本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種重組牛長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
：牛是我國重要的畜牧種類之一，隨著集約化和規(guī)模化養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，牛病毒性傳染性疾病的發(fā)病率逐年提高。許多牛的傳染性疾病在國內(nèi)大型規(guī)?；翀鲩L期流行，因疾病傳染快，發(fā)病率、死亡率高嚴(yán)重制約著我國牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展；更為嚴(yán)重的是一些人畜共患傳染病如牛的布魯氏菌病、結(jié)核病等直接威脅人類的生命健康。目前對牛傳染性疾病的預(yù)防和治療途徑主要是通過疫苗接種和使用抗生素。大部分抗生素類藥物以及傳統(tǒng)的口服抗病毒藥物，由于藥物殘留問題，給健康帶來負(fù)面影響；而傳統(tǒng)的疫苗，由于它的高特異性以及副作用，無法抵抗病毒變異和新型病毒不斷出現(xiàn)給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來的巨大危害。干擾素以其廣譜的抗病毒活性和廣泛的免疫調(diào)節(jié)能力決定了其具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，可以用來預(yù)防和治療牛病毒性細(xì)菌性傳染性疾病。ifn是一類病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年issacs和lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細(xì)胞因子，與細(xì)胞受體結(jié)合后，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒rna來抑制病毒的生長繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照ifn的產(chǎn)生細(xì)胞、生化特征及在機(jī)體免疫方面所發(fā)揮作用的不同，分為α、β、γ三類?，F(xiàn)已知，α型ifn在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒等感染細(xì)胞，通過抑制受染細(xì)胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用。ifn-α主要生物學(xué)活性為具有抑制病毒復(fù)制、抗寄生蟲、抑制多種細(xì)胞增殖、刺激免疫細(xì)胞的殺傷活性。γ型ifn是由激活的t細(xì)胞和nk細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統(tǒng)也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所以ifn-γ又稱為免疫調(diào)節(jié)干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導(dǎo)細(xì)胞對病毒感染的反應(yīng)，但干擾素γ的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)和確定機(jī)體長期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應(yīng)用價值。天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應(yīng)的時間成本及經(jīng)濟(jì)成本隨之增加，而機(jī)體的耐受極限也有可能被突破導(dǎo)致不良反應(yīng)的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導(dǎo)致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于在家畜臨床上應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種重組牛長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法，所述重組牛長效干擾素可顯著提高牛干擾素的半衰期，較普通牛干擾素的半衰期提高11倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高牛自身的免疫應(yīng)答。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如sequencelisting400〈1〉所示。本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示，記為基因組1；或如sequencelisting400〈3〉所示，記為基因組2。所述基因組1和所述基因組2均可編碼所述融合蛋白。基因組2是對基因組1的核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化之后的結(jié)果，通常密碼子適應(yīng)指數(shù)cai＝1.0時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中為最優(yōu)的高效表達(dá)狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達(dá)水平越低。基因中g(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)牛ifn-γ和ifn-α原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.24、0.25，gc百分比為39.8％、58.2％；而通過對牛ifn-γ和ifn-α基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)為1.0、0.97，gc百分比44.8％、54.6％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達(dá)的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。本發(fā)明還提拱了含有基因組1或基因組2的表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的基因工程菌。進(jìn)一步地，所述基因工程菌為pet-32a/rifnγ-ifnα。含有基因組1或基因組2的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌宿主細(xì)胞，更進(jìn)一步地，所述大腸桿菌宿主細(xì)胞為bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種重組牛長效干擾素α，所述重組牛長效干擾素α由所述的融合蛋白與凍干保護(hù)劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護(hù)劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。