本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，涉及一種溶血磷脂酰膽堿的絕對定量分析方法，具體涉及一種基于hplc-ms/ms檢測平臺的溶血磷脂酰膽堿的絕對定量分析方法。

背景技術(shù)：

hbv相關(guān)性hcc是我國最常見的肝癌類型，也是hcc的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多個信號通路和代謝通路異常改變的復(fù)雜病理過程，在此過程中多種物質(zhì)的代謝水平發(fā)生變化，這些變化的代謝物具有潛在診斷、疾病分期和預(yù)后的臨床價值。其中l(wèi)pc類物質(zhì)被多次報道與hcc具有某種關(guān)系。

溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine，lpc)是氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipopro2teiox2ldl)的主要成分，是磷脂分解代謝的主要產(chǎn)物之一，在人體血清中的含量亦隨之變化，此變化與肝臟疾病的種類和嚴(yán)重程度相關(guān)。為了研究lpc類物質(zhì)在hbv-hcc發(fā)生發(fā)展過程中的變化趨勢，探索可能的病理機制，并分析潛在的臨床應(yīng)用，首要的任務(wù)是精確定量lpc類物質(zhì)。

目前最常用的代謝組學(xué)技術(shù)是質(zhì)譜技術(shù)(massspectrometry，ms)和核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance，nmr)，而ms最常用的分析方法是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gaschromatography-massspectrometry，gc-ms)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquidchromatography-massspectrometry，lc-ms)和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(capillaryelectrophoresiscoupledtomassspectrometry，ce-ms)。nmr、gc-ms、lc-ms和ce-ms可謂是目前代謝組學(xué)分析技術(shù)的四大支柱。lc-ms適用的待檢代謝物范圍較廣，涉及極性糖類分子、非芳香族有機酸和各種脂類等物質(zhì)。lc-ms聯(lián)用平臺同時具有較高的特異性和敏感性，是目前定量檢測微量非揮發(fā)性分析物的金標(biāo)準(zhǔn)。由于lpc類物對熱不穩(wěn)定，且不易揮發(fā)，適用于lc-ms技術(shù)定量分析檢測。使用lc/ms進行定量分析時，需要借助于內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，原始信號強度或峰面積可以轉(zhuǎn)換為代謝物濃度。因為原始信號強度取決于質(zhì)譜儀的條件和源于樣品基質(zhì)的離子抑制程度的大小。但是，為所有的代謝物均繪制對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線或找到一種普適性的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)是不太現(xiàn)實的，所以大量的非靶向代謝研究和廣譜靶向代謝研究使用原始數(shù)據(jù)中的離子強度來表示代謝物水平的高低，也就是只能進行相對定量。目前已有研究試圖采用簡化的標(biāo)準(zhǔn)化方法(例如通用內(nèi)標(biāo)物)來解決定量難題，但是其質(zhì)量控制和性能驗證的結(jié)果并不令人滿意。由于lc-ms技術(shù)本身存在的缺陷不能廣泛在臨床中推廣應(yīng)用于lpc類物質(zhì)的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種用于人血清中l(wèi)pc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0、lpc18:0五種物質(zhì)的絕對定量分析的方法。本研究利用hplc-ms/ms分析平臺、以利血平為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，構(gòu)建了完全定量分析檢測人血清中l(wèi)pc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的方法，繪制每種目標(biāo)溶血磷脂酰膽堿對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；并進一步驗證了該方法平臺的定量限、線性范圍，通過加標(biāo)回收實驗評價其準(zhǔn)確性和血清基質(zhì)對結(jié)果的影響，分析計算該平臺檢測的偏倚以評價其精密度，最終成功建立了一個穩(wěn)定的、靈敏而可靠的定量檢測人血清中l(wèi)pc14:0-lpc18:0五種目標(biāo)lpc類物質(zhì)的檢測平臺。

具體的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種基于hplc-ms/ms檢測平臺的溶血磷脂酰膽堿的絕對定量分析方法，所述方法包括如下步驟：

