本發(fā)明涉及dna測序技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種基于焦磷酸測序的dna測序裝置的控制系統(tǒng)及控制方法，屬于基因檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

一、焦磷酸測序概況

焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencing)是于1987年發(fā)展起來的、基于dna合成過程中釋放的焦磷酸(ppi)檢測的測序技術(shù)，焦磷酸測序反應(yīng)在一系列酶的催化作用下的，其過程中會產(chǎn)生與脫氧三磷酸核苷(dntp)的聚合數(shù)目成比例的可見光，通過對可見光檢測可達到測定dna序列的目的。焦磷酸測序有兩種實現(xiàn)方法：液相焦磷酸測序法(liquidphasepyrosequencing)和固相焦磷酸測序法(solidphasepyrosequencing)。

液相焦磷酸測序是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，其原理是：引物與模板dna退火后，在dna聚合酶(dnapolymerase)、atp硫酸化酶(atpsμlfurylase)、熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(apyrase)協(xié)同作用下，將引物dna上每一個dntp的聚合與熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定dna序列的目的(馬永平等，焦磷酸測序技術(shù)及其在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[j].國外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊2003，25(2):115-117)。

液相焦磷酸測序的反應(yīng)體系由反應(yīng)底物、待測單鏈、特異性測序引物和酶構(gòu)成，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(aps)和熒光素(1uciferin)。液相焦磷酸測序反應(yīng)過程是一個向反應(yīng)體系中輪流加入4種dntp參與反應(yīng)的過程，每輪反應(yīng)只有一種dntp參加。如果加入的dntp剛好能和dna模板的下一個堿基配對，則其在dna聚合酶的作用下被添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(ppi)；在atp硫酸化酶的作用下，生成的ppi和aps結(jié)合形成atp；在熒光素酶的作用下，生成的atp又和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時產(chǎn)生可見光。如果加入的這種dntp剛好能和dna模板的下面連續(xù)n個相同堿基匹配，根據(jù)反應(yīng)方程式可知，釋放出的可見光強度應(yīng)是只有1個堿基匹配時的n倍，也即反應(yīng)過程中釋放的光強度與相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。如果加入的dntp和dna模板的下一個堿基不匹配，則上述反應(yīng)不會發(fā)生，也沒有可見光的釋放。未參加反應(yīng)的dntp和atp在核苷酸降解酶apyrase的作用下降解。

每輪反應(yīng)釋放出的可見光通過微弱光檢測裝置轉(zhuǎn)化，再被處理為數(shù)字信號，經(jīng)pc軟件處理即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低應(yīng)和相匹配的堿基數(shù)目成比例關(guān)系。

待上一輪反應(yīng)結(jié)束后，加入另一種dntp，重復(fù)進行上述反應(yīng)。最終可根據(jù)獲得的光強度峰值圖即可讀取的待測dna序列信息。

需要注意的是：datp的降解產(chǎn)物脫氧單磷酸鳥苷(damp)是熒光素酶的抑制劑，隨著反應(yīng)的進行，其濃度會越來越高，會阻礙焦磷酸測序化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的繼續(xù)進行。這也是焦磷酸測序法測序長度較短(通常為20bp～30bp)的主要原因(shendurej，eta1.advancedsequencingtechnologies:methodsandgoals，nat.revgenet.，2004，5(5):335-44)。

固相焦磷酸測序是由3種酶催化的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與液相焦磷酸測序相比，沒有三磷酸腺苷雙磷酸酶參加。固相焦磷酸測序反應(yīng)過程如下：結(jié)合了引物的dna模板被固定于支撐物上并在反應(yīng)過程中保持位置不變；加入一種dntp后，在dna聚合酶、atp硫酸化酶和熒光素酶協(xié)同作用下發(fā)生反應(yīng)，除了沒有降解反應(yīng)發(fā)生，其他反應(yīng)與液相焦磷酸測序完全相同；在加入下一種dntp前有一個沖洗步驟(washingstep)將上輪反應(yīng)殘留物完全沖走，不會有抑制性產(chǎn)物的堆積。

通常情況下，人們所說的焦磷酸測序法指的是液相焦磷酸測序法，因為其四酶反應(yīng)系統(tǒng)使得焦磷酸測序可以很方便地在單管中實現(xiàn)。

ronaghi等利用datpαs替代datp提高焦磷酸測序的信噪比(ronaghim.eta1.real-timednasequencingusingdetectionofppirelease；anal.biochem，1996，242(1):84-89)。因為datpαs可以比datp被dna聚合酶更有效地利用，更有利于閱讀富含t的區(qū)域。datpαs是兩種異構(gòu)體sp-datpαs和rp-datpαs的混合物，聚合酶只能利用sp-datpαs。為了得到最佳反應(yīng)效率，必須在反應(yīng)體系中保持最佳濃度的sp-datpαs，與此同時rp-datpαs的濃度也在增加。datpαs被apyrase降解后仍會產(chǎn)生熒光素酶的抑制物，因此datpαs的加入并沒有提高讀序能力。

gharizadeh等人對此進行了改進，他們在反應(yīng)中只加入純的sp-datpαs，而不加入無用的rp-datpαs，提高了反應(yīng)的效率，大大降低了抑制產(chǎn)物的濃度，使得熒光素酶能夠維持較長時間的活性，使焦磷酸測序法的測序長度增加到50bp～100bp，測序長度的增加也使得焦磷酸測序技術(shù)有了許多新的應(yīng)用(gharizadehb.etal.，long-readpyrosequencingusingpure2’-deoxyadenosine-5’-0’-(1-thiotriphosphate)sp-isomer；analbinchem，2002.301:82-90)。

在2000年舉辦的第十二屆基因組測序和分析會議(12thinternationalgenomesequencingandanalysisconference)上，ronaghi等人提出了一種移除抑制產(chǎn)物、減小稀釋效應(yīng)的方法，將測序長度增加到200bp。

與sanger雙脫氧鏈終止測序法相比，焦磷酸測序法具有快速、準確、經(jīng)濟、實時檢測的特點；它不需要凝膠電泳，也不需要對dna樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有很高的可重復(fù)性；能實現(xiàn)高度的并行性和高度的自動化。