本發(fā)明還公開了所述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將含有基因組1或基因組2的表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，獲得基因工程菌，基因工程菌經(jīng)iptg誘導(dǎo)表達(dá)后得到所述融合蛋白的粗品，經(jīng)純化后即可得到融合蛋白。所述表達(dá)載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達(dá)載體；所述基因工程菌為pet-32a/rifnγ-ifnα，其制備方法為：(1)設(shè)計引物，通過反轉(zhuǎn)錄得到或者人工合成連接有柔性linker序列的牛干擾素γ和牛干擾素α的目的基因；通過柔性linker將牛干擾素γ和牛干擾素α的目的基因連接起來，目的基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示或如sequencelisting400〈3〉所示；(2)將連接后的目的基因連接到pet-32a質(zhì)粒上獲得表達(dá)載體；(3)將表達(dá)載體導(dǎo)入到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，即可得到基因工程菌pet-32a/rifnγ-ifnα。所述大腸桿菌宿主細(xì)胞為bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號為v205。所述基因組1的獲取方法為：a.引物設(shè)計牛干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f1：ccggaattcatgaaatatacaagctattt，帶有ecori酶切位點；下游ifn-γ-r1：accaccaccagaaccaccaccacccgttgatgctctccg，帶有柔性linker；牛干擾素α(ifn-α)的引物序列為：上游ifn-α-f1：ggtggttctggtggtggtggttcttgccacctgcctc，帶有柔性linker；下游ifn-α-r1：ccctcgaggtcctttctcctgaaac，帶有xhoi酶切位點；b.從牛肝臟中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得ifn-γ和ifn-α的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉和sequencelisting400〈5〉所示；分別以ifn-γ和ifn-α的目的基因為模板，并分別利用ifn-γ和ifn-α的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到連接有柔性linker的ifn-γ和ifn-α目的基因。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，模板rna1.5μl，上下游引物各0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)；95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker將ifn-γ基因與ifn-α基因連接起來連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dnai1μl，ifn-γ上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為9μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min?；蚪M2是對基因組1進(jìn)行優(yōu)化之后，人工合成的基因，所述基因組2的獲取方法為：a.引物設(shè)計牛干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f2：cgggatccatgaaatacacctcttac，帶有bamhi酶切位點；下游ifn-γ-r2：accaccaccagaaccaccaccaccggtagaagcacgacg；帶有柔性linker；牛干擾素α(ifn-α)的引物序列為：上游ifn-α-f2：ggtggttctggtggtggtggttcttgccacctgccg，帶有柔性linker；下游ifn-α-r2：ccctcgaggtctttacgacggaaa，帶有xhoi酶切位點；b.所述ifn-γ和ifn-α的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈6〉和sequencelisting400〈7〉所示；分別以ifn-γ和ifn-α的目的基因為模板，并分別利用ifn-γ和ifn-α的上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到連接有柔性linker的優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-α目的基因。pcr反應(yīng)體系及條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，基因組dna1.0μl，上下游引物各0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)；95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker將ifn-γ基因與ifn-α基因連接起來連接的pcr反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為：在25μl的總反應(yīng)體系中，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，ifn-γ上游引物0.5μl，ifn-α下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為9μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明還提供了所述重組牛長效干擾素α的應(yīng)用，其半衰期長達(dá)45小時以上，具有廣譜抗病毒作用并能提高牛自身的免疫應(yīng)答。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.通過柔性linker將牛干擾素γ和牛干擾素-α基因?qū)崿F(xiàn)融合，提高了干擾素半衰期，與普通干擾素相比，提高了11倍以上；2.通過對牛干擾素γ和牛干擾素-α基因進(jìn)行優(yōu)化，提高了干擾素γ和牛干擾素-α融合蛋白的表達(dá)量；3.以重組大腸桿菌bl21/pet-32a-ifnγ-ifnα作為表達(dá)菌株，通過引入分子伴侶pgro7質(zhì)粒，在蛋白表達(dá)時不產(chǎn)生包涵體，形成可溶性蛋白，避免了包涵體變性和復(fù)性的過程，大大縮短了融合蛋白表達(dá)的時間；4.本發(fā)明公開的由牛干擾素γ和牛干擾素-α組成的融合蛋白不僅具有干擾素α的廣譜抗病毒作用，同時顯著提高了牛自身的免疫應(yīng)答。