duì)其進(jìn)行切割的核酸酶。切割特異性是由底物的結(jié)構(gòu)而不是其序列決定的。相應(yīng)的核酸結(jié)構(gòu)稱為“切割結(jié)構(gòu)”。不同的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶具有取決于底物結(jié)構(gòu)的不同底物選擇性。這種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶不應(yīng)對(duì)線性和單鏈寡核苷酸具有顯著的核酸酶活性。這類核酸酶包括i)懸垂內(nèi)切核酸酶-1(FEN-1)；ii)某些DNA聚合酶的5′核酸酶活性。許多FEN-1都已被分離、純化和鑒定。編碼FEN-1的基因已經(jīng)被克隆并用于生產(chǎn)FEN-1。其實(shí)例有以下來(lái)源的FEN-1Archaeglobusfulgidus、人、熱自養(yǎng)甲烷桿菌ΔH、Methanococcus jannaschii、鼠、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horihoshii、Pyrococcus woesei、Xenopus laevis、小牛RTH-1蛋白、啤酒酵母(Sacchromyces cerevisiae)Rad27蛋白、粟酒裂殖酵母(Schizosacchromyces pombe)Rad2蛋白。第二類結(jié)構(gòu)特異性核酸酶包括與以下來(lái)源的真細(xì)菌DNA聚合酶相關(guān)的5′內(nèi)切/外切核酸酶活性大腸桿菌(DNA聚合酶I)、水生棲熱菌、Thermusflavus、Thermus thermophilus。這類DNA聚合酶都含有5′內(nèi)切/外切核酸酶結(jié)構(gòu)域，已證明該結(jié)構(gòu)域在沒有DNA聚合活性存在下能夠正確發(fā)揮功能。已研究了該核酸酶結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和功能。由定位突變或缺失突變產(chǎn)生的突變體雖然喪失了DNA聚合功能，但仍保留5′核酸酶活性(Lyamichev，1999；Kaiser，1999)。因此，第二類結(jié)構(gòu)特異性核酸酶也包括由上述方法得到的突變體。
盡管大部分所述結(jié)構(gòu)特異性核酸酶優(yōu)先切割與DNA模板雜交的探針，但也有一些能夠?qū)NA模板起作用。例如，Taq DNA聚合酶突變體和Tth DNA聚合酶突變體具有顯著的RNA模板依賴性5′核酸酶活性(Ma，2000；Eis，2001)。這些酶可用于涉及RNA產(chǎn)生的擴(kuò)增方法，如NASBA、TMA和3SR。
對(duì)于特定的擴(kuò)增方法，要根據(jù)以下幾點(diǎn)選擇結(jié)構(gòu)特異性核酸酶和核酸聚合酶a.反應(yīng)溫度的要求及核酸酶的熱穩(wěn)定性。兩種酶都應(yīng)耐受擴(kuò)增過(guò)程中的反應(yīng)溫度或溫度的變化。
b.熱穩(wěn)定性的相容性。要獲得最大的靶擴(kuò)增及信號(hào)生成，應(yīng)該有相容的熱穩(wěn)定性譜。
c.緩沖液的相容性。不同的酶可能要求不同的最適pH、緩沖液和鹽的類型和濃度、Mg2+濃度、共溶劑、去污劑等。同一種緩沖體系中兩種酶都應(yīng)在正確行使功能。
d.模板的類型。例如，應(yīng)選用逆轉(zhuǎn)錄酶來(lái)擴(kuò)增RNA靶或RNA中間產(chǎn)物。如果切割結(jié)構(gòu)中的模板分子是RNA，則應(yīng)使用適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)特異性核酸酶，如Ma和Eis所描述的酶(Ma，2000；Eis，2001)。
e.切割結(jié)構(gòu)的類型。結(jié)構(gòu)特異性核酸酶對(duì)不同切割結(jié)構(gòu)的作用是不同的。據(jù)Hosfield報(bào)導(dǎo)(Hosfield，1999)，在切割假Y結(jié)構(gòu)時(shí)，Methanococcus jannischii的FEN-1比Archaeglobus fulgidus和Pyrococcus furiosus的FEN-1要有效得多。因此，如果將假Y設(shè)計(jì)為主要的切割結(jié)構(gòu)，就應(yīng)該優(yōu)先選擇Methanococcus janni schii FEN-1而不是Archaeglobus fulgidus或Pyrococcus furiosus FEN-1。另一個(gè)例子是，對(duì)于有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的底物，Methanococcus jannischii和熱自養(yǎng)甲烷桿菌FEN-1比水生棲熱菌DNA聚合酶、Thermus thermophilus DNA聚合酶、Archaeglobus fulgidus FEN-1及Pyrococcus furiosus FEN-1具有強(qiáng)得多的活性(Kaiser，1999)。
f.靶擴(kuò)增的保真度要求。對(duì)于任何基于靶擴(kuò)增的核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)，高保真復(fù)制都是最基本的要求。希望使用具有最高保真度的聚合酶。但是，聚合酶都會(huì)產(chǎn)生一些錯(cuò)誤，如不同頻率的堿基置換、缺失和插入。相對(duì)于那些有校正活性的聚合酶來(lái)說(shuō)，沒有3′→5′外切核酸酶活性/校正活性的聚合酶通常具有較低的復(fù)制保真度。前者的堿基置換錯(cuò)誤率是10-6-10-7，而后者是10-2-10-6(Kunkel，1992)。產(chǎn)生不希望的復(fù)制錯(cuò)誤的幾率與復(fù)制循環(huán)數(shù)成比例地增加。如果錯(cuò)誤發(fā)生得早，則錯(cuò)誤序列會(huì)呈指數(shù)擴(kuò)增，從而嚴(yán)重影響產(chǎn)物的分析。對(duì)靶含量較低的樣品影響尤其嚴(yán)重，因?yàn)橐ㄟ^(guò)更多的循環(huán)才能獲得一定量的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，必須設(shè)定保真度要求以滿足擴(kuò)增和檢測(cè)特異性的要求，并應(yīng)相應(yīng)地對(duì)聚合酶進(jìn)行篩選。
核酸聚合酶和結(jié)構(gòu)特異性核酸酶是獨(dú)立存在的，但是它們可以通過(guò)DNA重組技術(shù)融合到一起。這種融合蛋白可能同時(shí)具有核酸聚合酶和結(jié)構(gòu)特異性核酸酶活性。因此，本發(fā)明也包括用這種融合蛋白進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)。
“標(biāo)記探針”指的是一種寡核苷酸，其中含有(i)一種供模板特異性雜交的模板特異性序列；(ii)一個(gè)能夠在形成切割結(jié)構(gòu)后被所述結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割的接頭；(iii)標(biāo)記物；(iv)必要的附加序列和/或部分其他序列以便于進(jìn)行以下過(guò)程a雜交；b切割；c檢測(cè)；d選擇性酶作用或抑制這種作用。
