本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一株產(chǎn)不飽和脂肪酸的變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

不飽和脂肪酸是碳鏈未完全被氫原子所飽和的含有一個或多個雙鍵的一類物質(zhì)，它們不僅具有加強細胞膜的相對流動性、膽固醇的酯化、降低血液粘稠度等生理功能，而且還參與體內(nèi)脂肪的合成，為人體必需的一類物質(zhì)。目前，不飽和脂肪酸商業(yè)來源主要來自于魚類和一些農(nóng)作物原料的提取。但是，這類來源的不飽和脂肪酸生產(chǎn)易受到原料的限制，且提取費用高等缺陷，導(dǎo)致使用成本高。另一方面，有些酵母菌、霉菌、細菌和藻類等微生物在生長代謝過程中，可以利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源、氮源、輔以無機鹽產(chǎn)生并儲存油脂，且微生物具有生長快、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)易于管理等優(yōu)點，已成為獲取油脂的重要途徑。但是，目前可用于開發(fā)的產(chǎn)不飽和脂肪酸的微生物種類偏少，能高產(chǎn)的菌株更是少之又少。因此，迫切需要不斷篩選產(chǎn)不飽和脂肪酸微生物，尤其是從特殊生境中尋找。

海洋由于其環(huán)境的特殊性與多變性，賦予了海洋微生物不僅在種類豐富，而且在基因組成和功能上也具有其自身的特殊性。因此是獲取產(chǎn)量高、組成成份特殊優(yōu)良菌株的重要來源。南海作為中國最廣闊的海域，屬于熱帶海洋性季風(fēng)氣候，以往的研究表明，這里蘊藏著豐富的微生物資源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株產(chǎn)不飽和脂肪酸的變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17。

本發(fā)明同時提供變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17在產(chǎn)不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用選擇性培養(yǎng)基及蘇丹黑染色方法，從南海徐聞海域馬尾藻中篩選高產(chǎn)油脂真菌，并對高產(chǎn)菌株進行鑒定及油脂組成氣相色譜法分析(gc)檢測，為該菌株產(chǎn)油脂的開發(fā)與利用提供一定的參考依據(jù)。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一株產(chǎn)不飽和脂肪酸的變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17，所述變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno：m2016757。

所述變紅鐮孢菌fusariumincarnatuma17的its基因序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明同時保護上述變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17在產(chǎn)不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。

本發(fā)明同時提供一種產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法，包括如下步驟：

s1.將變紅鐮孢菌fusariumincarnatuma17接種于種子培養(yǎng)基中，發(fā)酵得到種子液；

s2.將s1中種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；

s3.將s2中經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)的物質(zhì)離心，去除上清液，收集濕菌體，干燥后得到干菌體；

s4.將s3中干菌體加入鹽酸浸泡，水浴后，冷卻，加入三氯甲烷，震蕩，離心去有機層，加入氯化鈉溶液，再次離心，收集不飽和脂肪酸；

所述變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno：m2016757。

優(yōu)選地，所述s1中發(fā)酵為在180r/min搖床震蕩，28℃連續(xù)培養(yǎng)2天。

優(yōu)選地，s2中將種子液按4～6％的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。

優(yōu)選地，s1中所述種子培養(yǎng)基的配置為：將馬鈴薯200g，葡萄糖20g加入蒸餾水1000ml中。

優(yōu)選地，s2中發(fā)酵培養(yǎng)基的配置為：將葡萄糖150g，酵母膏0.5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸銨2g，檸檬酸鈉0.1g，硫酸鋅2g和蒸餾水1000ml混合，ph值為5.8。

優(yōu)選地，s2中發(fā)酵培養(yǎng)的條件為在180r/min搖床震蕩，28℃連續(xù)發(fā)酵5天。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

本發(fā)明提供了一株a17菌株，其代謝產(chǎn)物中不飽和脂肪酸含量高達60.76％，其中主要的成分是油酸和亞油酸。其開發(fā)和利用價值高，應(yīng)用前景可觀。

附圖說明

圖1為蘇丹黑染色篩選產(chǎn)油脂菌株。

圖2為菌株a17的菌落的形態(tài)。

圖3為菌株a17的顯微形態(tài)。

圖4為菌株a17的系統(tǒng)進化樹。

圖5為標準樣品gc譜圖。

圖6為菌株a17代謝產(chǎn)物油脂氣質(zhì)色譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例和附圖對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制。