附圖說明圖1為實施例1中的牛干擾素γ基因與牛干擾素α基因rt-pcr擴(kuò)增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：牛干擾素γ基因rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2：牛干擾素α基因rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；圖2為實施例1中的牛ifn-γ和牛ifn-α的目的基因連接之后的pcr擴(kuò)增的結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：牛干擾素γ基因與牛干擾素α基因連接擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3為實施例1中的陽性克隆質(zhì)粒的pcr擴(kuò)增及雙酶切鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：dnamarkerdl10000；泳道1：重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；泳道2：質(zhì)粒pcr結(jié)果；圖4為實施例1中的重組蛋白的sds-page電泳檢查結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：空菌對照；泳道2：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后上清；泳道3：重組菌誘導(dǎo)后的菌體破碎后沉淀；圖5為實施例1得到的融合蛋白的westernblot鑒定結(jié)果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：重組菌誘導(dǎo)破碎后沉淀；泳道2：為重組菌誘導(dǎo)破碎后上清；圖6為實施例5中由實施例1中的融合蛋白制得的重組牛長效干擾素α對vsv致細(xì)胞病變的抑制作用；1為vsv病毒對照孔；2為hep-2細(xì)胞對照孔；a3-12為梯度稀釋(從右向左)的人干擾素標(biāo)準(zhǔn)品處理孔；b3-12為梯度稀釋(從右向左)的重組牛長效干擾素α處理孔；圖7為實施例8中由實施例1中的融合蛋白制得的重組牛長效干擾素α肌肉注射血藥濃度-時間變化曲線。具體實施方式實施例1一種由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.牛干擾素γ(ifn-γ)與牛干擾素α(ifn-α)目的基因的獲取與擴(kuò)增引物設(shè)計：根據(jù)genebank中已報道的目的基因序列設(shè)計合成引物見表1，在牛干擾素γ的上游引物和下游引物中分別引入ecori酶切位點和linker序列，在牛干擾素α的上游引物和下游引物中分別引入linker序列和xhoi酶切位點。表1pcr擴(kuò)增引物rt-pcr獲取目的基因：從牛肝臟組織中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得ifn-γ和ifn-α的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉和sequencelisting400〈5〉所示；rt-pcr反應(yīng)體系(25μl)見表2表2rt-pcr反應(yīng)體系rnasefree水10μldntpmix10μl反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組rna1.5μl反應(yīng)參數(shù)為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：95℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在530bp和530bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖1所示，說明成功得到了分別連接有柔性linker的牛干擾素γ目的基因和牛干擾素α目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接連段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表3所示：表3pcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1030bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結(jié)果如圖2所示，得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈2〉所示。3.表達(dá)載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序后無誤的pcr膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用ecori和xhoi限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切和回收，按表4中的20μl體系做雙酶切：表4雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表5中的體系進(jìn)行連接，4℃過夜連接：表5目的片段dna10μl表達(dá)載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過夜；取lb平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)ecori和xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功，得到工程菌pet-32a/rifnγ-ifnα，pcr擴(kuò)增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1030bp左右處出現(xiàn)單一條帶，其結(jié)果如圖3所示。4.重組蛋白的表達(dá)挑取工程菌pet-32a/rifnγ-ifnα于含氨芐青霉素100μg/ml的lb培養(yǎng)基中37℃搖菌1h復(fù)蘇工程菌活性，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h后，測od值達(dá)到1.0時即可；加入iptg，32℃誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度100μg/ml)5h；收集細(xì)菌，經(jīng)sds-page電泳檢測，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在56kd左右處可見優(yōu)勢表達(dá)條帶，其結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在56kd左右處可見優(yōu)勢表達(dá)條帶，說明在沉淀和上清中均成功表達(dá)了融合蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰5.4樣品鑒定：測定rifnγ-ifnα效價及比活性，比活性≥1.0×107iu/mg蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例2一種由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其他同實施例1，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實施例1對照，上清液中56kd左右處優(yōu)勢表達(dá)條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達(dá)更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達(dá)的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達(dá)菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達(dá)蛋白正確折疊，達(dá)到蛋白可溶性表達(dá)。