二、焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用進展

1在單核苷酸多態(tài)性研究中的應(yīng)用

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，snps)是近年來出現(xiàn)的第三代遺傳標記，它指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體的頻率不小于1％。snps是生物的基因組中最為常見的遺傳多態(tài)型，它可以在任何一個待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標記；而正是這種基因組中的多態(tài)性，即基因組序列的差異構(gòu)成了不同個體與群體對疾病的易感性、對藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

snp的研究主要包括兩個方面：一是snp數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，主要是發(fā)現(xiàn)特定種類生物基因組的全部或部分snp。二是snp功能研究，發(fā)現(xiàn)snp只是snp研究的第一步，snp功能的研究才是snp研究的目的。sanger測序技術(shù)已成為大規(guī)模、準確、快速發(fā)現(xiàn)snp的主流技術(shù)。而對數(shù)據(jù)庫中已有snp進行序列驗證分析和頻率分析，擅長短序列測序和驗證的焦磷酸測序技術(shù)是很好的選擇，采用焦磷酸測序技術(shù)進行snp研究，更可以節(jié)約時間并降低消耗。

nordfors等分別采用taqman熒光定量法和焦磷酸測序技術(shù)對高達1022個樣本進行snp基因分型研究，獲得了相同的結(jié)果，此對照實驗表明焦磷酸測序技術(shù)是進行高通量、大樣本的snps的高效、高準確度的方法。wasson等利用焦磷酸測序技術(shù)來進行dna池(dnapools)的snp等位基因頻率分析。rickert等采用焦磷酸測序技術(shù)對4倍體馬鈴薯進行基因型研究，在對94個多態(tài)性位點檢測中，有76個等位基因位點可用焦磷酸測序技術(shù)鑒別，有效率達81％。蔣思文等利用焦磷酸測序技術(shù)進行了鑒別豬線粒體細胞色素b基因單倍型的工作。袁建林等利用焦磷酸測序技術(shù)進行hla-drb基因型分析研究，實驗表明，將焦磷酸測序結(jié)果與hla數(shù)據(jù)庫的基因序列比較后可準確進行基因分型，該方法可應(yīng)用于臨床器官移植的供體/受體篩查。

2在病原微生物快速鑒定中的應(yīng)用

jonasson等用焦磷酸測序技術(shù)檢測病原菌16srrna基因，快速鑒定出臨床標本中抗生素抵抗菌。monstein等用焦磷酸測序技術(shù)成功檢測幽門螺桿菌16srrna基因易變的v1和v3區(qū)序列，證明該技術(shù)可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型。unnerstad等利用該技術(shù)對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，利用焦磷酸測序技術(shù)在短時間內(nèi)完成大量的樣本測序，其并行性和高效率非常顯著。gharizadeh等用此技術(shù)對67個人乳頭瘤病毒樣品進行了鑒定和分型，證明該技術(shù)也非常適于hpv等病原體的大規(guī)模鑒定、分型和突變的研究。程紹輝等從感染人sars病毒的vero-6細胞中提取病毒rna，采用焦磷酸測序技術(shù)對多個堿基突變位點測序和突變頻率分析。通過測序分析多個可能出現(xiàn)突變的位點，確定了該病毒為北京流行株。

3在病因?qū)W研究中的應(yīng)用

kittles等利用焦磷酸測序技術(shù)，對尼日利亞人、歐洲裔美國人和非洲裔美國人三個不同種群的cypl7基因多態(tài)性進行分析，研究非洲裔美國人的cypl7基因多態(tài)性與前列腺癌之間的關(guān)系和臨床表現(xiàn)。研究結(jié)果表明，序列為cc的cypl7基因型的非洲裔美國人比序列為tt的cypl7基因型非洲裔美國人患前列腺癌的幾率要高，證明這類人群中的堿基為c的cypl7基因多態(tài)性與前列腺癌的發(fā)病率關(guān)系密切，為高危人群。眾多線索表明，位于染色體22q11的comt基因與精神分裂癥的發(fā)病存在重要聯(lián)系，而科學(xué)家的研究工作一直沒能提出有力的證據(jù)；shifman等提出了一種有效的方法，他們利用焦磷酸測序技術(shù)，對大樣本的德系猶太人群進行相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性分析，證實精神分裂癥的發(fā)生與cmot基因之間存在高度的關(guān)聯(lián)。這種方法也能適用于其他疾病的基因分析研究。

4在法醫(yī)鑒定中的應(yīng)用

用sanger測序法對線粒體dna(mtdna)變異分析，不能實現(xiàn)對由含有污染物、多個個體dna等組成的mtdna混合物的精確量化分析，而andreasson等提出了一種針對mtdna混合分析的基于焦磷酸測序技術(shù)的新穎的量化方法，可以很容易地從法庭證物混合樣本中快速、準確地檢測出主要的和次要的mtdna成分。balitzki-korte利用焦磷酸測序技術(shù)對線粒體12srrna基因進行測序分析，在149bp長度的基因片斷上進行長度為20bp的檢測，通過參考數(shù)據(jù)庫序列，就能夠充分確定對象的生物學(xué)起源，比如說，能夠確定一塊皮膚組織究竟是來自失蹤人員還是動物身上。

三、焦磷酸分析裝置及發(fā)展

焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用依賴于焦磷酸分析裝置的研究與開發(fā)。不論何種焦磷酸分析裝置，其主要結(jié)構(gòu)都應(yīng)包含兩個部分：反應(yīng)器部分和微弱光檢測部分。反應(yīng)器提供反應(yīng)進行的場所，微弱光檢測部分負責檢測反應(yīng)發(fā)出的可見光。在人們對焦磷酸測序技術(shù)的研究和應(yīng)用過程中，設(shè)計和使用的反應(yīng)器主要可以分為3類：微量板反應(yīng)器、微流控芯片反應(yīng)器和微陣列芯片反應(yīng)器。

而商業(yè)化的焦磷酸測序儀在國外已面世，然而國內(nèi)相關(guān)儀器本身研究的報道甚少，更無相應(yīng)的產(chǎn)品問世。國外產(chǎn)品的一個典型代表是pyrosequencingab公司的psq96，它是該公司2001年推出的產(chǎn)品，系統(tǒng)能夠同時進行96路或者384路dna樣本的獨立測序，當測序長度不超過300bp時一般所用時間在1小時45分鐘，準確性和可靠性達到99％，具有高通量、快速、經(jīng)濟的優(yōu)勢。psq96系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床分子診斷當中。