(1)將人血清標(biāo)本進行預(yù)處理去除干擾蛋白質(zhì)；

(2)經(jīng)過步驟(1)處理的人血清標(biāo)本注入到高效液相色譜柱中完成標(biāo)本的初步分離；

(3)初步分離后的人血清標(biāo)本進入質(zhì)譜儀，完成定量分析離子碎片到的強度和質(zhì)譜圖的繪制。

所述方法使用利血平作為溶血磷脂酰膽堿定量檢測的內(nèi)標(biāo)物。

進一步，將人血清標(biāo)本進行預(yù)處理除去干擾蛋白質(zhì)的過程中加入了0.1％2,6-二叔丁基對甲酚(bht)的甲醇溶液進行前處理。

進一步，步驟(2)中使用的高效液相色譜柱的流動相是0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液、0.1％甲酸-甲醇溶液。

進一步，步驟(3)使用的質(zhì)譜儀采用了turbov^tm離子源和簾氣的設(shè)計、電離模式是電噴霧電離、質(zhì)量分析器是三重四級桿、所述三重四級桿采用的是多反應(yīng)檢測模式進行掃描檢測。

進一步，步驟(1)的詳細(xì)工藝如下：

1)配制含有0.1％bht的甲醇溶液：70ml甲醇溶液加入70mgbht，充分渦旋使bht完全溶解；

2)預(yù)處理去除干擾蛋白前的前處理：

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液：標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液共有s1-s7個濃度水平，稱取lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品分別1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50ml甲醇溶液中，充分混勻溶解后，取5μl移至20μl甲醇溶液中，即制成s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，s7溶液用甲醇稀釋兩倍得s6，s7濃度的溶液甲醇稀釋3倍得s5，s5稀釋2倍得s4，s5稀釋5倍得s3，s3稀釋2倍得s2，s2稀釋2倍得s1。

配制人血清標(biāo)本：取100μl人血清至ep管內(nèi)，加入25μl25μl含有0.1％bht的甲醇，充分渦旋均勻即得一份標(biāo)本；

3)預(yù)處理去除干擾蛋白：先向cleanertppt96孔蛋白沉淀板中加入含100ppb利血平的150μl含有0.1％bht的甲醇溶液，再加入經(jīng)過步驟2)前處理的標(biāo)本25μl，使用96孔板振蕩器于600rpm渦旋5min混合均勻后靜置10min，最后使用cleanertm96生物樣品前處理儀將去蛋白后的溶液收集到潔凈的收集板中備用；

4)將收集板里的溶液在v96樣品氮吹濃縮儀中用氮氣吹干，溫度設(shè)定為30℃；吹干后標(biāo)本再于1ml80％甲醇水溶液中復(fù)溶，渦旋器上混合均勻后即可進行后續(xù)測試，所述甲醇水溶液中含有0.1％bht。

進一步，步驟(2)的詳細(xì)工藝如下：經(jīng)過步驟(1)處理的人血清標(biāo)本注入到高效液相色譜柱中，hplc流動相的參數(shù)如下：0min時，0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液的占比為70％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比為30％；5min時，0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液的占比為50％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比為50％：50％，1min時，0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液的占比為0％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比為100％；4min時，0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液的占比為0％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比為100％；4.1min時，0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液的占比為70％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比為30％；5min時，停止；流速設(shè)定為800μl/min，柱溫固定在30℃，進樣量設(shè)定為5μl。

進一步，步驟(3)的詳細(xì)工藝如下：經(jīng)hplc分離后的標(biāo)本進入質(zhì)譜儀進行鑒定和定量分析，質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置見下面的表格：

表格中“*”表示定量離子對；“q1”指母離子，“q3”指子離子，單位均為質(zhì)荷比m/z；“dp¹”表示去簇電壓，單位是伏特；“ce²”表示碰撞電壓，單位是伏特。

進一步，本發(fā)明使用的所述高效液相色譜柱是durashellc18(l)色譜柱，色譜柱孔徑色譜柱中c18的直徑大小約5μm，色譜柱大小為3.0*50mm。

進一步，前面所述的溶血磷脂酰膽堿選自以下組：lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0、lpc18:0。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于溶血磷脂酰膽堿絕對定量分析的hplc-ms/ms檢測平臺，所述檢測平臺能夠使用前面所述的方法進行溶血磷脂酰膽堿的絕對定量分析。

進一步，上面所述的溶血磷脂酰膽堿選自以下組：lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0、lpc18:0。