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例3一種由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.牛干擾素γ(ifn-γ)與牛干擾素α(ifn-α)目的基因的獲取與擴(kuò)增對實施例1中的ifn-γ和ifn-α進(jìn)行優(yōu)化，人工合成ifn-γ和ifn-α目的基因，優(yōu)化后，兩者的核苷酸序列分別如sequencelisting400〈6〉和sequencelisting400〈7〉所示。1.1密碼子優(yōu)化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實際上，常用做蛋白表達(dá)或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細(xì)胞，植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達(dá)效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達(dá)效率。因此，在異源表達(dá)系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達(dá)。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用稀有的密碼子進(jìn)行基因合成，這種基因的重新設(shè)計叫密碼子優(yōu)化。因此，本實施例中對牛的ifn-γ和ifn-α基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化。1.2密碼子優(yōu)化后結(jié)果分析通常密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)＝1.0時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中的最優(yōu)的高效表達(dá)狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達(dá)水平越低?；蛑術(shù)c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)牛ifn-γ和ifn-α原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)分別為0.24、0.25，gc百分比為39.8％、58.2％；而通過對牛ifn-γ和ifn-α基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應(yīng)指數(shù)(cai)為1.0、0.97，gc百分比44.8％、54.6％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達(dá)的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。1.3引物設(shè)計：表6pcr擴(kuò)增引物將優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-α的基因組dna分別稀釋至0.05mg/ml。利用pcr擴(kuò)增獲得目的基因，25μl反應(yīng)體系如表7所示：表7pcr反應(yīng)體系rnasefree水10.5μldntpmix10.0μltaqdna聚合酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組dna1.0μl反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：95℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在530bp和530bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明制備得到了分別連接有柔性linker的優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-α的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接連段目的基因，25μl反應(yīng)體系如表8所示：表8pcr反應(yīng)體系反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min，進(jìn)入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1030bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明成功得到了ifn-γ和ifn-α連接后的目的基因。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。3.表達(dá)載體構(gòu)建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序后無誤的pcr的膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用bamhi、xhoi限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切和回收，按表9中的20μl體系做雙酶切：表9雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表10中的體系進(jìn)行連接，4℃過夜連接：表10目的片段dna10μl表達(dá)載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過夜；取lb平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)bamhi、xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達(dá)載體構(gòu)建成功，得到工程菌pet-32a/rifnγ-ifnα，pcr擴(kuò)增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1030bp處出現(xiàn)單一條帶，說明含有ifn-γ和ifn-α連接后的目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建成功。