國外儀器研究另外一個代表是美國454lifescience公司2005年推出的genomesequencer20(gs20)。它走向了有著更高技術(shù)含量的微型化方向，即利用mems技術(shù)將微濾腔作為焦磷酸測序反應(yīng)的反應(yīng)環(huán)境，將驚人的上百萬數(shù)目的反應(yīng)陣列集成進7cm×8cm的面積內(nèi)，并使每個反應(yīng)艙能獨立同時進行測序級聯(lián)反應(yīng)，儀器具有的高靈敏度和分辨率的ccd能夠捕捉到每個單反應(yīng)艙產(chǎn)生的微弱熒光信號，最終能夠得到每個標本dna的序列信息。gs20僅需4.5個小時即可實現(xiàn)高密度測序反應(yīng)，經(jīng)過并行計算得到每個標本的序列信息。優(yōu)點是可以節(jié)省反應(yīng)試劑的消耗，降低測序成本，為基因組大規(guī)模測序提供可能。

目前國內(nèi)的儀器研究剛剛起步，國產(chǎn)化的道路漫長，面對方方面面的問題，在權(quán)衡測序系統(tǒng)所需要的各種硬件條件后，發(fā)現(xiàn)首要面對的問題和挑戰(zhàn)是微量加樣子系統(tǒng)的研制問題。

四、焦磷酸測序中加樣系統(tǒng)的重要性

焦磷酸測序技術(shù)及其產(chǎn)品為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態(tài)性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術(shù)操作平臺，是后基因組時代進行基因序列分析研究的有力工具。焦磷酸測序技術(shù)正被越來越多的研究人員接受和采用，隨著國際上焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用的興起和商品化焦磷酸測序儀器的發(fā)展，我國的焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用方興未艾。但是在現(xiàn)階段，國內(nèi)焦磷酸測序技術(shù)的應(yīng)用和推廣存在幾個制約因素：(1)現(xiàn)有的商品化焦磷酸測序儀器如psq96、gs20價格昂貴；(2)商業(yè)化的焦磷酸測序服務(wù)等待時間長且很不方便；(3)雖然目前有些實驗室在進行諸如焦磷酸測序芯片等裝置的研究，一些實驗室有自制的、結(jié)構(gòu)簡單的焦磷酸測序試驗裝置，但國內(nèi)沒有面向低端的、價格便宜的、商品化的基于焦磷酸測序技術(shù)的序列檢測儀器，是制約焦磷酸測序技術(shù)應(yīng)用發(fā)展的關(guān)鍵問題。

焦磷酸測序系統(tǒng)是在微量環(huán)境中進行的，通常反應(yīng)體系僅在50μl，所需的反應(yīng)底物、dna模板以及脫氧核苷酸等試劑的量非常微?。煌瑫r，單次加樣量的多少直接影響循環(huán)反應(yīng)的可持續(xù)性，過大的單次加樣量會使反應(yīng)溶液體積迅速變大，因此造成模板濃度下降過快。由于擴散作用產(chǎn)生的反應(yīng)延遲非線性增加，得到的微弱熒光信號在時間軸上延伸，強度在縱坐標上降低，最終導(dǎo)致嚴重縮短核酸的可測序長度。一般認為由于后續(xù)加樣造成的反應(yīng)體系增加如果在10％之內(nèi)，對實驗結(jié)果的影響是在可以接受的范圍內(nèi)。假如要對一段20bp長度的dna片斷進行測序，那么在50μl的反應(yīng)體系中，允許的單次加樣量只能不超過0.3μl。

此外，除了加樣精度，加樣間隔的時間準確性也同樣重要。只有在等時間間隔內(nèi)加入單循環(huán)所需的dntp，才能使每次的殘留dntp的降解程度相當，那么對下次反應(yīng)造成的影響也將相等。等時間段才能給每個周期的信號提供基準，便于后續(xù)根據(jù)熒光信號強度計算核苷酸結(jié)合數(shù)目的自動化分析。

雖然國產(chǎn)化的加樣設(shè)備已比較豐富，但是國內(nèi)現(xiàn)有的微量加樣裝置都有不足。比如上海復(fù)日的加樣平臺，作為大型自動化樣本池處理設(shè)備，能夠進行標準96孔板的加樣、振蕩、清洗工作，但是這套系統(tǒng)由于噴嘴加工工藝的限制，加樣微精度最小只有1μl，無法滿足焦磷酸測序要求的nl級別。經(jīng)過調(diào)研，限制于國內(nèi)應(yīng)用和制造水平，國產(chǎn)化的加樣裝置都無法滿足焦磷酸測序中對加樣量以及重復(fù)精度的高要求。

東南大學(xué)葛健徽等公開了一種以微弱光檢測模塊和微量dntp加樣模塊為關(guān)鍵模塊的液相焦磷酸分析裝置，其中公開了一氣壓控制微量dntp加樣模塊，可實現(xiàn)96路dntp溶液的同時加樣，最小加樣量為1.2μl，最大誤差為13％；但信號噪聲較大，仍需更一步改進(葛健徽等，基于焦磷酸測序的基因檢測裝置的研制，東南大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2006)。

王春林等公開了一種采用壓電陶瓷噴頭的焦磷酸核酸測序儀中微量加樣系統(tǒng)，該可以在步進電機驅(qū)動下，對96孔標準板樣本分別進行4種dntp試劑的輪流加樣，加樣重復(fù)精度大于95％，單次加樣最小量能達到0.lμl。上述兩類較佳的焦磷酸核酸測序儀中所用的微量加樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，且加樣針易堵，dntp通過不同的方式噴入測序反應(yīng)液內(nèi)并不與反應(yīng)液接觸使得與反應(yīng)液混合不充分反應(yīng)不完全，對dntp要求量也較高且數(shù)據(jù)易不準確；此外，拆裝麻煩，成本高且不利于特殊條件下應(yīng)用。

焦磷酸測序(preosequencing)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的dna序列分析技術(shù)，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進行檢測。是一個理想的遺傳分析技術(shù)平臺，既可進行dna序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性(snp)檢測及等位基因頻率測定等，該項技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物等各個領(lǐng)域。

焦磷酸測序是由dna聚合酶(dnapolymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(atpsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine5’phosphosulfate，aps)和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測序dna單鏈和測序引物。在每一輪測序反應(yīng)中，加入1種dntp，若該dntp與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(ppi)。硫酸化酶催化asp和ppi形成atp，后者驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與atp量成正比的可見光信號，并由pyrogram^tm轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加入dntp類型和熒光信號強度就可實時記錄模板dna的核苷酸序列。在實驗過程中用α-硫化的三磷酸腺苷(datpαs)代替三磷酸腺苷(datp)以有效地被dna聚合酶利用，而不被蟲熒光素識別。由于spdatpαs可以降低datpαs降解產(chǎn)物的濃度，近年來，單鏈dna結(jié)合蛋白(singlestarnddnabindingportein，ssbp)和純化spisomerdatpas的使用datpαs降解產(chǎn)物抑制雙磷酸酶活性的這一問題得到較好解決，使得測序長度可達10bp，拓展了該技術(shù)在遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

