本發(fā)明屬于儀器分析檢測領(lǐng)域，涉及一種痰液中醋酸鐮孢氨酸c(n,n',n"-triacetylfusarininec,tafc)和雙甲硫基膠霉毒素(bis(methylthio)gliotoxin,bmgt)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測方法。

背景技術(shù)：

曲霉菌是自然界中廣泛存在的一種真菌，在相對溫暖和濕潤的環(huán)境中會較為快速的生長和繁殖?？諝庵袕浬⒌恼婢咦涌赏ㄟ^人體的呼吸進(jìn)入呼吸道定植。為了深入了解曲霉菌在人群中的分布情況，國內(nèi)、外研究者在不斷探索呼吸道中是否有曲霉菌定植的方法。目前鑒定人體呼吸道內(nèi)是否有曲霉菌定植的方法主要是痰液真菌培養(yǎng)，然而該方法敏感性很低而且培養(yǎng)周期很長。因此，目前有越來越多的研究在探索通過曲霉菌標(biāo)志物的檢測來判斷呼吸道是否存在曲霉菌定植。

tafc是曲霉菌在缺鐵環(huán)境下合成和釋放的一種鐵載體。bmgt是由曲霉菌合成和分泌的另一種化合物。目前，有文獻(xiàn)報道使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(uplc-ms/ms)從血清中檢測tafc的方法，也有研究者采用高效薄層色譜分析儀(hptlc)從血清中檢測出bmgt的方法。然而，血清的檢測存在敏感性較低的弊端，基于局部器官和組織的標(biāo)本檢測可能會能更好地反映曲霉菌在人體中特定部位的分布情況。痰液是呼吸道分泌物，因此痰液中曲霉菌相關(guān)標(biāo)志物的檢測可能更直接地反映呼吸道曲霉菌的定植。此外，現(xiàn)有方法尚無法實(shí)現(xiàn)tafc和bmgt這兩種化合物的同時檢測。因此，若能開發(fā)出從痰液中同時檢測tafc和bmgt的方法，對于深入研究曲霉菌在人體呼吸道的分布與定植情況、豐富tafc和bmgt的檢測途徑、提高檢測效率都將產(chǎn)生積極的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種痰液中tafc和bmgt的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測方法，以豐富tafc和bmgt的檢測途徑，提高檢測效率。

本發(fā)明提供的痰液中tafc和bmgt的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測方法，步驟如下：

(1)標(biāo)樣和試樣的制備

①將tafc和bmgt用甲醇溶解，并用乙腈稀釋得到一系列tafc和bmgt濃度梯度變化的混合標(biāo)準(zhǔn)液；配制非那西丁溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液；

②取等體積的各混合標(biāo)準(zhǔn)液，向各混合標(biāo)準(zhǔn)液中分別加入等體積的空白痰液樣品和等體積的內(nèi)標(biāo)溶液，然后混勻得到一系列混合液，分別向各混合液中加入萃取劑萃取2～3次，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下去除萃取劑，得一系列固態(tài)物質(zhì)，將各固態(tài)物質(zhì)分別用乙腈水溶液溶解并定容至同一體積，離心，所得一系列上清液即為標(biāo)樣；

③向待測痰液樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液并混勻，再向所得含內(nèi)標(biāo)的痰液樣品中加入萃取劑萃取2～3次，合并萃取液并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下去除萃取劑，將所得固態(tài)物質(zhì)用乙腈水溶液溶解，然后離心，所得上清液即為試樣；

(2)標(biāo)樣和試樣的測定

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對步驟(1)所得各標(biāo)樣和試樣按照以下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，得到標(biāo)樣和試樣譜圖，記錄各標(biāo)樣和試樣譜圖中tafc、bmgt和非那西丁的峰面積；