4.重組蛋白的表達(dá)挑取工程菌pet-32a/rifnγ-ifnα于含氨芐青霉素100μg/ml的lb培養(yǎng)基中37℃搖菌1h復(fù)蘇工程菌活性，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h后，測od值達(dá)到1.0時即可；加入iptg，32℃誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度100μg/ml)5h；收集細(xì)菌，經(jīng)sds-page電泳檢測，重組菌誘導(dǎo)5h后的菌體破碎后上清和沉淀在56kd左右處可見優(yōu)勢表達(dá)條帶，說明在上清和沉淀中均得到了重組蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復(fù)凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細(xì)菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復(fù)3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制的重組牛干擾素α用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集rifnγ-ifnα蛋白峰。5.4樣品鑒定測定rifnγ-ifnα效價及比活性，比活性≥1×107iu/mg蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例4一種由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白，其他同實施例3，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞。其融合蛋白的sds-page電泳結(jié)果同實施例3對照，上清液中56kd左右處優(yōu)勢表達(dá)條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達(dá)更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達(dá)的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達(dá)菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達(dá)蛋白正確折疊，達(dá)到蛋白可溶性表達(dá)。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例5一種重組牛長效干擾素α，由實施例1、2、3、4中的融合蛋白分別與凍干保護(hù)劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護(hù)劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。實施例6實施例1～4得到由牛干擾素γ與牛干擾素α組成的融合蛋白的鑒定6.1蛋白含量的定量檢測用lowry法，以中國食品藥品生物制品檢定院的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)測定，測定實施例1～4得到的融合蛋白濃度均大于1.0mg/ml。6.2sds-page電泳檢測與空菌相比，融合蛋白在56kd左右有一條濃染的新增蛋白條帶，如圖4所示。6.3westernblot結(jié)果分別檢測實施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗牛α干擾素(1:5000稀釋)為一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp為二抗(1:10000稀釋)。重組牛長效干擾素α樣品能與抗牛干擾素α單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，56kd左右處出現(xiàn)特異性條帶，如圖5所示。實施例7實施例5中的四份重組牛長效干擾素α凍干劑的效價檢測按照微量細(xì)胞病變抑制法，用培養(yǎng)基將hep-2細(xì)胞配成5×105細(xì)胞/ml細(xì)胞懸浮液，每孔接種0.1ml移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。37℃、5％co2培養(yǎng)24h，加入不同劑量的重組牛長效干擾素α，24h后吸棄，再分別接種100tcid50vsv病毒。試驗結(jié)果結(jié)果表明獲得的重組牛長效干擾素α對vsv引起hep-2細(xì)胞的病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細(xì)胞接種病毒后均出現(xiàn)細(xì)胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組牛長效干擾素α處理后的細(xì)胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變，測得效價≥1.0×107iu/ml，如圖6所示。實施例8重組牛長效干擾素α在牛體內(nèi)的半衰期的測定實施例5中的分別由實施例1～4的融合蛋白得到的四份重組牛長效干擾素α凍干劑(分別記為a、b、c、d)在牛體內(nèi)的半衰期的測定細(xì)胞病變抑制法測定rifnγ-ifnα的血藥濃度與時間關(guān)系取六只體重大致相同的牛(雌雄各半)，頸部皮下注射2mg/ml重組牛長效干擾素α凍干劑2ml，分別在1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h靜脈采血，血樣4℃凝固，3500rpm低溫離心10min分離血清，各時點每只牛血樣于-20℃保存待測。采用細(xì)胞病變抑制法測定血清樣品中rifnγ-ifnα的濃度，用das藥動學(xué)軟件進(jìn)行曲線擬合并計算參數(shù)。a的擬合曲線如圖7所示；參數(shù)計算結(jié)果見表11。表11重組牛長效干擾素α肌肉注射后血清中主要動力學(xué)參數(shù)結(jié)果表明重組牛長效干擾素α有較長的半衰期。經(jīng)測定半衰期能達(dá)到45h左右，較普通干擾素提高11倍。實施例9實施例5中的四份重組牛長效干擾素α凍干劑對牛細(xì)胞免疫應(yīng)答影響的測定取六只體重大致相同的仔牛分為兩組，記為實驗組和對照組；實驗組頸部皮下注射2mg/ml重組牛長效干擾素α凍干劑2ml，對照組頸部皮下注射2ml的pbs，取注射4周后牛外周血，之后每周取一次血，使用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞經(jīng)過無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗2次后，用完全培養(yǎng)基重懸、調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個/ml，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1ml淋巴細(xì)胞，37℃，5％co2培養(yǎng)72h，收集淋巴細(xì)胞培養(yǎng)時上清。