本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
：牛是我國(guó)重要的畜牧種類之一，隨著集約化和規(guī)?；B(yǎng)殖的不斷發(fā)展，牛病毒性傳染性疾病的發(fā)病率逐年提高。許多牛的傳染性疾病在國(guó)內(nèi)大型規(guī)模化牧場(chǎng)長(zhǎng)期流行，因疾病傳染快，發(fā)病率、死亡率高嚴(yán)重制約著我國(guó)牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展；更為嚴(yán)重的是一些人畜共患傳染病如牛的布魯氏菌病、結(jié)核病等直接威脅人類的生命健康。目前對(duì)牛傳染性疾病的預(yù)防和治療途徑主要是通過疫苗接種和使用抗生素。大部分抗生素類藥物以及傳統(tǒng)的口服抗病毒藥物，由于藥物殘留問題，給健康帶來負(fù)面影響；而傳統(tǒng)的疫苗，由于它的高特異性以及副作用，無法抵抗病毒變異和新型病毒不斷出現(xiàn)給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大危害。干擾素以其廣譜的抗病毒活性和廣泛的免疫調(diào)節(jié)能力決定了其具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，可以用來預(yù)防和治療牛病毒性細(xì)菌性傳染性疾病。ifn是一類病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年issacs和lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒rna來抑制病毒的生長(zhǎng)繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性?，F(xiàn)已知，γ型ifn是由激活的t細(xì)胞和nk細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對(duì)免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所以ifn-γ又稱為免疫調(diào)節(jié)干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)，但干擾素γ的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和確定機(jī)體長(zhǎng)期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。細(xì)胞因子il-2即白細(xì)胞介素2，又名t細(xì)胞生長(zhǎng)因子。主要由活化的t淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，既可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫功能，又能限制t細(xì)胞反應(yīng)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫耐受，故可用于治療腫瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在獸醫(yī)中，由于il-2能提高疫苗的免疫應(yīng)答和減少疾病的發(fā)生，也出現(xiàn)廣闊的應(yīng)用前景。il-2因能增強(qiáng)機(jī)體的免疫水平，提高機(jī)體的抗病能力，因而用于細(xì)菌性、病毒性和寄生蟲性疾病的免疫治療。此外，il-2還可影響藥物的代謝，使藥物的代謝時(shí)間延長(zhǎng)，作用時(shí)間增加，從而提高藥物療效。il-2與其他細(xì)胞因子根據(jù)基因構(gòu)建，組成融合蛋白，以增強(qiáng)疫苗的抗體產(chǎn)生和提高細(xì)胞免疫水平。血清白蛋白是血漿的重要成分，正常情況下不易透過腎小球，體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，是理想的藥物載體。白蛋白融合技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：白蛋白與目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵鏈接，不需額外的體外處理；白蛋白的表達(dá)水平較高，與其融合后可以提高目的蛋白的表達(dá)水平；白蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的“惰性蛋白”，與其融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性；白蛋白融合蛋白具有較長(zhǎng)的藥物半衰期，將小分子蛋白藥物與白蛋白融合可有望提高在血液中的半衰期。目前，多種蛋白與白蛋白融合后在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)半衰期的延長(zhǎng)得到了證實(shí)。天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個(gè)小時(shí)。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應(yīng)的時(shí)間成本及經(jīng)濟(jì)成本隨之增加，而機(jī)體的耐受極限也有可能被突破導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個(gè)：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。而市面上常見的長(zhǎng)效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導(dǎo)致半衰期短的問題，同時(shí)聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于臨床上應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白及其制備方法，并由此融合蛋白與凍干保護(hù)劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥制備得到一種重組牛長(zhǎng)效干擾素，所述重組牛長(zhǎng)效干擾素可顯著提高牛干擾素的半衰期，較普通牛干擾素的半衰期提高19倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高牛自身的免疫應(yīng)答。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如sequencelisting400〈1〉所示。本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示，記為基因組1；或如sequencelisting400〈3〉所示，記為基因組2。所述基因組1和所述基因組2均可編碼所述融合蛋白?；蚪M2是對(duì)基因組1的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化之后的結(jié)果，通常密碼子適應(yīng)指數(shù)cai＝1.0時(shí)被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中為最優(yōu)的高效表達(dá)狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達(dá)水平越低?