除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

實施例1：

1、菌株來源與培養(yǎng)基

全緣馬尾藻采集于廣東湛江徐聞縣海域，裝入無菌袋中，低溫送至實驗室。

所用的主要試劑和儀器為：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(pda)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；種子培養(yǎng)基(g/l)：將馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加入蒸餾水1000ml中；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖150，酵母膏0.5，磷酸二氫鉀2，硫酸銨2，檸檬酸鈉0.1，蒸餾水1000ml，ph值5.8。itspcr擴增采用通用引its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。mghtyampdnapolymerasever.2與2×mightyampbufferver購自生物工程(大連)有限公司；蘇丹黑購于上海邁坤化工有限公司。

2、全緣馬尾藻共附生真菌的分離

取新鮮全緣馬尾藻10g，用無菌海水震搖30min后10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)濃度的稀釋液0.1ml均勻涂布于pda平板，28℃培養(yǎng)3d，挑取形態(tài)不同的菌落進行純培養(yǎng)。將純化好的菌株斜面保存，同時保存在20％的甘油中，-20℃保存，備用。

3、產(chǎn)油脂菌的篩選

采用蘇丹黑染色法對分離純化的菌株進行產(chǎn)脂菌的篩選，挑取少許菌涂片固定，用0.3％蘇丹黑染色15min，二甲苯?jīng)_洗，洗脫液無色后再用番紅復(fù)染，水洗干燥后顯微鏡觀察，若油脂粒呈藍黑色，菌體呈紅色的為產(chǎn)油脂菌。

菌株分離結(jié)果：

采用pda培養(yǎng)基平板對徐聞馬尾藻進行菌株分離，共篩選到17株菌株。其中菌株a2、a5、a8、a9、a11、a16及a17經(jīng)蘇丹黑染色均不同程度出現(xiàn)藍黑色，表明為產(chǎn)油脂菌株，而菌株a17著色最深、黑色脂粒最大且較密集，是7株菌中產(chǎn)油脂最高的一株菌(圖1)。

4、菌株a17鑒定

4.1形態(tài)學(xué)鑒定：參考《常見與常用真菌》方法，對目標菌株進行菌落、顯微形態(tài)等進行觀察鑒定。

在pda培養(yǎng)基生長，菌落擴展速度，5d后可達6.1cm，氣生菌絲棉絮狀，初期白色至淡粉紅色，菌落背面粉色，后期菌落變?yōu)闇\駝色至褐色，基物表面茶褐色，菌落背面深褐色(如圖2所示)。

對合成低營養(yǎng)瓊脂(sna)培養(yǎng)基上生長7d的孢子進行鏡檢，結(jié)果表明，氣生菌絲上產(chǎn)生的大小孢子之間沒有明顯的界限，大型分生孢子鐮刀形、紡錘形，彎曲而近于直，較寬，頂端細胞彎曲(圖3，a)。厚壁孢子稀少，呈球形，壁光滑，單頂生或串生于菌絲中間(圖3，b、c)，鑒定結(jié)果與booth，孔華忠對變紅鐮孢(fusariumincarnatum)的形態(tài)學(xué)描述一致。

4.2itsdna序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹建立：采用真菌its擴增通用引物its1、its4作為正、反向引物，使用mightyampdnapolymerase進行菌落pcr，pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)條件按照如下方法：pcr反應(yīng)體系(30ul)：用接種針挑取少量單菌落，2×mightyampbuffer15μl，mightyampdnapolymerase0.75μl，its1(10μmol/μl)0.75μl，its4(10μmol/μl)0.75μl，ddh2o12.75μl。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性2min；98℃變性10sec，55℃退火15sec，68℃延伸1.5min，40個循環(huán)；10℃保存10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，將確認的目標產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

根據(jù)測得的its基因序列，從cbs和nrrl數(shù)據(jù)庫進行同源性搜索，下載相似性高的模式菌株的相應(yīng)基因序列，用maxiumlikelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap的方法統(tǒng)計所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性。

菌株a17的its基因序列與親緣關(guān)系較近的已知菌序列進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖4所示)，發(fā)現(xiàn)菌株a17的位置是在fusariumincarnatum-equisetispeciescomplex這個復(fù)合種里，根據(jù)形態(tài)與分子鑒定結(jié)果，確定菌株為變紅鐮孢(fusariumincarnatum)。

變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17于2016年12月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏編號為cctccno：m2016757，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)校內(nèi)。其its基因序列如seqidno：1所示。

