本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備斜生柵藻原生質(zhì)體的方法，具體涉及利用水生生物消化酶消化藻細(xì)胞的細(xì)胞壁獲得大量有活性的原生質(zhì)體的方法。

背景技術(shù)：

微藻是一類廣泛分類于陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中的低等單細(xì)胞生物。微藻生長迅速，因其細(xì)胞內(nèi)富含蛋白質(zhì)、多糖、多不飽和脂肪酸、微量元素、色素和抗氧化物等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在生物能源、生物化工材料、醫(yī)藥與保健食品和水產(chǎn)養(yǎng)殖餌料等方面有著廣泛應(yīng)用，尤其是微藻可以利用太陽光能、無機(jī)鹽、co2、海水、廢水和非耕地大量積累有效的生物量，開發(fā)微藻資源對(duì)耕地和淡水資源相對(duì)緊缺的中國具有重大的戰(zhàn)略價(jià)值。

原生質(zhì)體是指去除細(xì)胞壁后裸露的生活細(xì)胞，原生質(zhì)體在藻類生物學(xué)中有著十分廣泛的應(yīng)用，可進(jìn)行各種生理生化研究以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因操作等研究工作。其中，生理生化方面研究包括質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞和細(xì)胞間相互作用等研究。另一方面，細(xì)胞壁是阻止外源遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的重要屏障，而失去細(xì)胞壁的原生質(zhì)體攝取病毒、細(xì)菌、蛋白質(zhì)、核酸等遺傳物質(zhì)的效率大大提高，是研究基因的調(diào)控和表達(dá)，進(jìn)行藻類遺傳工程研究的基礎(chǔ)。此外，通過原生質(zhì)體進(jìn)行細(xì)胞融合，可以改變體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的缺陷，培育優(yōu)良品種。

影響藻類原生質(zhì)體制備率的因素主要包括預(yù)處理方式、酶的種類和濃度、酶解溫度和時(shí)間、ph、酶解時(shí)的振蕩、藻細(xì)胞的生長時(shí)期、以及穩(wěn)滲劑的種類和濃度等。酶的種類是酶法制備藻類原生質(zhì)體的重要影響因素之一，目前使用較多的是一些商業(yè)用途的酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、離析酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、蝸牛酶等的一種或幾種酶的組合。藻類細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成復(fù)雜多變，不同藻的細(xì)胞壁化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)差異極大。藻類細(xì)胞壁主要成分包括纖維素、半纖維素、多糖和蛋白等，選擇合適的酶對(duì)有效降解細(xì)胞壁至關(guān)重要。如褐藻和紅藻細(xì)胞壁中纖維素的含量只占藻干重的1-8％，但在一些綠藻中纖維素含量卻能達(dá)到70％。因此，需根據(jù)不同藻的細(xì)胞壁組成，針對(duì)性地選擇相應(yīng)的酶，通常還需要多種單酶進(jìn)行復(fù)合使用。takeda等人發(fā)現(xiàn)用離析酶和果膠酶對(duì)小球藻(chlorellaprotothecoides)細(xì)胞壁的降解效果較差，可能是由于它們對(duì)該藻的細(xì)胞壁組成(嚴(yán)格的果糖-甘露糖結(jié)構(gòu))不敏感。而lu等人采用纖維素酶和蝸牛酶組合(2％纖維素酶r-10和1％蝸牛酶)，小球藻原生質(zhì)體制備率幾乎達(dá)到了100％。適宜的酶濃度是影響原生質(zhì)體制備的另一個(gè)重要因素。酶濃度較低時(shí)，原生質(zhì)體的完全破壁率不高，原生質(zhì)體膜的受損程度相應(yīng)較低，制備率也不高。當(dāng)酶濃度升高時(shí)，原生質(zhì)體的完全破壁率逐漸升高，但是過量情況下易導(dǎo)致原生質(zhì)體的活力下降、甚至細(xì)胞破裂、死亡。高滲溶劑也是酶解體系中不可或缺的一員，其作用是維持原生質(zhì)體內(nèi)外一定的滲透壓，而不致細(xì)胞破裂。常用的高滲溶劑有甘露醇和山梨醇、葡萄糖、蔗糖、kcl等，但不同微藻的原生質(zhì)體細(xì)胞對(duì)上述高滲溶劑的敏感性不同，在特定條件下，一些高滲溶劑甚至可能產(chǎn)生刺激性，使原生質(zhì)體失活。此外，酶解過程中加入ca、mg、k等離子對(duì)原生質(zhì)膜有穩(wěn)定作用。