該探針可以含有天然堿基，如腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、鳥嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、次黃嘌呤、胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、二氫尿嘧啶、胸腺嘧啶，也可以含有堿基類似物，包括但不限于7-脫氮腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤(腺嘌呤和鳥嘌呤)、2-和/或6-硫嘌呤(腺嘌呤和鳥嘌呤)、5-溴尿嘧啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤等。
除了正常的5′-3′磷酸二酯鍵外，探針寡核苷酸的骨架上可以含有一些修飾，例如出現(xiàn)于肽核酸(PNA)中的肽鍵、硫代磷酸酯、N3′→P5′亞磷酰胺、甲基膦酸酯、嗎啉核酸。
核糖和/或2-脫氧核糖是優(yōu)選的糖部分。但是，該探針也可含有其他糖類，如2-O-烷基核糖、阿拉伯糖、2-脫氧阿拉伯糖、2-脫氧-2-氟阿拉伯糖、1，5-脫水己糖醇、2-O，4-C-亞甲基核糖、環(huán)己烯。
該探針可含有某些綴合物以便于進(jìn)行擴(kuò)增和/或檢測(cè)。這種綴合物的例子有小溝結(jié)合物、芘、膽固醇、吖啶、生物素等。
該探針的骨架上必須至少含有一個(gè)易于被結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割的連鍵。選擇性切割可以通過(guò)骨架修飾、糖修飾、使用堿基類似物及其他分子部分與探針的綴合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
該探針必須含有與靶核酸基本互補(bǔ)的序列，以使探針/靶核酸雙鏈結(jié)構(gòu)在切割溫度下有足夠的熱穩(wěn)定性和足夠的特異性。非互補(bǔ)序列可以分散于探針內(nèi)部或定位在5′和/或3′端。探針互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度及選擇由多個(gè)因素決定，如堿基組成、前后序列、擴(kuò)增區(qū)的大小和序列、切割溫度、探針/靶雙鏈的熱穩(wěn)定性、雜交嚴(yán)格性、檢測(cè)特異性要求、簡(jiǎn)并性、及修飾基團(tuán)的存在與否，等等。靶互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度一般是5到500個(gè)核苷酸。優(yōu)選的長(zhǎng)度是8到40個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是10到30個(gè)核苷酸。
該探針優(yōu)選不能被核酸聚合酶延伸。因?yàn)閴A基配對(duì)核苷酸的3′羥基是寡核苷酸延伸所必需的，所以可以通過(guò)去除或修飾這個(gè)3′羥基而使其不能延伸。防止探針延伸的方式有2′，3′-雙脫氧核苷酸、3′磷酸、3′烷基化、無(wú)環(huán)核苷酸等。這種3′修飾是公知技術(shù)。因?yàn)榛パa(bǔ)3′端對(duì)于用聚合酶進(jìn)行有效延伸是必要的，所以在探針3′端加入一個(gè)非互補(bǔ)序列是防止延伸的另一種方法。探針中也可以引入干擾核酸聚合酶與3′端結(jié)合或嚴(yán)重抑制其聚合酶活性的修飾。
探針的“標(biāo)記物”是指能夠提供可以用物理、化學(xué)、光化學(xué)、免疫化學(xué)、生物化學(xué)等方法檢測(cè)的信號(hào)的任何原子或基團(tuán)。這些方法包括但不限于下列方法之一或其組合熒光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光、磷光、時(shí)間分辨光譜、熒光偏振、酶反應(yīng)、放射性、比色法、質(zhì)譜、磁學(xué)法、電泳遷移、色譜。
因?yàn)榘泻塑账岬亩糠治鲈趯?shí)際操作中是非常需要的，所以標(biāo)記物作為靶核酸的指示優(yōu)選是可定量的。
該探針優(yōu)選帶有可相互作用的多種標(biāo)記物。結(jié)構(gòu)特異性核酸酶的切割作用應(yīng)定性和/或定量地中止這種相互作用。這對(duì)于密閉均相檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)尤為重要。這種相互作用的一個(gè)例子是共振能轉(zhuǎn)移。基于熒光共振能轉(zhuǎn)移(FRET)、發(fā)光共振能轉(zhuǎn)移(LRET)、磷光共振能轉(zhuǎn)移(PRET)、生物發(fā)光共振能轉(zhuǎn)移(BRET)的檢測(cè)是本領(lǐng)域的已知技術(shù)。這種相互作用可以存在于兩個(gè)小分子之間，如熒光團(tuán)及其淬光劑。這是迄今為止制備帶有兩個(gè)相互作用基團(tuán)的探針的最常用方法。相互作用也可以存在于象蛋白質(zhì)這樣的大分子之間(Boute，2002)。在這些探針中，F(xiàn)RET探針已廣泛用于擴(kuò)增后靶分子的檢測(cè)。最常用的FRET探針有兩個(gè)相互作用的部分。一個(gè)是熒光供體基團(tuán)，另一個(gè)是熒光受體基團(tuán)。盡管熒光受體基團(tuán)可以帶熒光，但優(yōu)選用非熒光基團(tuán)作受體。供體基團(tuán)和受體基團(tuán)都可以位于5′端、中間或3′端，但優(yōu)選把供體基團(tuán)置于5′端。探針的切割將使供體基團(tuán)與受體基團(tuán)分離，從而解除受體基團(tuán)對(duì)供體熒光的淬滅。FRET探針可以有多于兩個(gè)相互作用的部分。例如，美國(guó)專利5952180公開了一種制備帶有獨(dú)特?zé)晒獍l(fā)射譜的可延伸寡核苷酸的方法。獨(dú)特?zé)晒獍l(fā)射譜是由一個(gè)組合熒光能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記物產(chǎn)生的。盡管該方法據(jù)稱可用于DNA測(cè)序，但它也很容易地用于制備非延伸性FRET探針。另一個(gè)例子是美國(guó)專利6037130，該專利公開了制備和使用一種波長(zhǎng)變換探針的方法。制作這種波長(zhǎng)變換探針至少需要三個(gè)相互作用的基團(tuán)。
寡核苷酸本身可以是一個(gè)官能團(tuán)，并與產(chǎn)生信號(hào)的基團(tuán)相互作用。Nurmi報(bào)道了一種單標(biāo)記熒光鋱螯合物探針的合成及其在PCR產(chǎn)物檢測(cè)中的應(yīng)用(Nurmi，2000)。連接在寡核苷酸上的鋱螯合物的熒光大部分被該寡核苷酸淬滅。用核酸酶將該鋱螯合物從寡核苷酸上分離下來(lái)能夠解除這種淬滅。
該探針優(yōu)選是單分子的，但也可以是雙分子或三分子的。美國(guó)專利6432642公開了一種制備雙元雜交探針的方法。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了另外一種含有兩個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸的雙元探針(Li，2002)。最近報(bào)道了一種三元分子燈塔及其在實(shí)時(shí)PCR中的應(yīng)用(Nutiu，2000)。
“切割結(jié)構(gòu)”是指在形成后能被所述結(jié)構(gòu)特異性核酸酶識(shí)別并切割的結(jié)構(gòu)。它由至少兩個(gè)形成雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸分子組成。這種切割結(jié)構(gòu)優(yōu)選由三段核酸形成。示例性的切割結(jié)構(gòu)示于圖1。有關(guān)這些示例性結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割的文獻(xiàn)見以下出版物Harrington，1995；Hosfield，1998；Matsui，1999；Kaiser，1999；Lyamichev，2000；以及這些出版物中引用的文獻(xiàn)。圖1左邊表示的是帶有5′無(wú)懸垂標(biāo)記探針的切割結(jié)構(gòu)，右邊表示的是帶有5′懸垂標(biāo)記探針的切割結(jié)構(gòu)。標(biāo)記探針的3′端也可以有懸垂(未示出)。“懸垂”是指與標(biāo)記探針?biāo)s交的鏈非互補(bǔ)的序列。