；蛑術(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會(huì)影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛白蛋白、牛ifn-γ、牛il-2原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.22、0.24、0.19，gc百分比為42.9％、39.8％、39.1％；而通過對(duì)牛白蛋白、牛ifn-γ、牛il-2基因優(yōu)化后得到各基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)為0.99、1.0、0.94，gc百分比49.9％、44.8％、48.2％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對(duì)蛋白表達(dá)的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的基因工程菌。進(jìn)一步地，所述基因工程菌為pet-32a/ralb-ifnγ-il2。含有基因組1或基因組2的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌宿主細(xì)胞，更進(jìn)一步地，所述大腸桿菌宿主細(xì)胞為bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種重組牛長(zhǎng)效干擾素，所述重組牛長(zhǎng)效干擾素由所述的融合蛋白與凍干保護(hù)劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護(hù)劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。本發(fā)明還公開了所述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將含有基因組1或基因組2的表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，獲得基因工程菌，基因工程菌經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后得到所述融合蛋白的粗品，經(jīng)純化后即可得到融合蛋白。所述表達(dá)載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達(dá)載體；所述基因工程菌為pet-32a/ralb-ifnγ-il2，其制備方法為：(1)設(shè)計(jì)引物，通過反轉(zhuǎn)錄獲得或人工分別合成連接有柔性linker序列的合成牛白蛋白、牛干擾素γ、牛白細(xì)胞介素2的目的基因；通過柔性linker將牛白蛋白、牛干擾素γ、牛白細(xì)胞介素2的目的基因連接起來，連接后的目的基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示或如sequencelisting400〈3〉所示；(2)將連接后的目的基因連接到pet-32a質(zhì)粒上獲得表達(dá)載體；(3)將表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，即可得到基因工程菌pet-32a/ralb-ifnγ-il2。所述大腸桿菌宿主細(xì)胞為bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。所述純化的方法為：融合蛋白的粗品先后經(jīng)親和層析、陰離子交換層析和分子篩層析純化。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號(hào)為v205。所述基因組1的獲取方法為：a.引物設(shè)計(jì)牛白蛋白(alb)的引物序列為：上游alb-f1：ccggaattcatgaagtgggtgactt，帶有ecori酶切位點(diǎn)；下游alb-r1：accaccaccagaaccaccaccaccggctaaggctgtttg，帶有柔性linker；牛干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatgaaatatacaagctattt，帶有柔性linker；下游ifn-γ-r1：accaccaccagaaccaccaccacccgttgatgctctcc，帶有柔性linker；牛白細(xì)胞介素2(il-2)的引物序列為：上游il-2-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatgtacaagatacaactct，帶有柔性linker；下游il-2-r1：ccctcgagagtcattgttgagtagat，帶有xhoi酶切位點(diǎn)；b.從牛肝臟中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉所示和sequencelisting400〈6〉所示；分別以牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因?yàn)槟０澹⒎謩e利用牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，模板rna1.5μl，上下游引物各0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)；95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker連接牛alb和牛ifn-γ目的基因得到ralb-ifnγ基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的alb基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，alb上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker連接ralb-ifnγ基因和牛il-2目的基因得到ralb-ifnγ-il2基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，ralb-ifnγ基因模板dna1μl，連接有柔性linker的il-2模板dna1μl，alb上游引物0.5μl，il-2下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min?；蚪M2是對(duì)基因組1進(jìn)行優(yōu)化之后，人工合成的基因，所述基因組2的獲取方法為：a.引物設(shè)計(jì)牛白蛋白(alb)的引物序列為：上游alb-f2：cgggatccatgaaatgggttacctt，帶有bamhi酶切位點(diǎn)；下游alb-r2：accaccaccagaaccaccaccaccagccagagcggtc，帶有柔性linker；牛干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatgaaatacacctcttac，帶有柔性linker；下游ifn-γ-r2：accaccaccagaaccaccaccaccggtagaagcacgacg，帶有柔性linker；牛白細(xì)胞介素2(il-2)：上游il-2-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatgtacaaaatccagct，帶有柔性linker；下游il-2-r2：ccctcgagggtcatggtagagtaga，帶有xhoi酶切位點(diǎn)。b.