斜生柵藻(scenedesmusobliquus)是淡水單細(xì)胞真核綠藻，屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、柵藻科、柵藻屬，通常由2或4個(gè)細(xì)胞組成定型群體。作為一種重要的經(jīng)濟(jì)微藻，斜生柵藻被廣泛應(yīng)用于水生生物餌料、污水處理、微藻能源等領(lǐng)域。此外，斜生柵藻還對(duì)毒物敏感，因其易獲得、繁殖快、在較短時(shí)間內(nèi)即可得到化學(xué)物質(zhì)對(duì)其許多世代及種群水平的影響評(píng)價(jià)，是一種常用的生態(tài)毒理受試生物。因此，對(duì)斜生柵藻進(jìn)行基因改造和在基因水平進(jìn)行特殊代謝機(jī)制的研究也得到廣泛開展。對(duì)斜生柵藻進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，是開發(fā)轉(zhuǎn)基因微藻、深入發(fā)掘其應(yīng)用潛力的重要手段之一。目前尚未見斜生柵藻細(xì)胞壁組分和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)報(bào)道，klaudija報(bào)道了一種利用混合酶破壞斜生柵藻細(xì)胞壁，從而提高細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)提取效率的方法。該方法使用萄聚糖酶、甘露聚糖酶、昆布多糖酶、纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶和蛋白酶的一種或多種酶組合的方法破壞斜生柵藻細(xì)胞，但該方法僅破壞了部分細(xì)胞壁，并未完整或大部分去除細(xì)胞壁，其目的僅是通過酶解提取細(xì)胞內(nèi)的生化成分?？傮w來說，斜生柵藻原生質(zhì)體的制備技術(shù)這一塊還是空白。探索一種高效的降解斜生柵藻細(xì)胞壁、并制備原生質(zhì)體的方法，是進(jìn)行柵藻細(xì)胞融合、基因工程操作、膜蛋白功能研究及內(nèi)吞作用等生理生化研究的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)制備微藻原生質(zhì)體效率不高的問題，提供一種高效、簡單的方法制備斜生柵藻原生質(zhì)體。

本發(fā)明的目的通過以下方法實(shí)現(xiàn)：

一種制備斜生柵藻原生質(zhì)體的方法，包括如下步驟：

(1)、收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，用超聲波振蕩器振蕩以打散斜生柵藻聚集所形成的細(xì)胞群體，離心，收集斜生柵藻細(xì)胞，用新鮮的bg11培養(yǎng)基重懸，得到斜生柵藻細(xì)胞懸液；

(2)、以大型溞(daphniamagna)為原料制得混合消化酶液；將所述的混合消化酶液與少量纖維素酶、果膠酶和高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑cacl2混合后過濾除去不溶性雜質(zhì)，再與步驟(1)制得的斜生柵藻細(xì)胞懸液混合，通過酶解消化斜生柵藻細(xì)胞壁，離心獲取游離的原生質(zhì)體。

步驟(1)中，斜生柵藻細(xì)胞采用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)10～14天至對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期為14：10h(光照/黑暗)。

斜生柵藻藻液用超聲波振蕩器振蕩30秒；2000g離心，收集斜生柵藻細(xì)胞。

所述的斜生柵藻細(xì)胞懸液的細(xì)胞密度為3～6×10⁶個(gè)/ml。

步驟(2)中，所述的混合消化酶液的制備方法為：大型溞接種于ph為7.8的無氯自來水(用naoh和hcl調(diào)整ph)中，靜置培養(yǎng)，每日光照時(shí)間內(nèi)定時(shí)搖瓶6次，培養(yǎng)條件為26±1℃，光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生柵藻藻泥(日投飼量為5～7×10⁶個(gè)/ml培養(yǎng)液)飼喂大型溞，培養(yǎng)約96h；取500ml大型溞培養(yǎng)液，用200目篩絹過濾收獲大型溞(密度為50～80ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液將篩絹上的大型溞沖入研缽中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液定容至12ml以保持酶的活性，在4℃低溫研磨成勻漿后得到粗提液，過濾得到混合消化酶液；其中，粗提液依次經(jīng)8μm，1μm濾膜分級(jí)過濾，所得濾液即為混合消化酶液。所述的斜生柵藻藻泥的制備方法為：取對(duì)數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，5000rpm離心濃縮斜生柵藻培養(yǎng)液，調(diào)整成4～6×10⁹個(gè)/ml的藻泥。