本發(fā)明使用了api4000+質(zhì)譜儀，所使用的離子源是turbov^tm離子源，具有離子化效率高，靈敏度高和允許的液相流速范圍寬等特點，同時簾氣設(shè)計可以有效降低交叉污染，抗污染能力強，適用于標(biāo)本基質(zhì)復(fù)雜的待檢樣品，例如本研究中的人血清樣本。對lpc類待檢物質(zhì)的電離模式選擇電噴霧(electrosprayionization，esi)電離。turbov^tm離子源和簾氣的設(shè)計共同使待檢物質(zhì)的電離更加穩(wěn)定和高效。本發(fā)明待測的五種lpc類物質(zhì)經(jīng)電離后成為帶電離子在接口內(nèi)進行去溶劑、聚集、冷卻后進入質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器的作用簡單來說就是將在離子源中電離后產(chǎn)生的帶電離子根據(jù)其質(zhì)荷比的不同分離開來。本研究過程中使用的質(zhì)量分析器是三重四級桿(triplequadrupolemassspectrometr-y，tqms)。三個四級桿在空間上串聯(lián)，第一個四級桿(q1)的主要作用是根據(jù)設(shè)定的質(zhì)荷比范圍掃描并選擇出待檢的五種lpc類物質(zhì)的離子(在第一個四級桿處，待檢離子還沒有進行碰撞分離，稱為母離子)，第二個四級桿，也稱為碰撞池，將母離子碎變?yōu)閮蓚€或多個子離子，并將子離子聚集和傳送給下一級四級桿，第三個四級桿的作用是篩選并傳送子析在碰撞池中產(chǎn)生的碎片子離子。四級桿之后的接收器將離子信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，?jīng)api4000+質(zhì)譜儀的分析軟件軟件分析成離子強度圖，最終完成定量分析子離子碎片的強度和質(zhì)譜圖的繪制。本研究采用三重四級桿的多反應(yīng)檢測模式(multi-reactiionmonitoring，mrm)進行掃描檢測，限定母離子和子離子兩個參數(shù)，選擇性極高，提高了靈敏度。

本發(fā)明通過預(yù)處理、色譜參數(shù)和質(zhì)譜條件的選擇優(yōu)化，建立了hplc-ms/ms液質(zhì)聯(lián)用平臺，并對該技術(shù)的性能進行驗證。

首先是標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性相關(guān)性的驗證。本發(fā)明以生理鹽水為基質(zhì)配制不同濃度梯度的lpc14:0-lpc18:0標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液，通過質(zhì)譜儀自帶軟件分析待測物濃度和峰下面積的關(guān)系并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果顯示lpc14:0-lpc18:0五種lpc的實測濃度和配制濃度之間的r值分別為0.9965、0.9913、0.9956、0.9938和0.9961，相關(guān)系數(shù)r值均在0.99以上。結(jié)果表明每一種lpc類物質(zhì)配制的s1至s7共計七個濃度水平均在直線范圍內(nèi)，說明本發(fā)明建立的hplc-ms/ms方法學(xué)平臺可以滿足對人血清中五種lpc的定量檢測在濃度范圍方面的需求。而且，該方法學(xué)平臺對溶液中l(wèi)pc14:0-lpc18:0的定量檢測下限分別是0.027ppm、0.12ppm、0.32ppm、0.059ppm和0.072ppm。

接下來是hplc-ms/ms技術(shù)平臺準(zhǔn)確度的驗證，本發(fā)明以高(s6)、低(s4)兩個濃度水平加標(biāo)回收率試驗，結(jié)果顯示五種lpc在以生理鹽水為基質(zhì)的高、低兩個濃度水平均具有滿意的回收率，在85％至115％范圍內(nèi)。而且，低濃度的八個樣本的平行試驗結(jié)果數(shù)據(jù)顯示lpc14:0-lpc18:0五種物質(zhì)的平均回收率分別是96.3％、99.9％、103.6％、96.6％和100.0％，均處于95％至105％范圍內(nèi)；八個高濃度水平標(biāo)準(zhǔn)樣品對lpc14:0-lpc18:0五種物質(zhì)的加標(biāo)回收率平均值分別是96.8％、99.1％、97.5％、93.8％和97.7％，亦在95％至105％范圍內(nèi)，證明該方法平臺能夠以高準(zhǔn)確度定量分析以生理鹽水為基質(zhì)的溶液中的lpc14:0-lpc18:0。而本發(fā)明的研究對象是人血清當(dāng)中的lpc14:0-lpc18:0，故而本發(fā)明以血清為基質(zhì)再次進行加標(biāo)回收率實驗已確定基質(zhì)效應(yīng)的大小，結(jié)果顯示以人血清為基質(zhì)時，加標(biāo)回收率也可控制在85％至115％范圍內(nèi)，說明該平臺性能穩(wěn)定，受人血清基質(zhì)效應(yīng)影響較小，適用于對人血清中l(wèi)pc14:0-lpc18:0的定量檢測分析。