每個(gè)線性核酸分子都有5′和3′端。當(dāng)兩個(gè)核酸分子與第三個(gè)核酸分子雜交時(shí)，位于另一核酸分子3′端的核酸分子是另一核酸分子的“下游”。位于另一核酸分子5′端的核酸分子是另一核酸分子的“上游”。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，“切割結(jié)構(gòu)”由三個(gè)核酸分子形成。三個(gè)核酸分子中的兩個(gè)與第三個(gè)核酸分子基本互補(bǔ)。這兩個(gè)核酸分子之一是標(biāo)記的探針寡核苷酸。當(dāng)這兩個(gè)核酸分子與第三個(gè)核酸分子結(jié)合時(shí)，標(biāo)記的探針應(yīng)該位于另一核酸分子的下游。
在切割結(jié)構(gòu)中，標(biāo)記探針與其上游核酸分子的相對(duì)位置可以有缺口(圖1B、1E、1H)或切口(圖1C、1F、1I)或部分重疊(圖1D、1G、1J)?！叭笨凇笔侵竷蓚€(gè)核酸分子的雜交序列至少隔開一個(gè)核苷酸?！扒锌凇笔侵竷蓚€(gè)核酸分子的雜交序列是并列的。“部分重疊”是指上游核酸分子的雜交序列的3′區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸與標(biāo)記探針雜交序列的5′區(qū)域結(jié)合到同一靶核酸序列上。
在一個(gè)由三個(gè)核酸分子形成的切割結(jié)構(gòu)中，上游的寡核苷酸可以是用于擴(kuò)增的寡核苷酸或其延伸形式(圖1B、1C、1D)。該上游寡核苷酸也可以是與標(biāo)記探針與同一核酸分子雜交的另一寡核苷酸。尤其重要的是用這一寡核苷酸通過(guò)線性擴(kuò)增的方法如線性RCA和SPIATM來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物。寡核苷酸可以有5′懸垂(圖中未示出)，也可以沒有5′懸垂(圖1E-1J)。它可以有3′懸垂(圖1H、1I、1J)，也可以沒有3′懸垂(圖1E、1F、1G)。
本發(fā)明可應(yīng)用于許多擴(kuò)增方法。本發(fā)明可用于等溫?cái)U(kuò)增如NASBA、TMA、3SR、RCA、SDA、LAMP、SPIATM和X-SPIATM，也可用于作為熱循環(huán)擴(kuò)增方法的聚合酶鏈反應(yīng)。實(shí)際上，本發(fā)明可用于產(chǎn)生單鏈核酸分子的任何擴(kuò)增方法。
本發(fā)明在NASBA、TMA和3SR中的應(yīng)用由于操作原理上的相似性，這些方法被歸為一類加以討論。這些方法主要用于在恒溫下擴(kuò)增靶RNA。擴(kuò)增包括以下步驟i.RNA模板指導(dǎo)的互補(bǔ)DNA(cDNA)酶促合成。
這一過(guò)程也叫逆轉(zhuǎn)錄，所用的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)。逆轉(zhuǎn)錄是由在3′區(qū)域帶有靶序列、5′區(qū)域帶有RNA聚合酶啟動(dòng)序列的第一寡核苷酸進(jìn)行的。單鏈啟動(dòng)序列只有在變成雙鏈時(shí)才具有轉(zhuǎn)錄功能。逆轉(zhuǎn)錄的結(jié)果是形成RNA/DNA雜合雙鏈。
常用的逆轉(zhuǎn)錄酶是MMLV-RT、AMV-RT、RSV-RT及其突變體。除了RNA模板指導(dǎo)的DNA聚合酶活性外，逆轉(zhuǎn)錄酶也能催化DNA模板指導(dǎo)的DNA合成。
ii.RNA酶H降解RNA/DNA雜合雙鏈中的RNA鏈。
許多逆轉(zhuǎn)錄酶也具有RNA酶H的活性，能選擇性地降解RNA/DNA雜合雙鏈中的RNA鏈。為了進(jìn)行這一步驟，由逆轉(zhuǎn)錄酶或另一種RNA酶H來(lái)提供需要的RNA酶H活性。除去RNA鏈后，cDNA基本變成單鏈。
iii.雙鏈DNA的合成。
第二寡核苷酸與單鏈cDNA雜交，并被逆轉(zhuǎn)錄酶延伸產(chǎn)生DNA/DNA雙鏈。因此，對(duì)應(yīng)RNA聚合酶的啟動(dòng)區(qū)是雙鏈的并且是有功能的。
iv.通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成單鏈RNA。
借助有功能的啟動(dòng)子和RNA聚合酶，每一個(gè)DNA/DNA雙鏈能產(chǎn)生數(shù)百個(gè)RNA分子。這完成了一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。結(jié)果，每一個(gè)RNA模板分子被擴(kuò)增數(shù)百次。
v.重復(fù)i到iv的步驟。
這將使靶核酸得到指數(shù)擴(kuò)增。
為將本發(fā)明應(yīng)用于NASBA、TMA和3SR中，可以利用步驟ii中產(chǎn)生的單鏈cDNA和步驟iv中的單鏈RNA與標(biāo)記探針形成切割結(jié)構(gòu)。切割結(jié)構(gòu)可以只由這兩個(gè)分子形成，也可以再加上另一個(gè)寡核苷酸，該寡核苷酸與任一單鏈核酸至少部分互補(bǔ)，并且在標(biāo)記探針的上游。如果選用單鏈DNA來(lái)形成切割結(jié)構(gòu)，則所述另一個(gè)寡核苷酸可以是第二個(gè)寡核苷酸或者延伸的第二個(gè)寡核苷酸。如果選用所述單鏈RNA來(lái)形成切割結(jié)構(gòu)，則所述另一個(gè)寡核苷酸可以是第一個(gè)寡核苷酸或者延伸的第一個(gè)寡核苷酸。圖1B(缺口結(jié)構(gòu))、1C(切口結(jié)構(gòu))、1D(重疊結(jié)構(gòu))是可能的切割結(jié)構(gòu)的實(shí)例。另外，也可以加入第三個(gè)寡核苷酸形成如圖1E和1H(缺口結(jié)構(gòu))、1F和1I(切口結(jié)構(gòu))、1G和1J(重疊結(jié)構(gòu))所示的切割結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選用單鏈DNA形成切割結(jié)構(gòu)。當(dāng)用單鏈RNA形成切割結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)發(fā)生兩種切割。一種是希望的結(jié)構(gòu)特異性核酸酶對(duì)探針分子的切割，另一種是不希望的RNA酶H對(duì)RNA分子的切割。后一切割破壞模板分子或擴(kuò)增產(chǎn)物，并大大減慢擴(kuò)增的速度。這兩種擴(kuò)增同時(shí)存在會(huì)使擴(kuò)增變得復(fù)雜。而用單鏈DNA形成的切割結(jié)構(gòu)則完全避免了這個(gè)問(wèn)題。
本發(fā)明在RCA中的應(yīng)用RCA是等溫?cái)U(kuò)增靶核酸和/或報(bào)告序列的方法。線性和指數(shù)RCA擴(kuò)增都曾見諸報(bào)道。其應(yīng)用包括通過(guò)信號(hào)或靶擴(kuò)增檢測(cè)DNA和RNA；利用結(jié)合寡核苷酸的抗體檢測(cè)蛋白分子進(jìn)行RCA免疫分析；擴(kuò)增質(zhì)粒用于DNA測(cè)序；特異序列的原位檢測(cè)。