所述牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示；分別以牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因?yàn)槟０?，并分別利用牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，基因組dna1μl，上下游引物各0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)；95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker連接牛alb和牛ifnγ目的基因得到ralb-ifnγ基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的alb基因模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，alb上游引物0.5μl，ifn-γ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。d.利用柔性linker連接ralb-ifnγ基因和牛il2目的基因得到ralb-ifnγ-il2基因連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，ralb-ifnγ基因模板dna1μl，連接有柔性linker的il-2模板dna1μl，alb上游引物0.5μl，il-2下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明還提供了所述重組牛長(zhǎng)效干擾素的應(yīng)用，其半衰期長(zhǎng)達(dá)76小時(shí)以上，具有廣譜抗病毒作用并能提高牛自身的免疫應(yīng)答。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.通過柔性linker將牛alb、牛ifn-γ和牛il-2基因?qū)崿F(xiàn)融合表達(dá)，提高了干擾素半衰期，與普通干擾素相比，提高了19倍以上；2.通過對(duì)牛alb、牛ifn-γ和牛il-2基因進(jìn)行優(yōu)化，提高了牛牛alb、牛ifn-γ和牛il-2融合蛋白的表達(dá)量。3.以重組大腸桿菌pet-32a/ralb-ifnγ-il2作為表達(dá)菌株，通過引入分子伴侶pgro7質(zhì)粒，在蛋白表達(dá)時(shí)產(chǎn)生包涵體較少，形成大量可溶性蛋白，避免了包涵體變性和復(fù)性的過程，大大縮短了融合蛋白表達(dá)的時(shí)間；4.本發(fā)明公開的由牛alb、牛ifn-γ和牛il-2組成的融合蛋白不僅具有ifn-γ的廣譜抗病毒作用，同時(shí)顯著提高了牛自身的免疫應(yīng)答。附圖說明圖1為實(shí)施例1中的牛白蛋白基因、牛白介素2基因與牛干擾素γ基因rt-pcr擴(kuò)增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：牛白介素2基因rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2：牛干擾素γ基因rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3：牛白蛋白基因rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為實(shí)施例1中的牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因連接之后的pcr擴(kuò)增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl10000；泳道1：牛白蛋白基因、牛干擾素γ基因與牛白介素2基因連接擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為實(shí)施例1中的陽性克隆質(zhì)粒的pcr擴(kuò)增及雙酶切鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl10000；泳道1：重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；泳道2：質(zhì)粒pcr結(jié)果；圖4為實(shí)施例1中的重組蛋白的sds-page電泳檢查結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后上清；泳道2：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后沉淀；泳道3：空載對(duì)照；圖5為實(shí)施例1得到的融合蛋白的westernblot鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：重組菌誘導(dǎo)破碎后沉淀；泳道2：為重組菌誘導(dǎo)破碎后上清；圖6為實(shí)施例5中由實(shí)施例1中的融合蛋白制得的重組牛長(zhǎng)效干擾素對(duì)vsv致細(xì)胞病變的抑制作用；1為vsv病毒對(duì)照孔；2為hep-2細(xì)胞對(duì)照孔；a3-12為梯度稀釋(從右向左)的人干擾素標(biāo)準(zhǔn)品處理孔；b3-12為梯度稀釋(從右向左)的重組牛長(zhǎng)效干擾素處理孔；圖7為實(shí)施例8中由實(shí)施例1中的融合蛋白制得的重組牛長(zhǎng)效干擾素肌肉注射血藥濃度-時(shí)間變化曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.牛白蛋白(alb)、牛干擾素γ(ifn-γ)與牛白細(xì)胞介素2(il-2)目的基因的獲取與擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)：根據(jù)genebank中已報(bào)道的目的基因序列設(shè)計(jì)合成引物見表1，在牛白蛋白的上游引物和下游引物中分別引入ecori酶切位點(diǎn)和linker序列，在牛干擾素γ的上游引物和下游引物中分別引入linker序列，在牛白細(xì)胞介素2的上游引物和下游引物中分別引入linker序列和xhoi酶切位點(diǎn)。表1pcr擴(kuò)增引物rt-pcr獲取目的基因：從牛肝臟組織中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因，三者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉、sequencelisting400〈5〉和sequencelisting400〈6〉所示；rt-pcr反應(yīng)體系(25μl)見表2表2rt-pcr反應(yīng)體系rnasefree水10μldntpmix10μl反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組rna1.5μl反應(yīng)參數(shù)為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：95℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1850bp、560bp和490bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖1所示，說明制備得到了牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接各段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表3、表4所示：表3ralb-ifnγpcr反應(yīng)體系表4ralb-ifnγ-il2pcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在2840bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖2所示，圖2中出現(xiàn)了ralb-ifnγ和il-2擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，這是因?yàn)樵趓alb-ifnγ和il-2基因連接的過程中，出現(xiàn)了非特異反應(yīng)。