焦磷酸測序中，通過使用階段性互補鏈合成反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，檢測發(fā)光，從而來確定dna序列。將含有由互補鏈合成產(chǎn)生的焦磷酸和剩余的核酸底物的反應(yīng)液從而進行互補鏈合成的反應(yīng)槽移動到另外的反應(yīng)槽，進行發(fā)光反應(yīng)，并在反應(yīng)液移動的過程中通過固定有分解剩余的核酸底物的酶的區(qū)域，將剩余的核酸底物分解后，使焦磷酸轉(zhuǎn)化為atp，導(dǎo)入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)槽。但現(xiàn)有技術(shù)的弊端是必須加入大量的底物和酶進行反應(yīng)，以保證反應(yīng)可以完全進行，之后需要再反應(yīng)掉多余的底物后清洗，這不僅增加了反應(yīng)過程，增大了每一步的清洗及反應(yīng)難度，還會對底物等試劑造成很嚴重的浪費，反應(yīng)時間長，浪費人力物力，無形中降低了焦磷酸測序在市場中的推廣和使用潛力。

目前應(yīng)用于焦磷酸測序的儀器多為部分廠家壟斷制造和銷售，儀器與試劑均為配套銷售，測序時成本十分昂貴，檢測維修過程均需依賴于特定的技術(shù)人員，周期長成本高，反應(yīng)所需的體積較大，更加大了反應(yīng)的成本，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)精度低。因此設(shè)計自主研發(fā)開發(fā)一款適用于焦磷酸測序的dna測序儀是十分有必要的。

五、dna單鏈分離技術(shù)概況

dna單鏈分離技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最常見的分離技術(shù)之一，適用于不同核酸樣品的dna各種規(guī)模測序及探針設(shè)備，廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、動植物學(xué)、農(nóng)牧業(yè)、食品與衛(wèi)生、能源與化工、環(huán)境監(jiān)測以及醫(yī)學(xué)診斷與檢測等領(lǐng)域。此外，dna單鏈的吸附、提取與分離技術(shù)在水質(zhì)、水源、生物材料、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、淚液、汗液、消化液、精液、分泌液、組織液、嘔吐物、糞便)、組織/細胞和微生物裂解液、不同來源的蛋白、核酸等生物、化學(xué)分子以及藥物等的分析檢測、分離和純化以及寡核苷酸、多肽、先導(dǎo)化合物和藥物的合成等方面被廣為應(yīng)用，與人們的日常生活息息相關(guān)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有舉足輕重的地位。

生物醫(yī)藥領(lǐng)域中常用的dna單鏈分離方法并存在的不足如下：

1.熱變性或堿處理。該種方法主要是將雙鏈pcr產(chǎn)物進行加熱或堿處理，由于dna雙鏈在高溫或一定程度的堿性環(huán)境下氫鍵會斷裂，使得dna變?yōu)閱捂?。雖然該種方法原理可行，操作簡單，但該種方法由于其分離率和純度較低而逐漸不作為單鏈dna的純化，多用于dna的雙鏈分離。

2.t7逆轉(zhuǎn)錄法。該種方法是在一條pcr引物5’端加上t7啟動子，以純化pcr擴增產(chǎn)物為模板，用t7rna聚合酶體外逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈rna(hughes,et.al.,nat.biotechnol.,2001,19:342-347)。該種方法雖然原理可行，dna單鏈分離率較高，且獲得的dna單鏈純度較高，但整個分離過程需分為兩大步驟完成，操作不便，時間較長，而且需嚴格控制rna酶的污染，故具有一定的局限性。

3.核酸外切酶法(higuchiandochman,nucleic.acidsres.,1989,17:5865)。由于一條pcr引物被磷酸化，pcr產(chǎn)物在用核酸外切酶消化時，被磷酸化的引物擴增鏈不被切割，消化后酶被加熱滅活。該種方法也需純化pcr產(chǎn)物，分離程序冗長，操作亦十分不便，而且dna單鏈獲得率依賴于外切酶的活性，不可控因素過強，實驗結(jié)果的穩(wěn)定性不夠；因此，該種方法的推行率不廣，通用性不高。

4.變性高效液相色譜法(denaturinghigh-performanceliquidchromatography，dhplc)。在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發(fā)現(xiàn)dna突變。異源dna雙鏈與同源dna雙鏈的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于一條pcr引物被生物素標記，其pcr擴增鏈在dhplc時，會與另一條普通鏈分開(dickmanandhornby,anal.biochem.,2000,284:164-167)。該方法可以在15min內(nèi)直接從雙鏈pcr產(chǎn)物中獲得所需的dna單鏈，但該種方法的實施需要配套十分昂貴的儀器，故始終難以普及。

5.磁珠捕獲法。運用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的dna和rna分離出來，然后用naoh處理得到目標單鏈。該種方法操作簡單、用時短，整個提取流程分為四步，大多可以在36-40分鐘內(nèi)完成，且安全無毒，不使用傳統(tǒng)方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對實驗操作人員的傷害減少，符合現(xiàn)代環(huán)保理念，磁珠與dna單鏈的特異性結(jié)合使得提取的dna單鏈純度高、濃度大，但該種方法中使用的包被磁珠較為昂貴，且需要依靠磁力架分離，不僅分離成本較高，還不方便，故在一定程度上限制了該技術(shù)的推廣。

6.不對稱pcr。以上方法均需在pcr后進行額外的處理，而不對稱pcr可在pcr擴增的同時制備dna單鏈。常規(guī)不對稱pcr使用兩條不等量的引物，在開始的循環(huán)里進行正常擴增。隨著循環(huán)的增加，量少的引物被逐漸耗盡，而超量的引物可繼續(xù)直線擴增生成dna單鏈(gyllenstenanderlich,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,1988,85:7652-7656)。該種方法具有較高的雜交靈敏度和特異性，且操作簡便性更強，但其引物的比例需要優(yōu)化，而且非特異擴增的機會增加，此外，dna單鏈分離過程需要依靠電泳，分離程序復(fù)雜，且電泳時?？梢姀浬l帶，其耗時和不便是顯而易見的。