用于靶核酸檢測(cè)時(shí)，一個(gè)5′磷酸化的單鏈DNA寡核苷酸的5′及3′末端含有靶互補(bǔ)區(qū)。與靶模板雜交后，5′和3′端被一個(gè)切口分開。該切口隨后被DNA連接酶封閉，產(chǎn)生環(huán)狀DNA分子。結(jié)合到單鏈DNA環(huán)上后，第一個(gè)寡核苷酸被具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶延伸。每一個(gè)雜交的引物都能產(chǎn)生一條線性單鏈DNA分子，該DNA分子最多帶有105個(gè)串聯(lián)重復(fù)的串聯(lián)體DNA環(huán)互補(bǔ)鏈(Lizardi，1998)。這是RCA的線性形式。應(yīng)用與DNA環(huán)同源且與延伸的第一個(gè)寡核苷酸互補(bǔ)的第二個(gè)寡核苷酸，可以實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。
據(jù)報(bào)道，Bst DNA聚合酶LF、噬菌體φ29 DNA聚合酶、exo-Vent DNA聚合酶、測(cè)序酶v2.0都已應(yīng)用于RCA。Bst DNA聚合酶LF在RCA指數(shù)擴(kuò)增中性能最佳(Lizardi，1998)。
在線性RCA中，可以用單鏈串聯(lián)體與探針形成雙分子切割結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，加入非延伸性寡核苷酸形成三分子切割結(jié)構(gòu)(圖1E-1J)。切割可以重復(fù)發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增。這樣可以只在一個(gè)管中進(jìn)行模板擴(kuò)增和信號(hào)擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)105模板擴(kuò)增(Lizardi，1998)和3×103倍的信號(hào)擴(kuò)增，總的擴(kuò)增倍數(shù)可以達(dá)到3×108以上。
本發(fā)明應(yīng)用于指數(shù)RCA時(shí)，延伸的單鏈第一和第二寡核苷酸都能與標(biāo)記探針形成切割結(jié)構(gòu)，必要時(shí)還可以與第三寡核苷酸一起形成切割結(jié)構(gòu)。示例性的切割結(jié)構(gòu)示于圖1。
本發(fā)明在SDA中的應(yīng)用SDA是一種依賴于DNA鏈置換的等溫指數(shù)擴(kuò)增方法。它用到兩種酶，即限制性內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶，以及兩種寡核苷酸，這兩種寡核苷酸均含有(a)標(biāo)簽序列；(b)被限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別的未修飾序列；(c)與雙鏈靶互補(bǔ)的序列。SDA包括以下步驟i.DNA聚合酶使兩個(gè)雜交引物延伸，摻如一個(gè)2′-脫氧核糖核苷-5′-O-(1-硫代三磷酸)，并產(chǎn)生兩個(gè)半硫代磷酸限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別位點(diǎn)。ii.限制性內(nèi)切核酸酶在兩個(gè)半硫代磷酸識(shí)別位點(diǎn)的未修飾鏈上形成切口。iii.從切口處向3′端延伸置換下游鏈，產(chǎn)生兩個(gè)單鏈DNA分子。iv.新產(chǎn)生的兩條單鏈DNA進(jìn)入下一輪擴(kuò)增。
盡管最初的SDA是用嗜溫性DNA聚合酶即大腸桿菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷性克列諾片段進(jìn)行的(Walker，1992)，但是它已被嗜熱性SDA系統(tǒng)所取代，這一系統(tǒng)包括嗜熱性DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶LF(Spear，1997)。嗜熱性系統(tǒng)優(yōu)于原有系統(tǒng)之處是具有更高的特異性和更快的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)。
本發(fā)明很容易應(yīng)用到SDA中。兩個(gè)單鏈DNA中的任何一個(gè)都能用于形成一個(gè)或更多個(gè)圖1所示的切割結(jié)構(gòu)。
用本發(fā)明進(jìn)行線性SDA時(shí)，產(chǎn)生可用于形成切割結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的單鏈DNA。也可以以與RCA同樣的方法實(shí)現(xiàn)信號(hào)擴(kuò)增。
本發(fā)明在SPIATM及X-SPIATM中的應(yīng)用Nugen Technologies公司的SPIATM(單引物等溫?cái)U(kuò)增)是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它使用的是美國(guó)專利6251639所公開的方法。一個(gè)RNA/DNA嵌合寡核苷酸結(jié)合到靶核酸上，用具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶如Bst DNA聚合酶LF使其延伸。延伸的RNA/DNA嵌合寡核苷酸中的RNA部分被RNA酶H降解，而DNA部分仍與靶核酸雜交。DNA聚合酶使保留的DNA序列延伸，從而置換下游的DNA序列，并產(chǎn)生單鏈DNA。反復(fù)重復(fù)此過(guò)程使靶序列線性擴(kuò)增。SPIATM產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物是單鏈DNA。為將本發(fā)明應(yīng)用于SPIATM，可以與線性RCA同樣的方式形成切割結(jié)構(gòu)。它也提供了一種在同一管中進(jìn)行模板擴(kuò)增、信號(hào)擴(kuò)增和檢測(cè)的方法。
X-SPIATM(指數(shù)單引物等溫?cái)U(kuò)增)是SPIATM的指數(shù)形式。X-SPIATM是通過(guò)制備由SPIATM產(chǎn)生的單鏈DNA的互補(bǔ)鏈而完成的。象SDA一樣，X-SPIATM產(chǎn)生兩條單鏈DNA。象在SDA中一樣，本發(fā)明可用于X-SPIATM中。二者均可被用來(lái)形成切割結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明在LAMP中的應(yīng)用LAMP中擴(kuò)增靶核酸序列要用到四個(gè)寡核苷酸及一種具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶，如Bst DNA聚合酶LF。在步驟I中，Bst DNA聚合酶LF使兩個(gè)外部寡核苷酸和兩個(gè)內(nèi)部寡核苷酸延伸，形成兩個(gè)部分單鏈的啞鈴狀結(jié)構(gòu)。接著，在步驟II中，兩個(gè)內(nèi)部寡核苷酸和兩個(gè)啞鈴狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行自動(dòng)維持指數(shù)擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，形成兩個(gè)啞鈴狀結(jié)構(gòu)的各種長(zhǎng)度的單體和串聯(lián)體。
為將本發(fā)明應(yīng)用于LAMP，用上述單體和串聯(lián)體來(lái)形成帶有探針的切割結(jié)構(gòu)(圖1)。切割結(jié)構(gòu)中探針分子的切割產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。
本發(fā)明在PCR中的應(yīng)用PCR是最常用的核酸擴(kuò)增技術(shù)。它涉及包括以下步驟的熱循環(huán)i.雙鏈DNA的熱分離。ii.兩個(gè)寡核苷酸與每個(gè)單鏈DNA退火。iii.退火的寡核苷酸的延伸。iv.重復(fù)步驟i-iii。