最后是本發(fā)明的hplc-ms/ms檢測平臺的精密度驗證，先后八次應(yīng)用本發(fā)明的hplc-ms/ms檢測平臺定量檢測高濃度水平和低濃度水平的lpc14:0-lpc18:0，分析八次檢測結(jié)果的批內(nèi)偏倚值大小，以此來評估hplc-ms/ms平臺的精密度大小，分析結(jié)果提示，兩個濃度水平的cv值均小于15％，符合臨床檢驗工作中對儀器精密度的要求。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

(1)本發(fā)明選用利血平作為定量檢測五種待測溶血磷脂酰膽堿類物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)物，分子量與所要檢測的代謝物相近，所以設(shè)定的質(zhì)譜儀參數(shù)既適用于內(nèi)標(biāo)物利血平的電離和檢測，也滿足待檢的lpc類物質(zhì)的定量分析。此外，利血平的tr時間為2min，而待檢代謝物在2.46min～2.83min，時間間隔較大，不會對目標(biāo)物質(zhì)的定量檢測造成干擾。利血平廉價易得，在多個實驗室具有普適性。

(2)本發(fā)明的方法在標(biāo)本預(yù)處理去蛋白過程中使用加入了0.1％2,6-二叔丁基對甲酚的甲醇溶液進行前處理，2,6-二叔丁基對甲酚對lpc類物質(zhì)具有保護作用，防止其分解；而甲醇對水的親和力大，能破壞人血清蛋白顆粒表面的水化膜，致使蛋白質(zhì)沉淀而除去待測溶液中的蛋白質(zhì)；

(3)本發(fā)明的方法中使用的高效液相色譜柱的流動相-0.1％甲酸25mm甲酸銨-水溶液和0.1％甲酸-甲醇溶液的配比隨時間而改變，待測標(biāo)本中各種物質(zhì)在不同配比的流動相中的溶解度不同而先后被洗脫下來；這就完成色譜過程對樣本的初步分離作用，而不破壞待測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)；

(4)本發(fā)明的方法中采用三重四級桿的多反應(yīng)檢測模式(multi-reactiionmonitoring，mrm)進行掃描檢測，限定母離子和子離子兩個參數(shù)，選擇性極高，提高了靈敏度。

附圖說明

圖1顯示s1濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖2顯示s2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖3顯示s3濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖4顯示s4濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖5顯示s5濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖6顯示s6濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖7顯示s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖；

圖8顯示lpc14:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖9顯示lpc15:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖10顯示lpc16:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖11顯示lpc17:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖12顯示lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不意味著限制本發(fā)明的保護范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1hplc-ms/ms方法學(xué)建立

1、試劑和儀器

標(biāo)本分析過程主要涉及標(biāo)本預(yù)處理、色譜分離、質(zhì)譜鑒定，所使用的試劑和儀器也主要是這三步中需要的。

1.1標(biāo)本預(yù)處理所需試劑及儀器

試劑：(1)甲醇(honeywell公司生產(chǎn)，純度為lc-ms級)、(2)2,6-二叔丁基對甲酚(2,6-di-tert-butyl-p-cresol也稱butylatedhydroxytoluene，bht)，該試劑純度是優(yōu)級純，由百靈威企業(yè)有限公司生產(chǎn)。

儀器：cleanertppt96孔蛋白沉淀板，貨號96cd2025q；cleanertm96生物樣品前處理儀；v96樣品氮吹濃縮儀和96孔收集板。以上儀器均來自天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2色譜分離所需試劑及儀器

試劑：0.1％甲酸(體積比)25mm甲酸銨-水溶液和0.1％甲酸(體積比)-甲醇溶液。甲酸和甲酸銨均是由mreda公司生產(chǎn)，純度均是hplc級，甲醇由hone-ywell公司生產(chǎn)，純度為lc-ms級。