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈2〉所示。3.表達(dá)載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測(cè)序無誤后，pcr膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用ecori和xhoi限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切和回收，按表5中的20μl體系做雙酶切：表5雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對(duì))1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表6中的體系進(jìn)行連接，4℃過夜連接：表6酶連體系目的片段dna10μl表達(dá)載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，將感受態(tài)細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板過夜培養(yǎng)；挑取lb平板上的單菌落進(jìn)行目的基因pcr鑒定，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)ecori和xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示工程菌構(gòu)建成功，pcr擴(kuò)增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在2840bp左右處檢測(cè)出單一條帶，其結(jié)果如圖3所示。4.重組蛋白的表達(dá)挑取工程菌于含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖床復(fù)蘇1h，工程菌記為pet-32a/ralb-ifnγ-il2；在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h(od≈1.0)，加入終濃度100μg/mliptg，32℃誘導(dǎo)表達(dá)5h；收集菌體，經(jīng)sds-page電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在122.6kd左右處可見優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶，說明在沉淀和上清中均成功表達(dá)了融合蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個(gè)過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.4樣品鑒定測(cè)定ralb-ifnγ-il2效價(jià)及比活性，比活性≥107iu/mg，蛋白合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實(shí)施例2一種由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其他同實(shí)施例1，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實(shí)施例1對(duì)照，上清液中122.6kd左右處優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達(dá)更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達(dá)的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達(dá)菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達(dá)蛋白正確折疊，達(dá)到蛋白可溶性表達(dá)。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號(hào)v205。實(shí)施例3一種由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.牛白蛋白(alb)、牛干擾素γ(ifn-γ)與牛白細(xì)胞介素2(il-2)目的基因的獲取與擴(kuò)增對(duì)實(shí)施例1中的牛alb、牛ifn-γ和牛il-2進(jìn)行優(yōu)化，人工合成牛alb、牛ifn-γ和牛il-2目的基因，優(yōu)化后，三者的核苷酸序列分別如sequencelisting400〈7〉、sequencelisting400〈8〉和sequencelisting400〈9〉所示。1.1密碼子優(yōu)化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實(shí)際上，常用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對(duì)含最佳密碼子的基因的表達(dá)效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達(dá)效率。因此，在異源表達(dá)系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達(dá)。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用稀有的密碼子進(jìn)行基因合成，這種基因的重新設(shè)計(jì)叫密碼子優(yōu)化。因此，本實(shí)施例中對(duì)牛alb、牛ifn-γ和牛il-2基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化。1.2密碼子優(yōu)化后結(jié)果分析通常密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)＝1.0時(shí)被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中的最優(yōu)的高效表達(dá)狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達(dá)水平越低。基因中g(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會(huì)影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測(cè)發(fā)現(xiàn)牛alb、牛ifn-γ和牛il-2原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.22、0.24、0.19，gc百分比為42.9％、39.8％、39.1％；而通過對(duì)牛alb、牛ifn-γ和牛il-2基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.99、1.0、0.94，gc百分比49.9％、44.8％、48.2％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對(duì)蛋白表達(dá)的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。