迄今為止，使用高保真酶的PCR擴(kuò)增尚未建立均相檢測(cè)系統(tǒng)?，F(xiàn)有的5′核酸酶分析與高保真DNA聚合酶不相容。盡管與5′核酸酶分析中最常用的酶Taq DNA聚合酶相比，Pfu DNA聚合酶的保真度高8倍(Lundberg，1991)，它仍然沒有應(yīng)用到臨床核酸檢測(cè)中。對(duì)于臨床檢測(cè)、法醫(yī)鑒定、食品衛(wèi)生之類的應(yīng)用，擴(kuò)增的保真度意義重大。因此需要建立一種均相檢測(cè)系統(tǒng)以使高保真DNA聚合酶能夠應(yīng)用于PCR。本發(fā)明可應(yīng)用于高保真PCR中。熱變性產(chǎn)生的兩個(gè)單鏈DNA都能用于形成切割結(jié)構(gòu)以進(jìn)一步產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。
實(shí)施例1寡核苷酸的設(shè)計(jì)應(yīng)用National Biosciences Inc.公司發(fā)表的軟件0ligo 4.02進(jìn)行寡核苷酸的設(shè)計(jì)。影響寡核苷酸設(shè)計(jì)的一個(gè)重要因素是熔點(diǎn)(Tm)，即50％的寡核苷酸與其互補(bǔ)寡核苷酸結(jié)合時(shí)的溫度。根據(jù)不同的Tm預(yù)測(cè)方法，該軟件給出了3個(gè)Tm值。其中，最近鄰值法由于其Tm預(yù)測(cè)的總準(zhǔn)確度最好而得到公認(rèn)，因此采用最近鄰值法確定Tm值。應(yīng)該盡量避免穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈結(jié)構(gòu)尤其是3′雙鏈結(jié)構(gòu)。
為產(chǎn)生最大的信號(hào)，探針寡核苷酸的Tm值應(yīng)明顯高于引物寡核苷酸的Tm值。表1列出了寡核苷酸設(shè)計(jì)的一個(gè)實(shí)例。
表1 用于人18S rRNA基因PCR擴(kuò)增的引物和探針的設(shè)計(jì)

*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
實(shí)施例2用Bst DNA聚合酶和Afu FEN-1進(jìn)行均相序列檢測(cè)在等溫?cái)U(kuò)增法SDA、RCA、LAMP、SPIATM和X-SPIATM中，鏈置換是最關(guān)鍵的步驟。這些擴(kuò)增方法中的關(guān)鍵部分是具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶。Bst DNA聚合酶LF是經(jīng)過(guò)遺傳修飾而切除了其5′核酸酶結(jié)構(gòu)域的Bst DNA聚合酶。它是這些方法中應(yīng)用最廣的DNA聚合酶。這些等溫?cái)U(kuò)增方法都產(chǎn)生單鏈DNA。如果反應(yīng)中有模板特異性探針和結(jié)構(gòu)特異性核酸酶存在，則探針會(huì)結(jié)合到單鏈DNA上，并在形成了適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)時(shí)可以被切除。所以，必要的步驟是i.產(chǎn)生單鏈DNA；ii.探針與單鏈DNA的雜交；iii.通過(guò)引物與單鏈DNA的雜交和/或引物的延伸形成切割結(jié)構(gòu)；iv.結(jié)構(gòu)特異性的核酸酶對(duì)探針的切割。為了闡明本發(fā)明在上述等溫?cái)U(kuò)增中的應(yīng)用，進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)核酸聚合酶Bst DNA聚合酶LF，由New England Biolabs公司提供(8單位/微升)。
結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTGGAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
所有的反應(yīng)中都包含10mM MOPS pH7.75、10mM KCl、3mM MgCl2、dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP，反應(yīng)體積為20μl。除無(wú)酶對(duì)照(NEC)外，所有反應(yīng)都使用1單位的Bs t DNA聚合酶。在無(wú)酶對(duì)照和無(wú)核酸酶對(duì)照(NNC)反應(yīng)中不使用Afu FEN-1，其他反應(yīng)加入5-20ng Afu FEN-1。在無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)中不加18SmT，在有模板反應(yīng)中使用200nM 18SmT。
反應(yīng)混合物在ABI熱循環(huán)儀9600上60℃溫育1小時(shí)，然后加入5μl 50mMEDTA-Na2，pH8.0終止反應(yīng)。在95℃下用ABI Prizm 7900HT對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。在95℃時(shí)探針不能與模板結(jié)合，所以6FAM信號(hào)的任何顯著增強(qiáng)都表明Afu FEN-1對(duì)探針的切割。
在無(wú)模板的反應(yīng)中，即便加入20ng Afu FEN-1也未發(fā)現(xiàn)游離18SP被切割(表1和圖2A)。在有模板的反應(yīng)中，觀察到與NEC和NNC相比6FAM熒光的顯著增強(qiáng)(圖2B)。熒光的凈改變?chǔ)＝F有模板-F無(wú)模板示于圖2C。結(jié)果表明，本發(fā)明提供了一種低背景檢測(cè)特異序列的方法。對(duì)于實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測(cè)來(lái)說(shuō)，低背景是至關(guān)重要的。
表2 Afu FEN-1不切割單鏈探針

進(jìn)行線性擴(kuò)增時(shí)，優(yōu)選的切割結(jié)構(gòu)由擴(kuò)增產(chǎn)物、探針分子和非延伸性寡核苷酸形成。已證實(shí)這種切割結(jié)構(gòu)中的探針可以被結(jié)構(gòu)特異性核酸酶有效降解。
在一種指數(shù)擴(kuò)增方案中，優(yōu)選由擴(kuò)增產(chǎn)物、探針、可延伸寡核苷酸或延伸的寡核苷酸形成切割結(jié)構(gòu)。這種切割結(jié)構(gòu)中的探針分子會(huì)發(fā)生兩種反應(yīng)。它可能被延伸的上游寡核苷酸置換，也可能被Afu FEN-1切割。增加Afu FEN-1確實(shí)能改善切割(圖2C)。這是這兩種反應(yīng)確實(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)的間接證據(jù)。盡管未確定這兩種反應(yīng)的相對(duì)頻率，但數(shù)據(jù)明確顯示發(fā)生了足夠的切割。因此，本發(fā)明能夠應(yīng)用于上述擴(kuò)增方法，并提供了以觀察不到的背景進(jìn)行均相檢測(cè)的方法。