儀器：durashellc18(l)色譜柱，由天津博納艾杰爾科技有限公司生產(chǎn)；色譜柱孔徑色譜柱中c18的直徑大小約5μm，色譜柱大小為3.0*50mm。

1.3質(zhì)譜鑒定所需儀器

儀器：api4000+質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(appliedbiosystems)公司下屬的ab/sciex生產(chǎn)部門制造)，質(zhì)譜儀中使用turbov離子源，三重四級桿(triplequadruple)作為串聯(lián)質(zhì)譜的質(zhì)量分析裝置。

1.4其他試劑

lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品均購自美國avanti公司，純度為100％。

內(nèi)標(biāo)物質(zhì)利血平由sigma公司生產(chǎn)提供。

2、方法

(1)標(biāo)本預(yù)處理

人血清標(biāo)本中含有大量的蛋白質(zhì)，影響對檢測lpc類物質(zhì)的定量檢測，所以需要對標(biāo)本進行預(yù)處理除去干擾蛋白質(zhì)。主要步驟如下：

a、配制含有0.1％bht的甲醇溶液：70ml甲醇溶液加入70mgbht，充分渦旋使bht完全溶解；

b、預(yù)處理去除干擾蛋白前的前處理：

配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液：標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液共有s1-s7個濃度水平，稱取lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品分別1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50ml甲醇溶液中，充分混勻溶解后，取5μl移至20μl甲醇溶液中，即制成s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，s7溶液用甲醇稀釋兩倍得s6，s7濃度的溶液稀釋3倍得s5，s5稀釋2倍得s4，s5稀釋5倍得s3，s3稀釋2倍得s2，s2稀釋2倍得s1。

配制人血清標(biāo)本：取100μl人血清至ep管內(nèi)，加入25μl含有0.1％bht的甲醇，充分渦旋均勻即得一份標(biāo)本；

c、預(yù)處理去除干擾蛋白：先向cleanertppt96孔蛋白沉淀板中加入含100ppb利血平的150μl含有0.1％bht的甲醇溶液，再加入經(jīng)過步驟2)前處理的標(biāo)本25μl，使用96孔板振蕩器于600rpm渦旋5min混合均勻后靜置10min，最后使用cleanertm96生物樣品前處理儀將去蛋白后的溶液收集到潔凈的收集板中備用；

d、將收集板里的溶液在v96樣品氮吹濃縮儀中用氮氣吹干，溫度設(shè)定為30℃；吹干后標(biāo)本再于1ml80％甲醇水溶液(甲醇水溶液中含有0.1％bht)中復(fù)溶，渦旋器上混合均勻后即可進行后續(xù)測試。

(2)色譜分離

將經(jīng)過預(yù)處理的標(biāo)本注入到高效液相色譜柱中，hplc流動相參數(shù)見表1，流速均設(shè)定為800μl/min，柱溫固定在30℃，進樣量設(shè)定為5μl。

表1hplc的流動相條件

(3)質(zhì)譜鑒定

經(jīng)hplc分離后的標(biāo)本進入質(zhì)譜儀進行鑒定和定量分析，質(zhì)譜儀的參數(shù)設(shè)置見表2。

表2質(zhì)譜條件參數(shù)信息

注：*表示定量離子對。q1指母離子，q3指子離子，單位均為質(zhì)荷比m/z。dp¹表示去簇電壓(declusteringpotential，dp)，單位是伏特(v)，主要影響離子進入質(zhì)譜的速度。電壓增高則離子速度加快，離子損失減少，檢測靈敏度相應(yīng)升高。反之則相反。過高的dp會增加離子間的碰撞的幾率，引起源內(nèi)裂解，最后產(chǎn)生碎片離子。所以一般低分子量待測物應(yīng)選擇較低電壓，而高分子量待測物則選用較高電壓。ce²表示碰撞電壓(collisionenergy，ce)單位是伏特(v)，碰撞池內(nèi)對母離子碰撞裂解的電壓。

實施例2hplc-ms/ms方法學(xué)驗證

由于難以獲得完全不含lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的基質(zhì)，所以本發(fā)明首先采用0.9％的生理鹽水代替人血清進行方法學(xué)評估和性能驗證。