1.3引物設(shè)計(jì)：表7pcr擴(kuò)增引物將優(yōu)化后的牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的基因組dna分別稀釋至0.05mg/ml。利用pcr擴(kuò)增獲得目的基因，25μl反應(yīng)體系如表8所示：表8pcr反應(yīng)體系rnasefree水10.5μldntpmix10.0μltaqdna聚合酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組dna1.0μl反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：95℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。牛alb、牛ifn-γ與牛il-2的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分別在1850bp、560bp和490bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明制備得到了優(yōu)化后的牛alb、牛ifn-γ和牛il-2的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接各段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表9、表10所示：表9ralb-ifnγpcr反應(yīng)體系表10ralb-ifnγ-il2pcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在2840bp左右出現(xiàn)特異條帶，，說明成功得到了連接后的ralb-ifnγ-il2基因，得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。3.表達(dá)載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測(cè)序后無誤的pcr的膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用bamhi、xhoi限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切和回收，按表11中的20μl體系做雙酶切：表11雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對(duì))1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表12中的體系進(jìn)行連接，4℃過夜連接：表12目的片段dna10μl表達(dá)載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb平板中過夜培養(yǎng)；取lb平板上生長(zhǎng)的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)bamhi、xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功，pcr擴(kuò)增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在2840bp左右處出現(xiàn)單一條帶，說明含有ralb-ifnγ-il2融合基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功。4.重組蛋白的表達(dá)挑取工程菌于含100μg/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中37℃搖床復(fù)蘇1h，工程菌記為pet-32a/ralb-ifnγ-il2；在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h(od≈1.0)，加入終濃度100μg/mliptg，32℃誘導(dǎo)表達(dá)5h；收集菌體，經(jīng)sds-page電泳檢測(cè)，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在122.6kd左右處可見優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶，說明在上清和沉淀中均得到了重組蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個(gè)過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集ralb-ifnγ-il2蛋白峰。5.4樣品鑒定測(cè)定ralb-ifnγ-il2效價(jià)及比活性，比活性≥107iu/mg，蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實(shí)施例4一種由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白，其他同實(shí)施例3，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實(shí)施例3對(duì)照，上清液中122.6kd左右處優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達(dá)更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達(dá)的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達(dá)菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達(dá)蛋白正確折疊，達(dá)到蛋白可溶性表達(dá)。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號(hào)v205。實(shí)施例5一種重組牛長(zhǎng)效干擾素，由實(shí)施例1、2、3、4中的融合蛋白分別與凍干保護(hù)劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護(hù)劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。實(shí)施例6實(shí)施例1～4得到由牛白蛋白、牛干擾素γ與牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白的鑒定6.1蛋白含量的定量檢測(cè)用lowry法，以中國(guó)食品藥品生物制品檢定院的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，測(cè)定實(shí)施例1～4得到的融合蛋白濃度均大于1.1mg/ml。6.2sds-page電泳檢測(cè)與空菌相比，融合蛋白在122.6kd左右有一條濃染的新增蛋白條帶，如圖4所示。