實(shí)施例3用逆轉(zhuǎn)錄酶和Afu FEN-1進(jìn)行均相序列檢測(cè)對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)，由核酸聚合酶產(chǎn)生單鏈核酸是必要的。用NASBA、TMA、3SR進(jìn)行核酸序列擴(kuò)增時(shí)，有兩個(gè)產(chǎn)生單鏈核酸的步驟。第一步是RNA分子的反轉(zhuǎn)錄。經(jīng)過(guò)RNA酶H的作用后，RNA/DNA雙鏈中的RNA鏈被降解，結(jié)果新產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA包含大部分的單鏈DNA。本發(fā)明可應(yīng)用于單鏈DNA的拷貝過(guò)程中。逆轉(zhuǎn)錄酶負(fù)責(zé)兩條DNA鏈的合成。第二步是體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈RNA分子。應(yīng)用合適的探針和結(jié)構(gòu)特異性核酸酶，單鏈RNA分子也能夠用于應(yīng)用本發(fā)明進(jìn)行序列檢測(cè)。本發(fā)明在NASBA、TMA、3SR中的應(yīng)用可由如下的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)明。
核酸聚合酶Invitrogen的莫洛尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)。
結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTGGAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
所有反應(yīng)中均含有10mM MOPS pH7.50、20mM KCl、4mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.5mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP，反應(yīng)體積為20μl。除了無(wú)酶對(duì)照反應(yīng)和無(wú)核酸酶對(duì)照(NNC)反應(yīng)外，所有反應(yīng)中均使用20ng Afu FEN-1。反應(yīng)中加入不同量的逆轉(zhuǎn)錄酶，分別為0、12.5、25、50、100和200U。無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)中不加18SmT。在有模板的反應(yīng)中使用200nM 18SmT。
反應(yīng)混合物在ABI熱循環(huán)儀9600上45℃溫育1小時(shí)。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)終止反應(yīng)。在95℃下用ABI Prizm 7900HT分析反應(yīng)混合物的熒光強(qiáng)度。在95℃下探針不能結(jié)合到模板上，所以6FAM信號(hào)的任何顯著增強(qiáng)都是Afu FEN-1對(duì)探針的切割所致。
如實(shí)施例1中所看到的，缺少模板就觀察不到切割(表2)。探針的切割依賴于莫洛尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶活性。差示熒光譜(有模板-無(wú)模板)示于圖3A。在此種反應(yīng)條件下，12.5U和25U莫洛尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶不產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。逆轉(zhuǎn)錄酶為50U時(shí)，觀察到6FAM熒光強(qiáng)度的顯著增強(qiáng)。逆轉(zhuǎn)錄酶越多產(chǎn)生的信號(hào)就越強(qiáng)(圖3A、3B)。
表3

實(shí)施例4用高保真熱穩(wěn)定酶對(duì)人類基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增高保真核酸擴(kuò)增對(duì)于任何擴(kuò)增方法都是很關(guān)鍵的。任何核苷酸的錯(cuò)誤摻入都會(huì)在隨后的循環(huán)中指數(shù)擴(kuò)增并導(dǎo)致定性和/或定量上的錯(cuò)誤結(jié)果。這對(duì)于基于探針的檢測(cè)方法尤為關(guān)鍵。具有3′→5′外切核酸酶活性(也叫校正活性)的DNA聚合酶，如Pfu DNA聚合酶、Tli DNA聚合酶，已被證明比那些缺少這種核酸酶活性的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶具有更高的保真度。由具有校正活性的DNA聚合酶進(jìn)行基于探針的實(shí)時(shí)PCR還未見任何報(bào)道。為將本發(fā)明應(yīng)用于高保真PCR擴(kuò)增，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)核酸聚合酶Stratagene的PfuTurbo DNA聚合酶(2.5U/μl)。按照Stratagene的說(shuō)明書，PfuTurbo DNA聚合酶是一種特殊配制的Pfu DNA聚合酶，已知其保真度比Taq DNA聚合酶高8倍。
結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1。
人類基因組DNAHaCat細(xì)胞基因組DNA。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SR5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1***硫代磷酸修飾。這種修飾是為了抑制PfuTurbo DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性的非特異性探針降解作用。若無(wú)這一修飾，這種非特異性降解會(huì)使淬光劑BHQ-1從探針上去掉。BHQ-1與6FAM分離的結(jié)果是產(chǎn)生干擾檢測(cè)的6FAM信號(hào)的增強(qiáng)。
**黑洞淬光劑-1。
25μl反應(yīng)混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、5ng Afu FEN-1和0.625U PfuTurbo DNA聚合酶。反應(yīng)中加入不同量的HaCat基因組DNA，分別為0(無(wú)模板對(duì)照)、6pg、60pg、600pg。
在ABI Prizm 7900HT上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，以如下熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃1分鐘→(95℃15秒→60℃1分鐘)。實(shí)時(shí)收集數(shù)據(jù)，用SDS 2.0版軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。
擴(kuò)增曲線如圖4所示。用于基因定量的Ct值示于圖4B。雖然不同量的基因組DNA模板產(chǎn)生明顯不同的Ct值，但無(wú)模板對(duì)照(NTC)反應(yīng)沒有產(chǎn)生任何可檢測(cè)信號(hào)(Ct＝40)。在NTC反應(yīng)中無(wú)可檢測(cè)信號(hào)有兩方面意義第一，證明未雜交的單鏈探針不被Afu FEN-1切割；第二，探針3′端的硫代磷酸修飾保護(hù)探針不被PfuTurbo DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性非特異性降解。低至6pg的人類基因組DNA都能用本發(fā)明的方法成功擴(kuò)增和檢測(cè)，而這些DNA只相當(dāng)于單個(gè)細(xì)胞中的DNA量，這證明了本發(fā)明的擴(kuò)增和檢測(cè)方法具有高度靈敏性。