上述幾種分離方法均具有一定的局限性，因此，為了滿足對dna單鏈分離的可操作性及經(jīng)濟性要求，現(xiàn)有技術(shù)中的dna單鏈采用的是集成化的提取工作站，將帶有鏈親和素的親和連接體與dna雙鏈結(jié)合，工作站具有抽濾針及配套的泵，結(jié)合后的dna親和連接體通過抽濾吸附在抽濾針內(nèi)濾膜下部，工作站配有軌道及相關(guān)系統(tǒng)，抽濾結(jié)束后將抽濾針移至盛有naoh的盤中，通過堿處理解雙螺旋，得到dna單鏈，再次抽濾后清洗收集。抽濾針一般24根(4*6)為一組，使用時必須保證有足夠量的樣品或試劑以保證工作站的正常運行，因此這種dna單鏈的收集方式十分的不靈活，只能以固定量加入工作站進行工作，且大量的損失在多次的抽濾及轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生，這對微量收集十分不利，并且抽濾針組需要同時進行工作，這對工作站各部件都具有一定的體積要求，整個工作站占用空間很大。龐大的系統(tǒng)使得在dna單鏈分離操作過程中，微分離柱需要來回反復(fù)移液，操作十分繁瑣，不僅分離周期長、效率低，且整體設(shè)備價格較貴，導(dǎo)致dna單鏈分離的費用高，還需要耗費大量的試劑及其他資源，極不經(jīng)濟。此外，該工作站中抽濾針為金屬材質(zhì)，價格昂貴，往往是處理后再重復(fù)使用，故易導(dǎo)致殘留物之間的交叉污染，可靠性不高，對分離及檢測結(jié)果的準確性均會造成一定的干擾和影響。且溶液抽取過程中會有部分殘余溶液貼壁，使得一定量的目的dna單鏈不能被微分離柱吸附，導(dǎo)致獲得的dna單鏈比例降低，影響了分離率，造成了浪費。因此，用于焦磷酸測序的高質(zhì)量高效率的dna單鏈分離問題亟待解決。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、快速檢測的dna測序裝置的控制系統(tǒng)及控制方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種dna測序裝置的控制系統(tǒng)，所述測序裝置包括設(shè)有多個過濾柱的可旋轉(zhuǎn)的分離盤；設(shè)有四個槽位的dntp試劑槽；固定設(shè)有多個加樣針的加樣架；用于支撐所述加樣架移動的直線導(dǎo)軌；用于加樣架轉(zhuǎn)動的轉(zhuǎn)軸；用于帶動加樣架上下移動的直線導(dǎo)軌；設(shè)有多個槽位的反應(yīng)槽；用于采集每個槽位光信號的ccd相機；以及用于ccd相機轉(zhuǎn)動的轉(zhuǎn)盤；所述控制系統(tǒng)包括plc以及與plc連接并通過plc操作的光控制系統(tǒng)、位置控制系統(tǒng)、環(huán)境控制系統(tǒng)、流量控制系統(tǒng)和驅(qū)動控制系統(tǒng)；

所述光控制系統(tǒng)用于控制ccd相機的開或關(guān)；

所述位置控制系統(tǒng)包括多個位置傳感器，通過位置傳感器的信號控制加樣架的轉(zhuǎn)動角度、移動位置，以及ccd相機的轉(zhuǎn)動角度；

所述環(huán)境控制系統(tǒng)包括位于反應(yīng)槽內(nèi)的溫度傳感器和加熱器；用于檢測溶液ph值的ph計；

所述流量控制系統(tǒng)包括總管道；與總管道一端連通且通向各部件的分管道；與總管道另一端連通的試劑管道；以及與總管道中段連通的溶液管道；所有管道都設(shè)有閥門；所述總管道上設(shè)有蠕動泵；

所述驅(qū)動控制系統(tǒng)包括用于驅(qū)動分離盤轉(zhuǎn)動的電機；用于驅(qū)動轉(zhuǎn)軸的電機；用于驅(qū)動ccd相機轉(zhuǎn)盤的電機。

作為上述技術(shù)方案的進一步改進：

優(yōu)選地，所述試劑管道包括datp管、dctp管、dgtp管、dttp管、dna聚合酶、熒光素管、atp管、aps管、緩沖液管和apyrase管，所述溶液管道為緩沖液管和水管。

優(yōu)選地，所述總管道靠近分管道處設(shè)有除泡器。

優(yōu)選地，所述試劑管道與一個第一多通換向閥的進口連接，所述第一多通換向閥具有十個進口和一個出口；所述總管道與分管道之間設(shè)有第二多通換向閥，所述第二多通換向閥具有一個進口和多個出口，所述緩沖液管和水管分別與第三多通換向閥的進口連接，所述第三多通換向閥具有兩個進口和一個出口。

優(yōu)選地，所述總管道靠近第一多通換向閥處設(shè)有第一蠕動泵，所述第三多通換向閥與總管道之間設(shè)有第二蠕動泵。

優(yōu)選地，所述第一多通換向閥還具有一個備用的進口。

本發(fā)明的目的還在于提供了上述控制系統(tǒng)的控制方法，包括以下步驟：

s1、開啟所述第一蠕動泵，依次開啟所述第一多通換向閥的進口，開啟所述第二多通換向閥中通向dntp試劑槽的分管道，將dntp試劑槽的四個槽位加入一定量的試劑；

s2、驅(qū)動所述分離盤旋轉(zhuǎn)進行離心處理，過濾擴增、結(jié)合后的dna雙鏈，得到待測dna單鏈；

s3、開啟第二蠕動泵，開啟所述第三多通換向閥的水管或緩沖液管進口，開啟所述第二多通換向閥中通向過濾柱的分管道；用水或緩沖液清洗平衡ph值，至dna單鏈完全懸?。?/p>

s4、開啟所述第一蠕動泵，依次開啟所述第一多通換向閥的進口，開啟所述第二多通換向閥中通向反應(yīng)槽的分管道，將熒光素和aps注入反應(yīng)槽內(nèi)；

s5、驅(qū)動加樣架移動、轉(zhuǎn)動，使加樣針蘸取任意一種dntp試劑，并加入到測序反應(yīng)液中，再使所述加樣針41離開所述測序反應(yīng)液；

s6、開啟第二蠕動泵，開啟所述第三多通換向閥的水管進口，清洗加樣針；

s7、開啟第一蠕動泵，根據(jù)設(shè)置依次開啟所述第一多通換向閥的進口，開啟所述第二多通換向閥中通向反應(yīng)槽的分管道，依次加入dna聚合酶、atp硫酸化酶和核苷酸降解酶apyrase；

s8、4種dntp試劑任意或多個依待測序列而定以何種順序加入測序反應(yīng)液中，進行步驟s9或者重復(fù)步驟s5、s6和s7；

s9、控制ccd相機拍照，并通過plc呈現(xiàn)檢測的譜圖。

上述控制方法中，優(yōu)選地，在所述步驟s7中，在抽取任意一種試劑后，開啟所述第一蠕動泵，使所述第一多通換向閥的進口與盛放緩沖液的一個試劑瓶連通，用于抽取緩沖液形成位于相鄰的兩種試劑之間的液柱。