色譜條件：采用agilentextendc18色譜柱，采用流動相a和流動相b進(jìn)行梯度洗脫，流動相a為0.1wt％～0.15wt％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈，梯度洗脫條件為：在0min至1min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為25％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為75％，在大于1min至4min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)由25％線性增加至95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)由75％線性減少至5％，在大于4min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為5％；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式，毛細(xì)管電壓3500～3550v，干燥氣溫度350～360℃，干燥氣流速5～6l/min，鞘氣溫度350～360℃，鞘氣流速11～12l/min，deltaemv300～320v；測定醋酸鐮孢氨酸c的母離子的質(zhì)荷比m/z為928.3，子離子的質(zhì)荷比m/z為251，碎裂電壓為240v，碰撞電壓為65v；測定雙甲硫基膠霉毒素的母離子的質(zhì)荷比m/z為357.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為309.1，碎裂電壓為76v，碰撞電壓為5v；測定非那西丁的質(zhì)荷比m/z為180.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為138.3，碎裂電壓為120v，碰撞電壓為15v；

(3)檢測結(jié)果的獲取

以各標(biāo)樣中tafc的濃度為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)樣譜圖中tafc與非那西丁的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制tafc的工作曲線；以各標(biāo)樣中bmgt的濃度為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)樣譜圖中bmgt與非那西丁的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制雙甲硫基膠霉毒素的工作曲線；

將試樣譜圖中tafc與非那西丁的峰面積比值、bmgt與非那西丁的峰面積比值分別帶入tafc和bmgt的工作曲線的線性回歸方程中，計算出試樣中tafc和bmgt的濃度。

上述方法中，所述萃取劑為氯仿或二氯甲烷。

上述方法方法的步驟(1)②中，每次萃取劑的加入量為含內(nèi)標(biāo)的混合工作液體積的3～4倍，步驟(1)③中，每次萃取劑的加入量為得到含內(nèi)標(biāo)的痰液樣品體積的3～4倍。

上述方法中，所述乙腈水溶液中乙腈的體積百分?jǐn)?shù)為35％～50％。

上述方法中，將非那西丁用乙腈配制成非那西丁濃度為13～14ng/ml的溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明提供了一種從痰液中同時檢測tafc和bmgt的方法，為tafc和bmgt的檢測提供了新的途徑，解決了現(xiàn)有方法無法實(shí)現(xiàn)tafc和bmgt同時檢測的不足，有利于提高檢測效率。

2.試驗表明，本發(fā)明所述方法在1.56～100ng/ml濃度范圍內(nèi)對tafc和bmgt具有良好的線性，檢測tafc和bmgt的日內(nèi)、日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd不超過8％，符合小于15％的要求，準(zhǔn)確度相對偏差re不超過±9％，符合不超過±15％范圍的要求。

3.本發(fā)明所述方法采用常規(guī)試驗儀器和試劑即可實(shí)現(xiàn)tafc和bmgt的檢測，操作簡單，有利于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1中1#標(biāo)樣的譜圖；

圖2是實(shí)施例1繪制的tafc的工作曲線；

圖3是實(shí)施例1繪制的bmgt的工作曲線。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明所述痰液中tafc和bmgt的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測方法作進(jìn)一步說明。實(shí)施例中采用的儀器為agilent1260-6460型高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中，對標(biāo)樣進(jìn)行測試，以考察本發(fā)明所述方法的線性范圍，步驟如下：

1.標(biāo)樣的制備

(1)準(zhǔn)確稱量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt濃度均為10mg/ml的混合儲備液。

取混合儲備液7份，用乙腈稀釋得到1#～7#混合標(biāo)準(zhǔn)液，1#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為15.63ng/ml，2#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為31.25ng/ml，3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為62.50ng/ml，4#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為125.00ng/ml，5#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為250.00ng/ml，6#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為500.00ng/ml，7#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為1000.00ng/ml。

(2)稱取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁儲備液，取適量非那西丁儲備液用乙腈稀釋得到內(nèi)標(biāo)溶液，該內(nèi)標(biāo)溶液中非那西丁的濃度為13.8ng/ml。

(3)取1#～7#混合標(biāo)準(zhǔn)液各10μl，分別向1#～7#混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入100μl空白痰液(不含tafc和bmgt的痰液)和10μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，得到7份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，所得上清液即為標(biāo)樣，依次記作1#標(biāo)樣～7#標(biāo)樣。