實(shí)施例5用無(wú)核酸酶的熱穩(wěn)定酶對(duì)人類基因組DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增Taq DNA聚合酶包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域1)位于N末端區(qū)域的5′外切/內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域；2)C末端區(qū)域的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域。缺失外切/內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域可以完全去掉核酸酶活性。截短的DNA聚合酶比野生型Taq DNA聚合酶具有更高的復(fù)制保真度和更高的熱穩(wěn)定性(Lawyer，1993；Barnes，1992)。這兩方面的改進(jìn)對(duì)PCR擴(kuò)增大有裨益。因?yàn)榕cPCR擴(kuò)增子雜交的非延伸性探針具有抑制作用，所以實(shí)際上很難與這種酶一起使用分子燈塔(Yu，1997)。本發(fā)明能同時(shí)改善擴(kuò)增和實(shí)時(shí)檢測(cè)。設(shè)計(jì)了如下的實(shí)驗(yàn)核酸聚合酶Stoffel DNA聚合酶(每微升10單位，AppliedBiosystems)，為Taq DNA聚合酶的289氨基酸N末端缺失突變體。
結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1。
人類基因組DNAHaCat細(xì)胞基因組DNA。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SR5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1***硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
25μl反應(yīng)混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2，四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、5ng Afu FEN-1和1.0U Stoffel DNA聚合酶。反應(yīng)中加入不同量的HaCat基因組DNA，分別為0(無(wú)模板對(duì)照)、6pg、60pg、600pg、6000pg。
在ABI Prizm 7900HT上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，以如下熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃1分鐘→(95℃15秒→60℃1分鐘)。實(shí)時(shí)收集數(shù)據(jù)，用SDS 2.0版軟件(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。
擴(kuò)增曲線如圖5A所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5B。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)是1.00。衡量擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率是-3.29，說(shuō)明擴(kuò)增效率非常接近100％。低至6pg的人類基因組DNA被可靠地檢測(cè)到，而這些DNA只相當(dāng)于單個(gè)人細(xì)胞的DNA量。
實(shí)施例6切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---用Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1進(jìn)行序列檢測(cè)實(shí)施例2-5的實(shí)驗(yàn)是在密閉管中進(jìn)行的。這樣做有幾大優(yōu)點(diǎn)，但是其熒光檢測(cè)靈敏度低，這是由于未切割探針的不完全淬滅導(dǎo)致高熒光背景。由于難以分辨復(fù)雜的發(fā)光譜，致使其同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)靶的能力也受到限制。在檢測(cè)之前分離切割產(chǎn)物是一種降低熒光背景并使每一部分都得到簡(jiǎn)化圖譜的方法。毛細(xì)管電泳已普遍用于DNA測(cè)序及DNA片段大小的分析。這種方法高度靈敏，能處理多個(gè)靶。作為一種示例性的產(chǎn)物分離和檢測(cè)方法，用毛細(xì)管電泳來(lái)檢測(cè)切割情況。實(shí)驗(yàn)具體操作如下核酸聚合酶New England Biolabs的Bst DNA聚合酶LF(8U/μl)。
結(jié)構(gòu)特異性核酸酶Afu FEN-1。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTGGAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
20μl反應(yīng)混合物中含有15mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、1U Bst DNA聚合酶和40ng Afu FEN-1。無(wú)酶對(duì)照中不加Bst DNA聚合酶LF和Afu FEN-1。
反應(yīng)混合物在ABI熱循環(huán)儀9600上60℃溫育1小時(shí)。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)終止反應(yīng)。將產(chǎn)物分別稀釋500倍(無(wú)酶對(duì)照)和100倍(加酶)，然后在ABI Prizm 310上進(jìn)行分析。結(jié)果用GeneScan 2.1軟件進(jìn)行分析。
無(wú)酶對(duì)照反應(yīng)只出現(xiàn)單峰(圖6A)，而加酶的反應(yīng)則多出現(xiàn)6個(gè)條帶。毛細(xì)管電泳檢測(cè)確實(shí)比ABI Primer 7900的均相檢測(cè)更靈敏。據(jù)估計(jì)，靈敏度至少提高100倍。
實(shí)施例7切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---用Stoffel DNA聚合酶和Afu FEN-1進(jìn)行序列檢測(cè)20μl反應(yīng)混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、1U Stoffel DNA聚合酶(Applied Biosystem)和10ng Afu FEN-1。無(wú)模板對(duì)照不含有18SmT。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTGGAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
反應(yīng)混合物在ABI熱循環(huán)儀9600上6 0℃溫育1小時(shí)。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)終止反應(yīng)。將產(chǎn)物稀釋500倍，然后在ABI Prizm 310上進(jìn)行分析。結(jié)果用GeneScan 2.1軟件進(jìn)行分析。
與無(wú)酶對(duì)照(圖7A)一樣，無(wú)模板對(duì)照反應(yīng)也只出現(xiàn)單峰(圖7B)，這再一次證明Afu FEN-1不切割單鏈探針。在有模板時(shí)，觀察到5個(gè)切割產(chǎn)物(圖7C)。