6.3westernblot結(jié)果分別檢測(cè)實(shí)施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗牛γ干擾素(1:5000稀釋)為一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp為二抗(1:10000稀釋)。重組牛長(zhǎng)效干擾素樣品能與抗牛干擾素γ單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，122.6kd左右處出現(xiàn)特異性條帶，如圖5所示。實(shí)施例7實(shí)施例5中的四份重組牛長(zhǎng)效干擾素凍干劑的效價(jià)檢測(cè)按照微量細(xì)胞病變抑制法，用培養(yǎng)基將hep-2細(xì)胞配成5×105細(xì)胞/ml細(xì)胞懸浮液，每孔接種0.1ml移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃、5％co2培養(yǎng)24h，加入不同劑量的重組牛長(zhǎng)效干擾素，24h后吸棄，再分別接種100tcid50vsv病毒。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明獲得的重組牛長(zhǎng)效干擾素對(duì)vsv引起hep-2細(xì)胞的病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組牛長(zhǎng)效干擾素處理后的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變，測(cè)得效價(jià)≥107iu/ml，如圖6所示。實(shí)施例8實(shí)施例5中的分別由實(shí)施例1～4的融合蛋白得到的四份重組牛長(zhǎng)效干擾素凍干劑(分別記為a、b、c、d)在牛體內(nèi)的半衰期的測(cè)定細(xì)胞病變抑制法測(cè)定ralb-ifnγ-il2的血藥濃度與時(shí)間關(guān)系取六只體重大致相同的牛(雌雄各半)，頸部皮下注射2mg/ml重組牛長(zhǎng)效干擾素凍干劑2ml，分別在1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h靜脈采血，血樣4℃凝固，3500rpm低溫離心10min分離血清，各時(shí)點(diǎn)每只牛血樣于-20℃保存待測(cè)。采用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定血清樣品中ralb-ifnγ-il2的濃度，用das藥動(dòng)學(xué)軟件進(jìn)行曲線擬合并計(jì)算參數(shù)。參數(shù)計(jì)算結(jié)果見表13。表13重組牛長(zhǎng)效干擾素肌肉注射后血清中主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)結(jié)果表明重組牛長(zhǎng)效干擾素有較長(zhǎng)的半衰期。經(jīng)測(cè)定半衰期能達(dá)到76h左右，較普通干擾素提高約19倍。實(shí)施例9實(shí)施例5中的四份重組牛長(zhǎng)效干擾素凍干劑對(duì)牛細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的測(cè)定取六只體重大致相同的肉牛分為兩組，記為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)組頸部皮下注射2mg/ml重組牛長(zhǎng)效干擾素凍干劑2ml，對(duì)照組頸部皮下注射2ml的pbs，取注射4周后牛外周血，之后每周取一次血，使用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞經(jīng)過無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗2次后，用完全培養(yǎng)基重懸、調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1ml淋巴細(xì)胞，37℃，5％co2培養(yǎng)72h，收集淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)上清。elisa檢測(cè)培養(yǎng)上清中il-4含量，按試劑盒說明書進(jìn)行，檢測(cè)結(jié)果如表14所示：表14elisa檢測(cè)各組牛細(xì)胞免疫應(yīng)答水平結(jié)果表明注射重組牛長(zhǎng)效干擾素后，能夠顯著提高牛外周血中細(xì)胞因子il-4的含量，增強(qiáng)了細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，顯著提高免疫力水平。上述參照實(shí)施例對(duì)一種由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白及其制備方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司<120>一種由牛白蛋白、牛干擾素γ和牛白細(xì)胞介素2組成的融合蛋白及其制備方法<130>蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>948<212>prt<213>融合蛋白<400>1metlystrpvalthrpheileserleuleuleuleupheserserala151015tyrserargglyvalpheargargaspthrhislyssergluileala202530hisargphelysaspleuglyglugluhisphelysglyleuvalleu354045ilealapheserglntyrleuglnglncyspropheaspgluhisval505560lysleuvalasngluleuthrgluphealalysthrcysvalalaasp65707580gluserhisalaglycysglulysserleuhisthrleupheglyasp859095gluleucyslysvalalaserleuarggluthrtyrglyaspmetala100105110aspcyscysglulysglngluprogluargasnglucyspheleuser115120125hislysaspaspserproaspleuprolysleulysproaspproasn130135140thrleucysaspgluphelysalaaspglulyslysphetrpglylys145150155160tyrleutyrgluilealaargarghisprotyrphetyralaproglu165170175leuleutyrtyralaasnlystyrasnglyvalpheglnglucyscys180185190glnalagluasplysglyalacysleuleuprolysilegluthrmet195200205argglulysvalleualaserseralaargglnargleuargcysala210215220serileglnlyspheglygluargalaleulysalatrpservalala225230235240argleuserglnlyspheprolysalagluphevalgluvalthrlys245250255leuvalthraspleuthrlysvalhislysglucyscyshisglyasp260265270leuleuglucysalaaspaspargalaaspleualalystyrilecys275280285aspasnglnaspthrileserserlysle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