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明dna測序裝置的控制系統(tǒng)及控制方法的優(yōu)勢是：

(1)本方法簡單易操作，獲取目標樣品時間短效率高，可用于痕量dna單鏈的收集與提取，樣品損失幾乎可以忽略，使用試劑少、對設(shè)備的要求低，有效簡化了操作步驟，縮短了操作時間，降低了工作強度，提高了工作效率。

(2)本發(fā)明采用一結(jié)構(gòu)簡單的加樣針即可實現(xiàn)dntp試劑的微量給樣，摒棄了傳動的中空針管抽噴式的給樣方式，僅通過加樣針在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運動數(shù)次即可實現(xiàn)攪拌使得酶反應(yīng)更為完全結(jié)果準確。

總之，本發(fā)明提供的dna測序裝置的控制系統(tǒng)及控制方法減少了底物及酶系的用量，檢測準確，反應(yīng)速度快，集成化高，且可以同時檢測一至多個snp位點以及單鏈dna片段，酶系及底物均打破了部分生產(chǎn)商的壟斷，價格大大下降，分析裝置結(jié)構(gòu)精密，對待測dna片段及底物的用量要求低，降低了焦磷酸測序的檢測成本，擴大了焦磷酸測序的使用范圍。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的dna測序裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2是實施例中的用于焦磷酸的dna收集管的一使用優(yōu)選實施例。

圖3是實施例中過濾柱的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為實施例中加樣架的加樣針示意圖。

圖5為本發(fā)明的測序方法的液路結(jié)構(gòu)示意圖。

圖中標號說明：

1、廢液管道；2、分離盤；21、過濾柱；22、濾膜；23、收集管；231、上蓋；232、連接帶；3、反應(yīng)槽；31、反應(yīng)位；4、加樣架；41、加樣針；42、轉(zhuǎn)軸；5、ccd相機；6、分析臺；61、直線導(dǎo)軌；7、試劑槽；71、干燥槽；72、清洗槽；8、總管道；81、分管道；82、試劑管道；83、溶液管道；84、除泡器；85、第一多通換向閥；86、第二多通換向閥；87、第三多通換向閥；88、第一蠕動泵；89、第二蠕動泵。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細、完整地說明。

實施例1

結(jié)合圖1至圖4詳細說明本發(fā)明實施例的控制系統(tǒng)及控制方法的dna測序裝置的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明的dna測序裝置是基于焦磷酸測序，可用于焦磷酸測序檢測分析dna序列，待測序的dna序列為靶序列，將靶dna序列進行擴增后進行焦磷酸測序。

本實施例的基于焦磷酸測序的dna測序系統(tǒng)包括dna測序裝置和控制區(qū)，dna測序裝置包括樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)。樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)安裝在分析臺6上，樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)通過控制區(qū)監(jiān)測、控制。整個分析過程采用機械手操作。

進行焦磷酸測序之前，需要先對帶測序的dna模板進行擴增，以達到擴增要求的dna濃度。擴增引物設(shè)計時，擴增引物上帶有親和連接體，親和連接體優(yōu)選為生物素，親和連接體優(yōu)選地標記在靶dna的一端引物上，pcr擴增采用現(xiàn)有技術(shù)進行即可。

樣品區(qū)包括分離盤2。分離盤2位于反應(yīng)區(qū)的上方，在靶dna擴增后，靶dna為雙鏈dna，焦磷酸測序需要單鏈dna，分離盤2包括至少一個dna分離區(qū)，dna分離區(qū)采用物理過濾的方式，分離區(qū)包括內(nèi)部設(shè)有濾膜22的中空的過濾柱21，濾膜22為高分子納米微球結(jié)構(gòu)，由于高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑，將帶有親和連接體標記的dna單鏈留在膜上，根據(jù)測序需要收集帶標記的dna單鏈或其互補鏈，用于焦磷酸測序。

本實施例中，分離盤2設(shè)有多個收集管23，過濾柱21安裝于收集管23中，濾膜22位于過濾柱21的一端的端部。過濾柱21下段的外徑與收集管23的內(nèi)徑相同。

雙鏈dna在堿解后將待親和連接體的一條鏈留在濾膜22上，收集該條鏈只需在過濾柱21內(nèi)加入收集液后收集；如需收集互補鏈，可將濾液收集后對濾液中的互補鏈進行收集。

如圖3所示，收集管23用于收集離心時產(chǎn)生的廢液，每個步驟后需要及時傾倒以防止交叉污染，收集管23的上端管身為圓柱體、下端為圓錐體，底部為球面狀。作為另一種優(yōu)選的實施方式，收集管23配置上蓋231，上蓋231通過連接帶232可拆卸地連接在收集管23上，由于連接帶232的連接，裝入過濾柱21后上蓋231也可緊密扣合在過濾柱21或收集管23上，上蓋231的作用是在液體離心時防止液體飛濺出過濾柱21造成損失及污染。

本實施例中所優(yōu)選的濾膜22材料為聚乙烯微球，其微球間孔隙優(yōu)選為10μm，小于親和連接體的直徑，可直接通過物理過濾將帶有親和連接體的單鏈留在膜上，濾去未連接親和連接體的一條鏈，其吸附洗脫效果好，dna回收率高，原料價格低廉環(huán)保。

為了本實施例中的濾膜22在吹打或離心過程中不發(fā)生移動，本實施例中還優(yōu)選的在濾膜22上方設(shè)有壓膜裝置，壓膜裝置包括墊片和/或壓膜架。待分離純化的液體先通過墊片后與濾膜22接觸，墊片優(yōu)選為纖維材料，可耐受酸堿和大部分有機溶劑，對大部分的生物分子不會產(chǎn)生吸附。

優(yōu)選地在墊片的上方，不與濾膜22接觸的一側(cè)，還設(shè)有壓膜架，壓膜架與過濾柱21體材料相同，通過機械壓力壓緊濾膜22，使濾膜22不會在吹打或離心等使用過程中發(fā)生移動，造成收集損失。

反應(yīng)區(qū)包括加樣部和反應(yīng)槽3，加樣部依次包括dntp試劑槽7、干燥槽71、清洗槽72、加樣架4和安裝于加樣架4上的多個加樣針41。分離盤2位于試劑槽7的側(cè)上方。加樣架4為圓盤形，加樣架4通過直線導(dǎo)軌61可沿試劑槽7和反應(yīng)槽3之間做往復(fù)運動。干燥槽71為真空干燥區(qū)。

