一種尖孢鐮刀菌及其在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種尖孢鐮刀菌及其在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用。所述尖孢鐮刀菌的保藏編號(hào)為CCTCC?No.M2013432。本發(fā)明的尖孢鐮刀菌能利用自毒物質(zhì)作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，屬礦化作用，對(duì)去除栽培水體或土壤中的自毒物質(zhì)、克服連作障礙具有積極的意義。在以自毒物質(zhì)為唯一碳源和能源生長(zhǎng)72h時(shí)，對(duì)肉桂酸的降解率最高達(dá)99.53%，對(duì)苯甲酸的降解率最高達(dá)97.9%，對(duì)香蘭素的降解率最高達(dá)92.5%，對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解率最高達(dá)95.6%，而且在降解自毒物質(zhì)的同時(shí)不會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生任何副作用；使用方法簡(jiǎn)單、方便，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種尖孢鐮刀菌及其在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用領(lǐng)域，尤其涉及一種尖孢鐮刀菌及其在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]自毒物質(zhì)是指植物通過(guò)地上部淋溶、根系分泌和植株殘茬腐解等途徑釋放并對(duì)同茬或下茬同種或同科植物生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用的化學(xué)物質(zhì)。黃瓜土壤中積累的自毒物質(zhì)主要由肉桂酸、苯甲酸和水楊酸在內(nèi)的十余種酚酸類化合物構(gòu)成。這些物質(zhì)一方面通過(guò)影響離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質(zhì)和DNA合成等多種途徑來(lái)影響植物生長(zhǎng)，而更為重要的是自毒物質(zhì)在根際土壤中的累積為根際病原菌提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)，加速其繁殖，從而導(dǎo)致連作障礙的發(fā)生。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)，較易發(fā)生連作障礙的黃瓜、西瓜、甜瓜、番茄和茄子等作物均具有分泌自毒物質(zhì)的能力。近年來(lái)，由于設(shè)施農(nóng)業(yè)的產(chǎn)業(yè)化、專業(yè)化、規(guī)?；冉?jīng)營(yíng)模式的出現(xiàn)，也使得我國(guó)各地相繼涌現(xiàn)出具有特色的專業(yè)產(chǎn)地及從事某一特定蔬菜生產(chǎn)的農(nóng)民。長(zhǎng)期連作導(dǎo)致土壤自毒物質(zhì)的大量累積，許多連作土壤需要5年以上的輪作才能緩解連作障礙。對(duì)于專業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)營(yíng)者而言，自毒物質(zhì)的累積成為導(dǎo)致連作障礙、制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展、限制增收的重要因素。
[0004]最直接的去除自毒物質(zhì)的方法包括活性炭吸附和施加土壤消毒物質(zhì)(例如石灰氮)等理化方法。但活性炭吸附只適用于水培、基質(zhì)培等無(wú)土栽培，通過(guò)肥水循環(huán)系統(tǒng)中活性炭的過(guò)濾達(dá)到對(duì)自毒物質(zhì)凈化，無(wú)法應(yīng)用于土壤中。而土壤消毒又因成本過(guò)高，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染以及過(guò)量施用會(huì)對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育不利等原因而在實(shí)際應(yīng)用中受到局限。尋求低成本、高效率、無(wú)副作用的去除自毒物質(zhì)的方法是科研工作者的當(dāng)務(wù)之急。
[0005]眾所周知，土壤具有自我修復(fù)能力，這是因?yàn)橥寥乐猩娴奈⑸锬軌蚍置谶^(guò)氧化物酶、漆酶、水解酶等物質(zhì)，而這些物質(zhì)均能對(duì)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分解。因此篩選、分離能夠高效降解連作障礙自毒物質(zhì)的微生物是去除自毒物質(zhì)的優(yōu)選途徑。
[0006]公布號(hào)為CN103045506A的中國(guó)專利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種連作障礙自毒物質(zhì)降解菌及其制備的復(fù)合微生物肥料，該連作障礙自毒物質(zhì)降解菌為枯草芽孢桿菌，保藏編號(hào)為CGMCCN0.6896。該菌株對(duì)苯甲酸有一定的降解能力，但未記載該菌株對(duì)苯甲酸的降解效率,且該菌株對(duì)苯甲酸以外的自毒物質(zhì)是否有降解作用也未可知，無(wú)法有效消除自毒物質(zhì)引起的連作障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明公開(kāi)了一種尖孢鐮刀菌，該菌株能對(duì)栽培基質(zhì)中存在的自毒物質(zhì)進(jìn)行有效降解，消除連作障礙。
[0008]—種尖孢鐮刀菌，分類命名為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum),株號(hào)為YY186-1，已于2013年9月17日保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為 CCTCC N0.M2013432o