所述的磷酸緩沖液的配方為：5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl。

所述的混合消化酶液的用量為斜生柵藻細(xì)胞懸液體積的5～8％，優(yōu)選為5％(體積比)；所述的纖維素酶和斜生柵藻細(xì)胞懸液的質(zhì)量體積比為0.5～2：100g/ml，優(yōu)選為0.5：100g/ml；所述的果膠酶和斜生柵藻細(xì)胞懸液的質(zhì)量體積比為0.5～2：100g/ml，優(yōu)選為0.5：100g/ml。纖維素酶活力在250～600u/ml，果膠酶活力在400～800u/ml。

所述的甘露醇的濃度為0.3～0.6mol/l，優(yōu)選為0.5mol/l；所述的膜穩(wěn)定劑cacl2的濃度為3～5mmol/l，優(yōu)選為4mmol/l。

所述的酶解消化條件為：溫度30±1℃，避光條件下，50～80rpm輕微振蕩8～12h。

所述的酶解消化過程具體為：在所述的混合消化酶液中加入纖維素酶、果膠酶，添加高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑ca²⁺，用0.45μm的濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)后，與步驟(1)制得的斜生柵藻細(xì)胞懸液混合，在溫度30±1℃、避光條件下，50～80rpm輕微振蕩8～12h酶解消化斜生柵藻細(xì)胞壁，得到含有原生質(zhì)體的混合酶解液。

酶解消化后，得到的混合酶解液2000g離心，將原生質(zhì)體和混合酶液分離，原生質(zhì)體用洗脫液洗脫3次；所述的洗脫液為含有0.3～0.6mol/l甘露醇和3～5mmol/lcacl2的水溶液，優(yōu)選為含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2的水溶液；即將甘露醇和cacl2溶于去離子水中配制。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明制備斜生柵藻細(xì)胞的方法提取高效，可獲得大量的原生質(zhì)體，通過該方法制備原生質(zhì)體的效率可達(dá)70％；且原生質(zhì)體活性較強(qiáng)，再生能力強(qiáng)，既可為以斜生柵藻為目標(biāo)的細(xì)胞融合及基因操作提供技術(shù)支持，亦可為研究微藻細(xì)胞的膜生理功能、內(nèi)吞作用等生理生化過程提供可靠的原材料。

附圖說明

圖1為光學(xué)顯微鏡觀察斜生柵藻細(xì)胞(a)和酶解后獲得的原生質(zhì)體(a)。

圖2為斜生柵藻原生質(zhì)體再生后fv/fm值測定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

斜生柵藻細(xì)胞(來源于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫，武漢)用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為：1.5g/lnano3，0.04g/lk2hpo4，0.075g/lmgso4.7h2o，0.036g/lcacl2.2h2o，0.006g/l檸檬酸，0.006g/l檸檬酸鐵銨，0.001g/lna2edta，0.02g/lna2co3，2.86mg/lh3bo3，1.81mg/lmncl2.4h2o，0.22mg/lznso4.7h2o，0.39mg/lna2moo4.2h2o，0.08mg/lcuso4.5h2o，0.05mg/lco(no3)2.6h2o。培養(yǎng)條件為：溫度為26±1℃，光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1，光照周期14：10h條件，培養(yǎng)10～14天至對(duì)數(shù)生長期，藻液用超聲振蕩器振蕩30秒以打散斜生柵藻聚集所形成的細(xì)胞群體，2000g離心，收集斜生柵藻細(xì)胞，用新鮮的bg11培養(yǎng)基重懸得到細(xì)胞密度為5×10⁶個(gè)/ml的斜生柵藻細(xì)胞懸液(見圖1a)。