2.標(biāo)樣的測定

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)法對1#標(biāo)樣～7#標(biāo)樣按照以下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，得到1#標(biāo)樣～7#標(biāo)樣譜圖，記錄各標(biāo)樣譜圖中tafc、bmgt和非那西丁的峰面積，其中1#標(biāo)樣譜圖如圖1所示，圖1中，從上至下三個譜圖中的峰依次為tafc、bmgt和內(nèi)標(biāo)物非那西丁(圖中標(biāo)示為is)的峰；

色譜條件：采用agilentextendc18色譜柱(規(guī)格3.0×100mm，柱填料粒徑3.5μm)，采用流動相a和流動相b進(jìn)行梯度洗脫，柱溫35℃、流速0.4ml/min、進(jìn)樣量3μl，流動相a為0.1wt％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈。

梯度洗脫條件為：在0min至1min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為25％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為75％，在大于1min至4min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)由25％線性增加至95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)由75％線性減少至5％，在大于4min至6.5min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為5％；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速5l/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11l/min，deltaemv300v；測定醋酸鐮孢氨酸c的母離子的質(zhì)荷比m/z為928.3，子離子的質(zhì)荷比m/z為251，碎裂電壓為240v，碰撞電壓為65v；測定雙甲硫基膠霉毒素的母離子的質(zhì)荷比m/z為357.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為309.1，碎裂電壓為76v，碰撞電壓為5v；測定非那西丁的質(zhì)荷比m/z為180.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為138.3，碎裂電壓為120v，碰撞電壓為15v。

3.繪制工作曲線

以各標(biāo)樣中tafc的濃度為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)樣譜圖中tafc與非那西丁的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制tafc在1.56～100ng/ml濃度范圍的工作曲線，如圖2所示，用加權(quán)(w＝1/x²)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到tafc工作曲線的線性回歸方程為y＝0.03095x+6.82×10^-3，該線性回歸方程中，y為tafc與非那西丁的峰面積比值，x為tafc的濃度，線性回歸方程的相關(guān)性系數(shù)r值為0.9997。

以各標(biāo)樣中bmgt的濃度為橫坐標(biāo)，以各標(biāo)樣譜圖中bmgt與非那西丁的峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制bmgt在1.56～100ng/ml濃度范圍的工作曲線，如圖3所示用加權(quán)(w＝1/x²)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到bmgt工作曲線的線性回歸方程為y＝0.05647x+4.62×10^-4，該線性回歸方程中，y為bmgt與非那西丁的峰面積比值，x為bmgt的濃度，線性回歸方程的相關(guān)性系數(shù)r值為0.9980。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，對標(biāo)樣進(jìn)行測試，以考察本發(fā)明所述方法的精密度與準(zhǔn)確度，步驟如下：

1.標(biāo)樣的制備

(1)準(zhǔn)確稱量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt濃度均為10mg/ml的混合儲備液。

取混合儲備液3份，用乙腈稀釋得到1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液，1#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為31.25ng/ml，2#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為125.00ng/ml，3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為500.00ng/ml。

(2)稱取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁儲備液，取適量非那西丁儲備液用乙腈稀釋得到內(nèi)標(biāo)溶液，該內(nèi)標(biāo)溶液中非那西丁的濃度為13.8ng/ml。

(3)取1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液各10μl，分別向1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入100μl空白痰液和10μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，所得上清液即為標(biāo)樣，依次記作1#標(biāo)樣～3#標(biāo)樣。

2.標(biāo)樣的測定以及精密度和準(zhǔn)確度的計算

采用lc-ms/ms法對1#標(biāo)樣～3#標(biāo)樣按照以下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，每個濃度的標(biāo)樣平行6份，平行測定3天，記錄各標(biāo)樣譜圖，計算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果如表1所示。

色譜條件：采用agilentextendc18色譜柱(規(guī)格3.0×100mm，柱填料粒徑3.5μm)，采用流動相a和流動相b進(jìn)行梯度洗脫，柱溫35℃、流速0.4ml/min、進(jìn)樣量3μl，流動相a為0.1wt％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈。