[0009]該尖孢鐮刀菌的18SrRNA序列如SEQ ID N0.1所示，其主要生物學(xué)特征為:菌落突起絮狀，粉白色、質(zhì)密；孢子粉質(zhì)、鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔；最適生長(zhǎng)條件為pH值7.0，溫度28°C，并能以肉桂酸、苯甲酸、香蘭素或?qū)αu基苯甲酸作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)。
[0010]基于該菌株的生長(zhǎng)特性，本發(fā)明還提供了一種所述尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括碳源和無(wú)機(jī)鹽，所述碳源為肉桂酸、苯甲酸、香蘭素或?qū)αu基苯甲酸中的至少一種。
[0011]作為優(yōu)選，所述碳源為肉桂酸，濃度為75~150mg/L。在肉桂酸、苯甲酸、香蘭素或?qū)αu基苯甲酸中，該尖孢鐮刀菌對(duì)肉桂酸的利用率最高。
[0012]作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配方為:肉桂酸150mg/L，NaCl0.5g，MgSO4.7H200.2g, NH4NO3L Og, KHPO4L Og, K2HPO4L Og, GaCl2.2H200.02g, FeCl3.6H200.05g,蒸懼水補(bǔ)足至1000mL,攪拌均勻,調(diào)節(jié)pH值至7.0,121°C下高壓蒸汽滅菌20min。
[0013]本發(fā)明的尖孢鐮刀菌分離自連作土壤，是經(jīng)含肉桂酸的選擇培養(yǎng)基篩選獲得的。肉桂酸是連作土壤中較具代表性的自毒物質(zhì)，因此本發(fā)明還提供了所述尖孢鐮刀菌在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括:將尖孢鐮刀菌菌懸液投加到栽種作物的培養(yǎng)液或土壤中。
[0014]由于本發(fā)明的尖孢鐮刀菌能利用自毒物質(zhì)作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)，屬礦化作用，對(duì)去除栽培水體或土壤中的自毒物質(zhì)、克服連作障礙具有積極的意義。
[0015]所述連作障礙連作障 礙自毒物質(zhì)為苯甲酸、香蘭素、對(duì)羥基苯甲酸或肉桂酸。
[0016]經(jīng)測(cè)試，當(dāng)將尖孢鐮刀菌菌懸液投加到以各自毒物質(zhì)為唯一碳源和能源的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(添加菌液后培養(yǎng)基OD415約為0.2)時(shí)，尖孢鐮刀菌對(duì)肉桂酸的降解率最高達(dá)99.53%，對(duì)苯甲酸的降解率最高達(dá)97.9%，對(duì)香蘭素的降解率最高達(dá)92.5%，對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解率最高達(dá)95.6%。
[0017]本發(fā)明還提供了一種包含有所述尖孢鐮刀菌的菌劑，該菌劑的OD415為2.0~3.0。該菌懸液可以是將所述尖孢鐮刀菌與常規(guī)的附加劑混合后制成的水劑，所述附加劑可選用0.2~0.3mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)。
[0018]在需要對(duì)自毒物質(zhì)進(jìn)行降解處理時(shí)，將所述菌劑直接投加(或經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后投加)到栽種作物的培養(yǎng)液或土壤中即可，作為優(yōu)選，將所述菌劑稀釋十倍后，以5~15mL/10L的比例投加到培養(yǎng)液中，或以0.5_2L/m2的比例投加到土壤中。
[0019]作為優(yōu)選，菌劑的添加時(shí)機(jī)為:對(duì)于長(zhǎng)期使用、更換頻率較低的培養(yǎng)液，優(yōu)選在作物生長(zhǎng)期的中間時(shí)段添加菌劑；對(duì)于流動(dòng)培養(yǎng)液則無(wú)需添加菌劑；對(duì)于土培，如果前茬作物是連作障礙比較嚴(yán)重的作物，優(yōu)選在下茬作物定植前1-15天將菌劑投加到土壤中即可，在下茬作物的生長(zhǎng)期中則無(wú)需添加菌劑。
[0020]本發(fā)明的尖孢鐮刀菌可用于栽種有黃瓜、西瓜、甜瓜、番茄、茄子等多種作物的水體或土壤中，只要這些作物能夠分泌苯甲酸、香蘭素、對(duì)羥基苯甲酸或肉桂酸中的至少一種自毒物質(zhì)。
[0021 ] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0022]本發(fā)明的尖孢鐮刀菌可快速、高效、安全地降解水體和土壤中作物分泌的自毒物質(zhì)，在以自毒物質(zhì)為唯一碳源和能源生長(zhǎng)72h時(shí)，對(duì)肉桂酸的降解率最高達(dá)99.53%，對(duì)苯甲酸的降解率最高達(dá)97.9%，對(duì)香蘭素的降解率最高達(dá)92.5%，對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解率最高達(dá)95.6%，而且在降解自毒物質(zhì)的同時(shí)不會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生任何副作用；使用方法簡(jiǎn)單、方便，成本低廉，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明尖孢鐮刀菌的平板菌落生長(zhǎng)圖；
[0024]圖2為本發(fā)明尖孢鐮刀菌的分生孢子顯微形態(tài)觀察圖；
[0025]
[0026]圖3為本發(fā)明尖孢鐮刀菌在純培養(yǎng)條件下對(duì)苯甲酸的降解曲線；
[0027]圖4為本發(fā)明尖孢鐮刀菌在純培養(yǎng)條件下對(duì)香蘭素的降解曲線；
[0028]圖5為本發(fā)明尖孢鐮刀菌在純培養(yǎng)條件下對(duì)對(duì)羥基苯甲酸的降解曲線；