1、驗證方法

(1)線性關(guān)系和靈敏度的評估

稱取lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品分別1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50ml甲醇溶液中，取5μl移至20μl甲醇溶液中，即制成表3中s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，用s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品倍比稀釋成s1-s6各梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線確定和線性關(guān)系驗證。將s1濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋至更低濃度梯度上機檢測，測定信噪比(s/n)，直至s/n為10:1。再平行處理五個樣本，滿足cv值小于20％，則此時的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度即為儀器的最低定量限(limitofquantitation，loq)，用最低定量限(loq)值表示本發(fā)明hplc-ms/ms技術(shù)平臺的靈敏度。

表3標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品配制濃度

注：1ppm＝1μg/ml

hplc-ms/ms方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)曲線是由工作站軟件自動處理給出的，主要原理是根據(jù)檢測的s1-s7系列濃度和相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)濃度/內(nèi)標(biāo)物濃度-標(biāo)準(zhǔn)濃度面積/內(nèi)標(biāo)物面積的曲線，并計算曲線方程和相關(guān)系數(shù)(linearcorrelationcoefficient，r)，變異系數(shù)

(2)方法精密度和準(zhǔn)確度確定

a、準(zhǔn)確度

進行加標(biāo)回收實驗評價方法學(xué)的準(zhǔn)確度。

以生理鹽水為基質(zhì)，配制出s3和s5兩個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，配制方法：稱取lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品分別1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50ml甲醇中，取5μl移至20μl甲醇中，即制成表3中s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，用s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品倍比稀釋成s4和s6兩個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。

根據(jù)配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品的濃度(稱為加標(biāo)濃度)和上述樣品的實測濃度(稱為加標(biāo)樣實測濃度)計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率＝加標(biāo)樣實測濃度/加標(biāo)濃度*100％；s6和s4兩個濃度水平分別進行兩個平行實驗。

b、精密度

以s3和s5濃度兩個水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進行精密度的評價。

以s3水平為例，取濃度水平為s3的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進行8個樣品的平行試驗，基質(zhì)為生理鹽水，按照上述步驟上機檢測，利用測量的八個結(jié)果進行平均值(mean，)和標(biāo)準(zhǔn)差(standarddeviation，sd)的計算。最后以變異系數(shù)(coefficientofvariation，cv)值表示該方法學(xué)的精密度，變異系數(shù)s5濃度水平的檢測和計算與s3相同。

(3)人血清為基質(zhì)進行的加標(biāo)回收實驗

由于本發(fā)明的標(biāo)本均是來自人體血清，故而再以人血清為基質(zhì)進行加標(biāo)回收率的檢測，以驗證本發(fā)明的hplc-ms/ms實驗平臺對人血清標(biāo)本是否也有較好的適用性。

以人血清代替生理鹽水配制成s4和s6兩個濃度梯度的加標(biāo)準(zhǔn)品的人血清(以下簡稱“加標(biāo)血清”)，配制方法：稱取lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)品分別1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50ml甲醇中，充分溶解混勻后，取5μl移至20μl甲醇中，即制成表3中s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，用s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品倍比稀釋成s6和s4兩個濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。將5μls4濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到20μl人血清中即可得到s4濃度的加標(biāo)血清，將5μls6濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到20μl人血清中即可得到s6濃度的加標(biāo)血清。

按照實施例1的方法進行預(yù)處理和參數(shù)設(shè)置，測量加標(biāo)血清中l(wèi)pc14:0-lpc18:0五種lpc類物質(zhì)的含量，結(jié)果記為加標(biāo)血清濃度。再用同一血清按照實施例1中的方法進行預(yù)處理和參數(shù)設(shè)置，測量人血清樣本中l(wèi)pc14:0-lpc18:0五種lpc類物質(zhì)的含量，結(jié)果記為人血清濃度。由于人血清中含有濃度可觀的溶血磷脂酰膽堿，實驗檢測兩份人血清樣品用于檢測內(nèi)源性溶血磷脂酰膽堿對結(jié)果的影響。以人血清為基質(zhì)的加標(biāo)回收率計算公式：加標(biāo)回收率＝(加標(biāo)血清濃度-人血清濃度)/加標(biāo)濃度*100％。