實施例2:菌株產(chǎn)油脂gc分析

將目標菌變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、180r/min搖瓶發(fā)酵5d后，將發(fā)酵液于5000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，去除上清液，收集濕菌體，稱取菌絲體的質(zhì)量，于80℃恒溫烘箱烘干至恒量，得到干菌體。

準確稱取0.5g干菌體，加入6mol/l濃度鹽酸混合均勻浸泡1h，再用沸水處理5min，-20℃快速冷卻20min，加入10ml三氯甲烷-甲醇溶液(體積比1∶1)，放入搖床震蕩20min，3000r/min離心15min，吸取三氯甲烷層，加入等體積0.1％氯化鈉溶液，混勻，3000r/min離心15min，再收集三氯甲烷層并水浴揮發(fā)三氯甲烷層。

油脂甲酯化處理：將上述0.5g干菌體提取的油脂，加入0.6mol/l氫氧化鉀-甲醇溶液2ml和正己烷2ml后，劇烈震蕩2min，在30℃放置15min，加入蒸餾水5ml，靜置分層，取正己烷層分析脂肪酸組成與含量。

gc條件：氣相色譜儀agilent7820；氣相色譜柱為hp88(安捷倫，60mm×0.25mm×0.25μm)；流速0.8ml/min，分流比10:1進樣量1μl程序升溫：初始溫度，100℃，保持2min，以10℃/min升至150℃，再以2℃/min升溫至220℃，保持2min，再以10℃/min升溫至230℃，保持1min；載氣為氦氣，流速0.8ml/min，分流比10:1，進樣量1μl。

菌株a17代謝產(chǎn)物提取的油脂經(jīng)甲酯化后的gc分析(圖6)，共出現(xiàn)16個有效峰，根據(jù)與混標出峰時間作比較(圖5)，檢測到6種不飽和脂肪酸，含量占總油脂的60.76％，其中以c18不飽和脂肪酸的油酸與亞油酸為主，分別占總油脂的32.80％、26.20％(見表1)。同時，檢測到含量占總油脂39.07％的10種飽和脂肪酸，其中棕櫚酸與硬脂酸占36.10％。

表1：變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17代謝產(chǎn)物油脂中各脂肪酸的含量

實施例3：不飽和脂肪酸液體發(fā)酵

1.種子液制備

挑取斜面變紅鐮孢菌(fusariumincarnatum)a17于種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基(g/l)：馬鈴薯200，葡萄糖20。180r/min搖床震蕩，28℃連續(xù)培養(yǎng)2d。

2.不飽和脂肪酸液體發(fā)酵

按接種量5％的比例將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖150，酵母膏0.5，磷酸二氫鉀2，硫酸銨2，檸檬酸鈉0.1，硫酸鋅2，蒸餾水1000ml，ph值5.8以上。180r/min搖床震蕩，28℃連續(xù)下在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d。

3菌體收集

將上述發(fā)酵好的培養(yǎng)物于5000r/min，離心15min，去除上清液，收集濕菌體，于80℃恒溫烘箱烘干至恒量，計算生物量(g/l)，按公式(1)。

本實驗結(jié)果從發(fā)酵液中移取15ml菌液，烘干后得到干菌質(zhì)量0.77g，

2、油脂的提取

參照實施例2中菌株產(chǎn)油脂的方法，將再收集三氯甲烷層并水浴揮發(fā)三氯甲烷層后得到的油脂進行含量計算。計算公式如式(2)。

本實驗中稱取0.77g干菌提出油脂0.088g。

sequencelisting

<110>廣東海洋大學(xué)

<120>一株產(chǎn)不飽和脂肪酸的變紅鐮孢菌（fusariumincarnatum）a17

<130>

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>574

<212>dna

<213>a17

<400>1

tgggaggtaaaaaaacgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccg60

agtttacaactcccaaacccctgtgaacatacctatacgttgcctcggcggatcagcccg120

cgccccgtaaaacgggacggcccgcccgaggaccctaaactctgtttttagtggaacttc180

tgagtaaaacaaacaaataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcg240

atgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcga300

atctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcat360

ttcaaccctcaagctcagcttggtgttgggactcgcggtaacccgcgttccccaaatcga420

ttggcggtcacgtcgagcttccatagcgtagtaatcatacacctcgttactggtaatcgt480

cgcggccacgccgttaaaccccaacttctgaatgttgacctcggatcaggtaggaatacc540

cgctgaacttaagcatatcaaaaggcgggagaaa574

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>its1

<400>2

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>its4

<400>3

tcctccgcttattgatatgc20