[0029]圖6為施加本發(fā)明尖孢鐮刀菌對(duì)黃瓜植株干重的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0030]I培養(yǎng)基和溶液配制
[0031](I)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液=NaCl0.5g，MgSO4.7Η200.2g，NH4NO3L 0g, KHPO4L 0g,K2HPO4L 0g, GaCl2.2Η200.02g, FeCl3.6Η200.05g,蒸餾水補(bǔ)足 1000mL,攪拌均勻，調(diào)節(jié) pH 值至7.0,121°C下高壓蒸汽滅菌20min。
[0032](2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏10g、蛋白胨5.0g、氯化鈉5.0g、蒸餾水補(bǔ)足至1000mL,混合后攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至7.0,121°C下高壓蒸汽滅菌20min。
[0033](3)孟加拉紅培養(yǎng)基=KH2PO4L 0g、MgSO4.7H200.5g、蛋白胨5g、葡萄糖5g、瓊脂16g、孟加拉紅0.053g,蒸懼水1000mL,調(diào)節(jié)pH值至7.0,121°C下高壓蒸汽滅菌20min ;使用前加SOyg/mL的氯霉素。
[0034](4) PDA培養(yǎng)基:將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取200g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(煮沸20~30分鐘，能被玻璃棒戳破即可)，用八層紗布過(guò)濾，加熱，加瓊脂15g/L，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20g，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1000毫升，121°C下高壓蒸汽滅菌20分鐘后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?br> [0035](5)0.2mol/L 磷酸緩沖液(ρΗ7.0):磷酸氫二鈉(2mol/L)61mL，磷酸二氫鈉(2mol/L) 39mL,加蒸懼水定容至1000mL, 121°C下高壓蒸汽滅菌20min。
[0036]2菌株分離純化
[0037](1)連作土壤樣品采自浙江大學(xué)華家池校區(qū)農(nóng)場(chǎng)，取Ig連作土壤置于IOOmL三角瓶中，加入20mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液，黑暗振蕩培養(yǎng)(28°C、180r/min) I周；
[0038](2)取上層濁液ImL接種于含75mg/L肉桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，黑暗振蕩培養(yǎng)(28°C、180r/min) 1周；
[0039](3)重復(fù)步驟(2)4次，其中第I~3次培養(yǎng)時(shí)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中肉桂酸濃度為75mg/L，第4次培養(yǎng)時(shí)無(wú) 機(jī)鹽培養(yǎng)液中肉桂酸濃度為100mg/L，每次培養(yǎng)的接種物均取自上次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液；
[0040](4)蘸取少量第4次培養(yǎng)獲得的培養(yǎng)液，分別在含100mg/L肉桂酸的牛肉膏蛋白胨和孟加拉紅培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線分離，于生化培養(yǎng)箱(28°C )中培養(yǎng)；
[0041](5)待平板上出現(xiàn)單菌落后，挑取特征不同的單菌落分別轉(zhuǎn)接至含有100mg/L肉桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中進(jìn)行搖床培養(yǎng)(28°C、180r/min) I周；
[0042](6)再分別從步驟(5)的每份培養(yǎng)液中蘸取少量培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的100mg/L肉桂酸無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中進(jìn)行搖床培養(yǎng)(28°C、180r/min) I周；
[0043](7)重復(fù)步驟(6) 5次，選取仍能在含有100mg/L肉桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中快速生長(zhǎng)的菌株，接種于孟加拉紅斜面培養(yǎng)基上，保存。
[0044]3菌株鑒定
[0045]( I)形態(tài)鑒定
[0046]將孟加拉紅斜面培養(yǎng)基上的菌株挑取單斑在PDA培養(yǎng)基上劃線，于28°C下培養(yǎng)3天，菌落突起絮狀，粉白色、質(zhì)密(圖1);挑取菌絲制作水玻片進(jìn)行顯微觀察，觀察結(jié)果如圖2所示，孢子粉質(zhì)、鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔。
[0047](2)分子鑒定
[0048]采用普通PCR方法提取該菌株核糖體DNA上的的ITS序列，并委托南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID N0.1所示。在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)和分析，將該菌株鑒定為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)。
[0049]4菌劑制備