實(shí)施例8切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---用莫洛尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶和Afu FEN-1進(jìn)行序列檢測(cè)20μl反應(yīng)混合物中含有10mM MOPS pH7.50、20mM KCl、4mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.5mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM18SF、200nM 18SP、200nM 18SmT、200U莫洛尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)和20ng Afu FEN-1。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1**18SmT 5′CTT GCC CTC CAA TGG ATC CTC GTT AAA GGA TTT AAA GTGGAC TCA TTC CAA TTA CAG GGC CTC G 3′*硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
反應(yīng)混合物在ABI熱循環(huán)儀9600上45℃溫育1小時(shí)。加入5μl 50mMEDTA-Na2(pH8.0)終止反應(yīng)。將產(chǎn)物稀釋50倍，然后在ABI Prizm 310上進(jìn)行分析。結(jié)果用GeneScan 2.1軟件進(jìn)行分析。
與實(shí)施例6、實(shí)施例7中的反應(yīng)不同，莫洛尼鼠類逆轉(zhuǎn)錄酶和Afu FEN-1產(chǎn)生一個(gè)主要切割產(chǎn)物(圖8B)。
實(shí)施例9切割產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測(cè)---人類基因組DNA的PCR擴(kuò)增20μl反應(yīng)混合物中含有10mM MOPS pH7.75、3mM MgCl2、四種dNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)各0.2mM、0.1％NP-40、6％甘油、200nM 18SF、200nM 18SR、200nM 18SP、2.4ng HaCat細(xì)胞基因組DNA、1U Stoffel DNA聚合酶(Applied Biosystems)、10ng Afu FEN-1。
寡核苷酸名稱序列18SF5′CGA GGC CCT GTA ATT GGA A 3′18SR5′CGG CTG CTG GCA CCA GA 3′18SPU 5′6FAM CGAGGA TCC ATT GGA GGG*C*A*A*G BHQ1***硫代磷酸修飾。**黑洞淬光劑-1。
在ABI熱循環(huán)儀9600上進(jìn)行PCR(95℃20秒→60℃1分鐘)40個(gè)循環(huán)。加入5μl 50mM EDTA-Na2(pH8.0)終止反應(yīng)。將產(chǎn)物稀釋500倍，然后在ABI Prizm 310上進(jìn)行分析。結(jié)果用GeneScan 2.1軟件進(jìn)行分析。觀察到多達(dá)8個(gè)切割產(chǎn)物。
值得注意的是，每個(gè)酶都產(chǎn)生一個(gè)獨(dú)特的切割模式。切割模式的不同可能是由于在特定反應(yīng)條件下每個(gè)酶的特性和探針行為都不同。在某些位點(diǎn)選擇性阻斷切割應(yīng)能減少切割產(chǎn)物的數(shù)量，有利于多個(gè)序列的同時(shí)檢測(cè)。對(duì)骨架、碳水化合物及寡核苷酸堿基進(jìn)行修飾以保護(hù)其免受核酸酶的攻擊是已知技術(shù)。
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權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)靶核酸的方法，所述方法包括(1)用一種不具有顯著的5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶擴(kuò)增所述靶核酸，生成單鏈核酸；(2)使擴(kuò)增后的靶核酸與一種標(biāo)記探針形成一種切割結(jié)構(gòu)；(3)用一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割所述切割結(jié)構(gòu)內(nèi)的所述標(biāo)記探針，產(chǎn)生一種可檢測(cè)的信號(hào)；(4)測(cè)量所述可檢測(cè)信號(hào)，從而測(cè)定所述靶核酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述靶核酸為樣品中天然存在的核酸序列。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述靶核酸為單鏈核酸、雙鏈核酸或者二者的混合物。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶為具有強(qiáng)鏈置換活性的DNA聚合酶。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸聚合酶為Bst DNA聚合酶大片段。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶為具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述核酸聚合酶為莫羅尼鼠逆轉(zhuǎn)錄酶。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸聚合酶為熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述核酸聚合酶為Pfu DNA聚合酶。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(2)中所述靶核酸和所述標(biāo)記探針與一種外加的寡核苷酸一起形成所述切割結(jié)構(gòu)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸檢測(cè)方法，該方法通過(guò)同時(shí)進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增和可檢測(cè)信號(hào)的生成來(lái)檢測(cè)樣品中的靶核酸。所述方法包括用一種不具有顯著的5′→3′核酸酶活性的核酸聚合酶擴(kuò)增所述靶核酸，生成單鏈核酸；使擴(kuò)增后的靶核酸與一種標(biāo)記探針形成一種切割結(jié)構(gòu)；用一種結(jié)構(gòu)特異性核酸酶切割所述切割結(jié)構(gòu)內(nèi)的所述標(biāo)記探針，產(chǎn)生一種可檢測(cè)的信號(hào)；測(cè)量所述可檢測(cè)信號(hào)，從而測(cè)定所述靶核酸。本發(fā)明可應(yīng)用于臨床微生物學(xué)、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的核酸檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1506471SQ0315440
公開日2004年6月23日 申請(qǐng)日期2003年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月9日
發(fā)明者畢萬(wàn)里 申請(qǐng)人:畢萬(wàn)里