試劑槽7設(shè)有四個槽位，用于焦磷酸測序的dntp包括datp、dctp、dgtp、dttp四種核酸底物，底物用于與靶dna雜交，并且需要在反應(yīng)體系中加入相關(guān)酶系催化反應(yīng)進行，具體為dna聚合酶，進行互補鏈合成反應(yīng)，在互補鏈合成時得到的副產(chǎn)物焦磷酸轉(zhuǎn)化成atp，在螢光素酶存在下使atp和螢光素反應(yīng)，進行發(fā)光。如果發(fā)生互補鏈合成，則產(chǎn)生焦磷酸，結(jié)果發(fā)光，因此通過對其進行監(jiān)視，可以得知產(chǎn)生互補鏈合成，即組入的堿基種類，由此確定dna序列。

加樣架4通過轉(zhuǎn)軸42做旋轉(zhuǎn)運動，轉(zhuǎn)軸42設(shè)有驅(qū)動電機。轉(zhuǎn)軸42安裝于直線導(dǎo)軌61上，轉(zhuǎn)軸42帶動加樣架4做往復(fù)運動，加樣架4通過另一組直線導(dǎo)軌在轉(zhuǎn)軸42上做升降運動。加樣針41為實心針，用于轉(zhuǎn)移dntp試劑，加樣針41固定于加樣架4的通孔中。將dna單鏈按照反應(yīng)體系的需要量轉(zhuǎn)移至反應(yīng)槽3中，加入酶系后依次加入dntp，加入順序不限，對于每個位點，四種底物各加入一次。

檢測區(qū)包括ccd相機5，ccd相機5位于反應(yīng)槽3的中間。反應(yīng)后如合成互補鏈，則發(fā)光，ccd相機5用于檢測判斷該位點是否進行反應(yīng)并發(fā)光，進而判斷出該位點的堿基序列。

加樣架4位于反應(yīng)槽3上；反應(yīng)槽3上設(shè)有多個反應(yīng)位31，反應(yīng)位31中有測序反應(yīng)液。反應(yīng)位31沿反應(yīng)槽3的圓心呈一系列同心圓均勻排列，反應(yīng)位31由透明材質(zhì)構(gòu)成，反應(yīng)位31延伸入ccd相機5。

如圖4所示，加樣針41的端面為半圓體；采用上述的加樣裝置檢測已知序列的樣品(序列為caatattcgccaggt)，其中加樣針41直徑為1.5mm，表面光潔度為ra0.8；加樣方法包括：步驟a，通過加樣針41插入反應(yīng)槽3的dntp試劑使得加樣針41外周附著所述dntp試劑；步驟b，將附著所述dntp試劑的加樣針41插入反應(yīng)位31中，再使加樣針41離開測序反應(yīng)液；所述步驟a中所述加樣針41離開所述dntp試劑液時的移動速度為10cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測序反應(yīng)液時的移動速度為1cm/s，在測序反應(yīng)液內(nèi)上下運動8次后離開測序反應(yīng)液。

本發(fā)明的基于焦磷酸測序的dna測序系統(tǒng)的設(shè)置方式可以更好地傳遞底物與dna，減少傳遞過程中的損耗。

反應(yīng)區(qū)的形狀不限，分析裝置內(nèi)的具體結(jié)構(gòu)可以根據(jù)檢測的需要進行設(shè)計調(diào)整。

底物加樣至反應(yīng)區(qū)中，此時反應(yīng)區(qū)中已加入待測dna單鏈及其他所需反應(yīng)體系內(nèi)試劑，以檢測所需5ul的量計算，反應(yīng)體系如下：

酶混合物包括：

底物混合物包括：

aps0.4mg/l；

螢火蟲熒光素0.4mmol/l。

反應(yīng)過程中，在每一步選擇對酶活性而言最適宜的ph值進行反應(yīng)，反應(yīng)后需要對反應(yīng)體系內(nèi)的ph值進行調(diào)整以適應(yīng)其他反應(yīng)，具體反應(yīng)體系中的反應(yīng)條件本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)得出。例如，當洗滌步驟中包含腺苷三磷酸雙磷酸酶以去除過量核苷酸種類和atp時，因為處理步驟的連續(xù)性，緩沖液可與腺苷三磷酸雙磷酸酶一起使用，其ph能使腺苷三磷酸雙磷酸酶潔性水平最佳化。然后，在下一個核苷酸摻入步驟中使用聚合酶，可使用具有對聚合酶而言的最佳ph條件的不同緩沖液，以便使聚合酶潔性最佳化。另外，每種最佳緩沖液可包括對于每種酶而言的優(yōu)選抗衡離子，例如對于腺苷三磷酸雙磷酸酶緩沖液而言的ca²⁺和對于聚合酶緩沖液而言的mg²⁺。

反應(yīng)體系中，檢測序列為caatattcgccaggt，其中依次加入dntp的順序為tcatattcgccagt，其中首次加入t時未出峰，以及后續(xù)與實際序列不符的dntp試劑也未出峰，其測得的序列為caatattcgccaggt，與樣品實際序列完全一致，精確度為100％；檢測單個堿基的時間小于1.5分鐘，此序列大約耗時25分鐘，且最小加樣量可達0.1μl。

測序結(jié)果通過生物發(fā)光來進行判斷，其他可以檢測生物發(fā)光的裝置均可使用為檢測裝置，在此不做限制。

以下結(jié)合圖1至圖5，詳細說明上述dna測序裝置的控制系統(tǒng)及控制方法。

本發(fā)明的dna測序裝置的控制系統(tǒng)，包括plc以及與plc連接并通過plc操作的光控制系統(tǒng)、位置控制系統(tǒng)、環(huán)境控制系統(tǒng)、流量控制系統(tǒng)和驅(qū)動控制系統(tǒng)。

光控制系統(tǒng)用于控制ccd相機5的開或關(guān)。位置控制系統(tǒng)包括多個位置傳感器，通過位置傳感器的信號控制加樣架4的轉(zhuǎn)動角度、移動位置，以及ccd相機5的轉(zhuǎn)動角度。環(huán)境控制系統(tǒng)包括位于反應(yīng)槽3內(nèi)的溫度傳感器和加熱器以及用于檢測溶液ph值的ph計。驅(qū)動控制系統(tǒng)包括用于驅(qū)動分離盤轉(zhuǎn)動的電機；用于驅(qū)動轉(zhuǎn)軸的電機；用于驅(qū)動ccd相機轉(zhuǎn)盤的電機。