[0050](I)將保藏在試管斜面上的菌種接種于20mL含有100mg/L肉`桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中，于28°C下活化培養(yǎng)7天；
[0051](2)取活化好的菌種100μ L接種于200mL含100mg/L肉桂酸的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C、180r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
[0052](3)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種離心(8000Xg) lOmin，倒掉上清，菌體用30mL0.2mol/L的磷酸緩沖液(pH7.0)洗滌3次；
[0053](4)將步驟(3)得到的菌體懸浮于0.2mol/L的磷酸緩沖液(ρΗ7.0)中，制成OD415為2.0~3.0的菌懸液，即為菌劑。
[0054]5無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中肉桂酸的檢測(cè)
[0055]將20mL含肉桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入燒杯中,用lmol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至8.0,然后加入適量的無(wú)水乙醚，置于分液漏斗中劇烈振蕩，待靜置分層后收集下層液體(水相)。
[0056]用lmol/L HCl調(diào)節(jié)水相的pH至2.0，再加入適量的無(wú)水乙醚，振蕩搖勻，收集上層(有機(jī)相)；加入適量CaCl2或CaSO4除水，并置于40°C水浴使乙醚揮發(fā)；待濃縮至l_2mL后轉(zhuǎn)移至離心管中高速離心(10000Xg，10min)，去乙醚后再加甲醇溶解，用高效液相色譜進(jìn)行肉桂酸含量分析；分析參數(shù)為:
[0057]高效液相色譜儀:SHIMADZULC-1OAD ；
[0058]檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器；
[0059]液相色譜柱:0DS120柱(4.6X250nm)；
[0060]流動(dòng)相:2 %的醋酸溶液:甲醇(色譜純)=1:1;
[0061]總流速:lmL/min;
[0062]進(jìn)樣量:5yL;
[0063]柱溫:40°C；
[0064]測(cè)定時(shí)間:20min;
[0065]測(cè)定波長(zhǎng):280nm。[0066]肉桂酸殘留量的計(jì)算公式如下:
[0067]X= (AxXV0) / (A0XVx) XCs ；
[0068]其中:X為待測(cè)樣品中肉桂酸的濃度(mg/L) ；AX為樣品中肉桂酸的峰面積；A。為肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；VX為樣品體積(mL);V。為最后定各體積(mL);Cs為肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度(mg/L)。
[0069]肉桂酸降解率的計(jì)算公式如下:
[0070]P (%)= (1-CX/C。)X 100%
[0071]其中:P為待測(cè)樣品中肉桂酸的降解率(％);CX為樣品中肉桂酸殘留濃度(mg/L);C。為樣品中肉桂酸初始濃度(mg/L )。
[0072]6肉桂酸回收率試驗(yàn)
[0073]分別制備含0.1、1、10和100mg/L肉桂酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液,然后根據(jù)第5部分的方法對(duì)無(wú)機(jī)培養(yǎng)液中的肉桂酸進(jìn)行回收，并利用高效液相色譜儀對(duì)肉桂酸含量進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)3次，同時(shí)做空白試驗(yàn)。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中肉桂酸的平均回收率和變異系數(shù)見(jiàn)表
1
[0074]表1無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中肉桂酸的平均回收率和變異系數(shù)
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種尖孢鐮刀菌，其特征在于，命名為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) YY186-1,保藏編號(hào)為 CCTCC N0.M2013432。
2.一種如權(quán)利要求1所述尖孢鐮刀菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括碳源其特征在于，所述碳源為肉桂酸、苯甲酸、香蘭素或?qū)αu基苯甲酸中的至少一種。
3.如權(quán)利要求2所述的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源為肉桂酸，濃度為75~150mg/Lo
4.一種包含有如權(quán)利要求1所述尖孢鐮刀菌的菌劑。
5.如權(quán)利要求4所述的菌劑，其特征在于，所述菌劑的OD415為2.0~3.0。
6.如權(quán)利要求1所述尖孢鐮刀菌在降解連作障礙自毒物質(zhì)中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括:將尖孢鐮刀菌菌懸液投加到栽種作物的培養(yǎng)液或土壤中。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述連作障礙自毒物質(zhì)為苯甲酸、香蘭素、對(duì)羥基苯甲酸或肉桂酸。
【文檔編號(hào)】C12R1/77GK103834573SQ201310754556
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】喻景權(quán), 宋劉霞, 葉素芬, 周艷虹, 師愷, 夏曉劍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)