取對(duì)數(shù)生長期的斜生柵藻藻液，5000rpm離心濃縮成4～6×10⁹個(gè)/ml的藻泥；大型溞(來源于中國科學(xué)院水生研究所)接種于ph為7.8的無氯自來水(用naoh和hcl調(diào)整ph)中，靜置培養(yǎng)，每日光照時(shí)間內(nèi)定時(shí)搖瓶6次，培養(yǎng)條件為26±1℃，光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1，光暗周期14：10h；每日取斜生柵藻藻泥(日投飼量為5～7×10⁶個(gè)/ml培養(yǎng)液)飼喂大型溞，培養(yǎng)約96h；取500ml大型溞培養(yǎng)液，用200目篩絹過濾收獲大型溞(密度為57ind/ml)，用少量0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液(5.26g/lnah2po4，0.87g/lna2hpo4，8.0g/lnacl，0.2g/lkcl)將篩絹上的大型溞沖入研缽中，加入0.05mol/l、ph6.0磷酸緩沖液定容至12ml，在4℃低溫研磨成勻漿后得到粗提液，粗提液依次經(jīng)8μm，1μm濾膜分級(jí)過濾得到混合消化酶液。

在混合消化酶液中加入纖維素酶、果膠酶，添加高滲溶劑甘露醇和膜穩(wěn)定劑cacl2，用0.45μm的濾膜過濾除去不溶性雜質(zhì)后，與制得的斜生柵藻細(xì)胞懸液混合，其中，混合消化酶液為斜生柵藻細(xì)胞懸液體積的5％，纖維素酶、果膠酶與混合消化酶液質(zhì)量體積比(g/ml)均為0.5％，甘露醇在酶解體系中的濃度為0.5mol/l，膜穩(wěn)定劑cacl2在酶解體系中的4mmol/l；將藻細(xì)胞與酶的混合液在30±1℃，避光條件下，以60rpm輕微振蕩進(jìn)行酶解12h，酶解結(jié)束后混合酶解液離心，將原生質(zhì)體和混合酶液分離，原生質(zhì)體用洗脫液(含有0.5mol/l甘露醇和4mmol/lcacl2水溶液)洗脫3次，即制得原生質(zhì)體(見圖1b)。

計(jì)算原生質(zhì)體制備率

分別采用低滲爆破法和染色體法計(jì)算原生質(zhì)體制備率。

低滲爆破法：向制備的原生質(zhì)體中分別加入蒸餾水和高滲溶液，被較完整去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體在蒸餾水中細(xì)胞漲大，甚至破裂，表明較為完整地去除藻細(xì)胞的細(xì)胞壁，在實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件下，原生質(zhì)體制備率達(dá)70％。

原生質(zhì)體制備率(％)＝(處理后細(xì)胞總數(shù)－蒸餾水中完整的細(xì)胞數(shù))/處理前細(xì)胞總數(shù)×100％。

考察原生質(zhì)體再生能力

配制高滲固體平板培養(yǎng)基，配方為：bg11+8％海帶渣酶解提取液+1.5％瓊脂，其中海帶渣酶解提取物采用zheng酶解法提取(effectofkelpwasteextractsonthegrowthandlipidaccumulationofmicroalgae.bioresourcetechnology,2016,201:80-88)。

將制備好的原生質(zhì)體(0.5ml)接種至高滲固體平板培養(yǎng)基上，26±1℃下弱光條件(10μmol·m^-2·s^-1)培養(yǎng)3天后轉(zhuǎn)至光照強(qiáng)度為50μmol·m^-2·s^-1條件下培養(yǎng)至平板上長出綠色藻落。挑取綠色藻落接種至bg11液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)fv/fm值，發(fā)現(xiàn)其與正常細(xì)胞無顯著差異(見圖2)，表明原生質(zhì)體再生后的其細(xì)胞活力不受影響。

綜合分析以上結(jié)果，利用大型溞提取的混合消化酶液，能有效地降解斜生柵藻的細(xì)胞壁，獲得大量原生質(zhì)體，原生質(zhì)體制備率高，再生后細(xì)胞活力高。

以上所述僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施的案列而已，并非是對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。