梯度洗脫條件為：在0min至1min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為25％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為75％，在大于1min至4min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)由25％線性增加至95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)由75％線性減少至5％，在大于4min至6.5min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為5％；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速5l/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11l/min，deltaemv300v；測定醋酸鐮孢氨酸c的母離子的質(zhì)荷比m/z為928.3，子離子的質(zhì)荷比m/z為251，碎裂電壓為240v，碰撞電壓為65v；測定雙甲硫基膠霉毒素的母離子的質(zhì)荷比m/z為357.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為309.1，碎裂電壓為76v，碰撞電壓為5v；測定非那西丁的質(zhì)荷比m/z為180.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為138.3，碎裂電壓為120v，碰撞電壓為15v。

表1

由表1可知，本發(fā)明所述方法檢測tafc和bmgt的日內(nèi)、日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd不超過8％，符合小于15％的要求，準(zhǔn)確度相對偏差re不超過±9％，符合不超過±15％范圍的要求。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，考察基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率，步驟如下：

1.配制混合標(biāo)準(zhǔn)液和內(nèi)標(biāo)溶液

(1)準(zhǔn)確稱量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt濃度均為10mg/ml的混合儲備液。

取混合儲備液3份，用乙腈稀釋得到1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液，1#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為31.25ng/ml，2#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為125.00ng/ml，3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為500.00ng/ml。

(2)稱取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁儲備液，取適量非那西丁儲備液用乙腈稀釋得到內(nèi)標(biāo)溶液，該內(nèi)標(biāo)溶液中非那西丁的濃度為13.8ng/ml。

2.取3份空白痰液樣品各100μl，分別向各空白痰液樣品中加入乙腈10μl，渦旋混勻，然后分別加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一樣本得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈?，分別將所得固態(tài)物質(zhì)用80μl乙腈體積百分?jǐn)?shù)為37.5％的乙腈水溶液溶解，分別向所得溶液中加入10μl1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入10μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度考察6個不同來源的空白痰液樣品，記錄譜圖。

取1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液各10μl，分別向1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入10μl內(nèi)標(biāo)溶液和80μl乙腈體積百分?jǐn)?shù)為37.5％的乙腈水溶液，渦旋混勻后按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度的樣品平行6份，記錄譜圖。

比較該步驟中的兩種樣品的譜圖峰面積，得到tafc、bmgt和非那西丁在3個濃度的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果如表2所示。

3.取1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液各10μl，分別向1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中加入100μl空白痰液和10μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，對所得上清液按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度考察6個不同來源的空白痰液樣品，記錄譜圖。

取3份空白痰液樣品各100μl，分別向各空白痰液樣品中加入乙腈10μl，渦旋混勻，然后分別加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一樣本得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈?，分別將所得固態(tài)物質(zhì)用80μl乙腈體積百分?jǐn)?shù)為37.5％的乙腈水溶液溶解，分別向所得溶液中加入10μl1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液，再分別加入10μl內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻后按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度考察6個不同來源的空白痰液樣品，記錄譜圖。

比較該步驟中的兩種樣品的譜圖峰面積，得到tafc、bmgt和非那西丁在3個濃度的絕對提取回收率結(jié)果如表2所示。

表2

實(shí)施例4

本實(shí)施例考察痰液樣品的穩(wěn)定性，步驟如下：

1.配制混合標(biāo)準(zhǔn)液體和內(nèi)標(biāo)溶液

(1)準(zhǔn)確稱量tafc和bmgt置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到tafc和bmgt濃度均為10mg/ml的混合儲備液。

取混合儲備液3份，用乙腈稀釋得到1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液，1#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為31.25ng/ml，2#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為125.00ng/ml，3#混合標(biāo)準(zhǔn)液中tafc和bmgt濃度均為500.00ng/ml。

(2)稱取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁儲備液，取適量非那西丁儲備液用乙腈稀釋得到內(nèi)標(biāo)溶液，該內(nèi)標(biāo)溶液中非那西丁的濃度為13.8ng/ml。