流量控制系統(tǒng)包括總管道8；與總管道8一端連通且通向各部件的分管道81；與總管道8另一端連通的試劑管道82；以及與總管道8中段連通的溶液管道83；所有管道都設(shè)有閥門；總管道8上設(shè)有蠕動泵；總管道8靠近分管道81處設(shè)有除泡器84。

試劑管道82包括datp管、dctp管、dgtp管、dttp管、dna聚合酶、熒光素管、atp管、aps管、緩沖液管和apyrase管，溶液管道83為緩沖液管和水管，緩沖液用于稀釋試劑和沖洗零部件。試劑管道82與一個第一多通換向閥85的進口連接，第一多通換向閥85具有十一個進口和一個出口，多出來的一個進口備用。第一多通換向閥85的出口通過第一蠕動泵88與總管道8連接。總管道8與分管道81之間設(shè)有第二多通換向閥86，第二多通換向閥86具有一個進口和多個出口。緩沖液管和水管分別與第三多通換向閥87的進口連接，第三多通換向閥87具有兩個進口和一個出口。第三多通換向閥87的出口通過第二蠕動泵89與總管道8連接。總管道8在靠近分管道81處設(shè)有廢液管道1，反應(yīng)槽3的底部設(shè)有出液口與廢液管道1連接。整體液路依靠第一蠕動泵88和第二蠕動泵89提供液流壓力，第一蠕動泵88和第二蠕動泵89分別由相應(yīng)的步進電機驅(qū)動。除泡器84用于消減溶解的氣體，精確控制進入反應(yīng)槽3的試劑和溶液的量。

本實施例中，上述控制系統(tǒng)的控制方法，包括以下步驟：

s1、開啟第一蠕動泵88，依次開啟第一多通換向閥85的進口，開啟第二多通換向閥86中通向dntp試劑槽的分管道81，將dntp試劑槽的四個槽位加入一定量的試劑。加入試劑時，每加完一種試劑后，需清洗管道，避免相鄰試劑之間的干擾，提高測序的精確度。

s2、驅(qū)動分離盤2旋轉(zhuǎn)進行離心處理，除去多余的溶液，洗去殘留的擴增試劑，過濾擴增、結(jié)合后的dna雙鏈；再想過濾柱41中加入naoh與nacl解開雙鏈螺旋。

s3、開啟第二蠕動泵89，開啟第三多通換向閥87的水管或緩沖液管進口，開啟第二多通換向閥86中通向過濾柱的分管道81；用水或緩沖液洗去殘留的naoh，平衡ph值至中性，再加入水，至dna單鏈完全懸浮后吸出用于焦磷酸測序或4℃密封保存。

s4、開啟第一蠕動泵88，依次開啟第一多通換向閥85的進口，開啟第二多通換向閥86中通向反應(yīng)槽的分管道81，將熒光素和aps注入反應(yīng)槽3內(nèi)作為反應(yīng)底物，再將步驟s3中得到的待測單鏈放入反應(yīng)槽3內(nèi)。

s5、驅(qū)動加樣架4移動，使加樣針蘸取任意一種dntp試劑使得加樣針外周附著dntp試劑；驅(qū)動加樣架4移動，將附著dntp試劑的加樣針插入測序反應(yīng)液中，再使加樣針41離開測序反應(yīng)液；反應(yīng)過程中通過溫度傳感器和加熱器控制反應(yīng)槽3的溫度，保持酶的活性。

s6、開啟第二蠕動泵89，開啟第三多通換向閥87的水管進口，清洗加樣針。

s7、開啟第一蠕動泵88，根據(jù)設(shè)置依次開啟第一多通換向閥85的進口，開啟第二多通換向閥86中通向反應(yīng)槽的分管道81，依次加入dna聚合酶、atp硫酸化酶和核苷酸降解酶apyrase；在抽取任意一種試劑后，開啟第一蠕動泵88，使第一多通換向閥85的進口與盛放緩沖液的一個試劑瓶連通，用于抽取緩沖液形成位于相鄰的兩種試劑之間的液柱。

s8、4種dntp試劑任意或多個依待測序列而定以何種順序加入測序反應(yīng)液中，進行步驟s9或者重復(fù)步驟s5、s6和s7。

本實施例中，僅檢測單個堿基是否變異，可根據(jù)已知的前后序列先確定待測堿基位置后，依次重復(fù)上述步驟4次加樣(加入4種dntp試劑)，分別加入同一測序反應(yīng)液中檢測該堿基。

s9、驅(qū)動ccd相機轉(zhuǎn)動角度，使ccd相機對準正在進行反應(yīng)的反應(yīng)槽3，控制ccd相機拍照，并通過plc呈現(xiàn)檢測的譜圖。

s10、測序后，開啟反應(yīng)槽3的出液口，將廢液排入廢液管道1.

本發(fā)明所述實施方案的控制系統(tǒng)和方法中，使用計算機可讀介質(zhì)進行一些設(shè)計、分析或其它操作，這樣的介質(zhì)存儲有用于在計算機系統(tǒng)上執(zhí)行的指令。

在相同或替代實施方案中，在計算機上的應(yīng)用可使用包括所謂“命令行界面”(通常稱為cli)在內(nèi)的界面。cli通常提供基于應(yīng)用與用戶間相互作用的文本。通常，命令行界面通過顯示器以文本行形式顯示輸出并接收輸入。例如，某些執(zhí)行過程可包括所謂的"命令行解釋程序(shell)"例如相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的unix命令行解釋程序(unixshell)，或使用面向?qū)ο笮统绦蝮w系結(jié)構(gòu)的microsoftwindowspowershell，例如microsoft.net框架。

相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會知道，界面可包括一種或多種gui、cli或其組合。

處理器通常執(zhí)行操作系統(tǒng)，操作系統(tǒng)可選擇現(xiàn)有技術(shù)中的任何操作系統(tǒng)，只要本領(lǐng)域技術(shù)人員可用于處理檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)等工作均認為可以納入保護范圍之內(nèi)。

本實施例中的dna分離過程中所涉及的溶液、參數(shù)及其他分離條件，均為本實施例中的優(yōu)選實施方案，任何參照現(xiàn)有技術(shù)可以起到相應(yīng)作用的實驗條件、參數(shù)及溶液均可用于本發(fā)明中所涉及的分離純化過程，本實施例中的具體參數(shù)及溶液選擇不應(yīng)作為對本發(fā)明的限制。

最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護范圍。