2、結(jié)果

1.1靈敏度評估

本發(fā)明的hplc-ms/ms技術(shù)平臺分辨效果良好，圖1-圖7是s1-s7濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液的mrm譜圖，顯示相鄰兩個峰的分辨良好。經(jīng)檢驗，lpc14:0、lpc15:0、lpc16:0、lpc17:0和lpc18:0的loq值分別是0.027ppm、0.12ppm、0.32ppm、0.059ppm和0.072ppm。表明本發(fā)明的hplc-ms/ms技術(shù)平臺的靈敏度高。

3.2線性關(guān)系評估

根據(jù)表3中不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測結(jié)果中圖譜的中峰面積和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析相關(guān)系數(shù)r值的大小，結(jié)果顯示lpc14:0-lpc18:0五種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：y＝0.725x+0.00264、y＝0.212x-0.0256、y＝0.212x+0.268、y＝0.366x+0.00653和y＝0.31x+0.287；各指標(biāo)對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)r值分別為0.9965、0.9913、0.9956、0.9938和0.9961。以lpc14:0為例，圖8所示x軸為lpc14:0與內(nèi)標(biāo)物(利血平)濃度比值，y為lpc14:0與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，每一個上機樣本里加入的內(nèi)標(biāo)物體積及濃度是一致的，所以利用上機樣本檢測結(jié)果中的峰面積，代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，即可計算出相應(yīng)的目標(biāo)待測物的濃度。lpc15:0-lpc18:0的標(biāo)準(zhǔn)曲線和目標(biāo)待測物濃度分析的原理與lpc14:0的相同，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖分別見圖9-圖12。

線性范圍的評估過程中，s1至s7共計七個系列濃度均在線性范圍內(nèi)，故而認(rèn)為lpc14:0-lpc18:0五種物質(zhì)在該平臺檢測的線性范圍即s1至s7濃度范圍。在該范圍內(nèi)的檢測結(jié)果可信，超出范圍的檢測結(jié)果不可信。

3.3準(zhǔn)確度評估

hplc-ms/ms技術(shù)平臺的準(zhǔn)確度用s4和s6兩個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品各兩個平行樣的加標(biāo)回收率表示，計算公式為加標(biāo)回收率＝加標(biāo)樣實測濃度/加標(biāo)濃度*100％，測量結(jié)果和計算結(jié)果整理如表4。

表4生理鹽水基質(zhì)加標(biāo)回收率數(shù)據(jù)

由上表可見，lpc14:0-lpc18:0五種標(biāo)準(zhǔn)品在s4和s6兩個濃度水平的兩個平行樣，其加標(biāo)回收率均在85％-115％范圍內(nèi)。

3.4精密度評估

精密度用變異系數(shù)cv值來表示，s4和s6兩個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品進行8個樣本的平行試驗，分別計算lpc14:0-lpc18:0的八個測量值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，計算得其cv值。其中，lpc14:0-lpc18:0在s4水平的cv分別是：6.3％、6.4％、8.5％、7.1％和7.0％；lpc14:0-lpc18:0在s6濃度的cv值結(jié)果分別是：11.3％、12.1％、12.3％、12.0％和11.3％?？梢娢宸Nlpc類標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)的cv檢測結(jié)果均小于15％。

3.5人血清為基質(zhì)進行的加標(biāo)回收實驗

為明確該hplc-ms/ms平臺在人血清中應(yīng)用的適用性，以人血清為基質(zhì)進行的加標(biāo)回收實驗，結(jié)果整理見表5。如表5中所示，人血清樣本的lpc14:0-lpc18:0的濃度明顯高于靈敏度結(jié)果部分的loq值，且都處于線性驗證實驗中的線性范圍(s1至s7濃度范圍)內(nèi)，結(jié)果具有可信性。此外，在s4和s6兩個標(biāo)準(zhǔn)物濃度以人血清樣本為基質(zhì)的加標(biāo)回收率均落在85％至115％范圍內(nèi)，與以生理鹽水為基質(zhì)的加標(biāo)回收率沒有顯著差異，所以可以認(rèn)為人血清基質(zhì)對該技術(shù)平臺的影響不大，即hplc-ms/ms平臺對血清標(biāo)本也有良好的適用性。

表5以人血清為基質(zhì)加標(biāo)回收實驗結(jié)果

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。