2.未處理樣品：取3份剛采集的空白痰液樣品各100μl，立即向各痰液樣品中分別加入1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液10μl，室溫(25℃)靜置4h，分別加入內(nèi)標(biāo)溶液10μl，渦旋混勻，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，對所得上清液按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度平行3份，記錄譜圖。

處理后的樣品：取3份剛采集的空白痰液樣品各100μl，立即向各痰液樣品中分別加入1#～3#混合標(biāo)準(zhǔn)液10μl以及內(nèi)標(biāo)溶液10μl，渦旋混勻，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，將所得上清液在室溫(25℃)放置24h，然后按照實(shí)施例2中的條件進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，每個濃度平行3份，記錄譜圖。

計算上述兩種情況下的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd和準(zhǔn)確度相對偏差re，結(jié)果如表3所示，由表3可知，對于未處理樣品和處理后的樣品，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差rsd均不超過10％，準(zhǔn)確度相對偏差re不超過±8％，這說明采集的痰液樣品未經(jīng)處理在室溫放置不超過4h、采集的痰液樣品在經(jīng)過處理后在室溫放置不超過24h是穩(wěn)定的，不會影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。

表3

實(shí)施例5

本實(shí)施例中，采用本發(fā)明所述方法對3個痰液樣品進(jìn)行測定，將3份痰液樣本編號為a#、b#、c#痰液樣品，步驟如下：

1.試樣的制備

(1)稱取非那西丁10mg于10ml容量瓶中，加乙腈溶解并定容，得到1mg/ml的非那西丁儲備液，取適量非那西丁儲備液用乙腈稀釋得到內(nèi)標(biāo)溶液，該內(nèi)標(biāo)溶液中非那西丁的濃度為13.8ng/ml。

(2)取a#、b#、c#痰液樣品各100μl，分別其中加入內(nèi)標(biāo)溶液10μl，渦旋混勻，得到3份混合液，向各混合液中加入氯仿萃取2次，每次加入氯仿400μl，將萃取同一混合液得到的萃取液合并，然后在氮?dú)庀麓蹈刹⑺霉虘B(tài)物質(zhì)乙腈體積百分?jǐn)?shù)為50％的乙腈水溶液溶解并定容至100μl，然后離心，所得上清液即為試樣，依次記作a#、b#、c#試樣。

2.試樣的測定

采用lc-ms/ms法對a#、b#、c#試樣按照以下色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，得到a#、b#、c#試樣譜圖，記錄各試樣譜圖中tafc、bmgt和非那西丁的峰面積；

色譜條件：采用agilentextendc18色譜柱(規(guī)格3.0×100mm，柱填料粒徑3.5μm)，采用流動相a和流動相b進(jìn)行梯度洗脫，柱溫35℃、流速0.4ml/min、進(jìn)樣量3μl，流動相a為0.1wt％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈。

梯度洗脫條件為：在0min至1min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為25％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為75％，在大于1min至4min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)由25％線性增加至95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)由75％線性減少至5％，在大于4min至6.5min，洗脫液中流動相b的體積百分?jǐn)?shù)為95％、流動相a的體積百分?jǐn)?shù)為5％；

質(zhì)譜條件：電噴霧離子化源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式，毛細(xì)管電壓3500v，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速5l/min，鞘氣溫度350℃，鞘氣流速11l/min，deltaemv300v；測定醋酸鐮孢氨酸c的母離子的質(zhì)荷比m/z為928.3，子離子的質(zhì)荷比m/z為251，碎裂電壓為240v，碰撞電壓為65v；測定雙甲硫基膠霉毒素的母離子的質(zhì)荷比m/z為357.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為309.1，碎裂電壓為76v，碰撞電壓為5v；測定非那西丁的質(zhì)荷比m/z為180.1，子離子的質(zhì)荷比m/z為138.3，碎裂電壓為120v，碰撞電壓為15v。

3.檢測結(jié)果的獲取

將a#、b#、c#試樣譜圖中tafc與非那西丁的峰面積比值、bmgt與非那西丁的峰面積比值分別帶入實(shí)施例1確定的tafc和bmgt的工作曲線的線性回歸方程中，計算出各試樣中tafc和bmgt的濃度，結(jié)果如表4所示。

表4