elisa檢測培養(yǎng)上清中il-2、il-4含量，按試劑盒說明書進(jìn)行，檢測結(jié)果如表12所示：表12elisa檢測各組牛細(xì)胞免疫應(yīng)答水平結(jié)果表明注射重組牛長效干擾素α后，能夠顯著提高牛外周血中細(xì)胞因子il-2、il-4的含量，增強了細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，顯著提高免疫力水平。上述參照實施例對重組牛長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司<120>一種重組牛長效干擾素α及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法<130>1<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>342<212>prt<213>重組牛長效干擾素α融合蛋白<400>1metlystyrthrsertyrpheleualaleuleuleucysglyleuleu151015glypheserglysertyrglyglnglyglnphephearggluileglu202530asnleulysglutyrpheasnalaserserproaspvalalalysgly354045glyproleuphesergluileleulysasntrplysaspgluserasp505560lyslysileileglnserglnilevalserphetyrphelysleuphe65707580gluasnleulysaspasnglnvalileglnargsermetaspileile859095lysglnaspmetpheglnlyspheleuasnglyserserglulysleu100105110gluaspphelyslysleuileglnileprovalaspaspleuglnile115120125glnarglysalaileasngluleuilelysvalmetasnaspleuser130135140prolysserasnleuarglysarglysargserglnasnleuphearg145150155160glyargargalaserthrglyglyglyglyserglyglyglyglyser165170175cyshisleuprohisthrhisserleualaasnargargvalleumet180185190leuleuglyglnleuargargvalserprosersercysleuglnasp195200205argasnaspphealapheproglnglualaleuglyglyserglnleu210215220glnlysalaglnalaileservalleuhisgluvalthrglnhisthr225230235240pheglnleupheserthrgluglyseralathrthrtrpaspgluser245250255leuleuasplysleuargalaalaleuaspglnglnleuthraspleu260265270glnalacysleuargglngluglugluleuglnglyalaproleuleu275280285lysgluaspserserleualavalarglystyrphehisargleuthr290295300leutyrleuglnglulyslyshisserprocysalatrpgluvalval305310315320argalaglnvalmetargalapheserserserthrasnleuglnglu325330335serpheargarglysasp340<210>2<211>1026<212>dna<213>重組牛長效干擾素α基因組1<400>2atgaaatatacaagctatttcttagctttactgctctgtgggcttttgggtttttctggt60tcttatggccagggccaattttttagagaaatagaaaacttaaaggagtattttaatgca120agtagcccagatgtagctaagggtgggcctctcttctcagaaattttgaagaattggaaa180gatgaaagtgacaaaaaaattattcagagccaaattgtctccttctacttcaaactcttt240gaaaacctcaaagataaccaggtcattcaaaggagcatggatatcatcaagcaagacatg300tttcagaagttcttgaatggcagctctgagaaactggaggacttcaaaaagctgattcaa360attccggtggatgatctgcagatccagcgcaaagccataaatgaactcatcaaagtgatg420aatgacctgtcaccaaaatctaacctcagaaagcggaagagaagtcagaatctctttcga480ggccggagagcatcaacgggtggtggtggttctggtggtggtggttcttgccacctgcct540cacacccacagcctggccaacaggagggtcctgatgctcctgggacaactgaggagggtc600tccccttcctcctgcctgcaggacagaaatgacttcgcattcccccaggaggcgctgggt660ggcagccagttgcagaaggctcaagccatctctgtgctccacgaggtgacccagcacacc720ttccagcttttcagcacagagggctcggccactacgtgggatgagagcctcctggacaag780ctccgcgctgcactggatcagcagctcactgacctgcaagcctgtctgaggcaggaggag840gagctgcaaggagctcccctgctcaaggaggactccagcctggctgtgaggaaatacttc900cacagactcactctctatctgcaagagaagaaacacagcccttgtgcctgggaggttgtc960agagcacaagtcatgagagccttctcttcctcaacaaacttgcaggagagtttcaggaga1020aaggac1026<210>3<211>1026<212>dna<213>重組牛長效干擾素α基因組2<400>3atgaaatacacctcttacttcctggctctgctgctgtgcggtctgctgggtttctctggt60tcttacggtcagggtcagttcttccgtgaaatcgaaaacctgaaagaatacttcaacgct120tcttctccggacgttgctaaaggtggtccgctgttctctgaaatcctgaaaaactggaaa180gacgaatctgacaaaaaaatcatccagtctcagatcgtttctttctacttcaaactgttc240gaaaacctgaaagacaaccaggttatccagcgttctatggacatcatcaaacaggacatg300ttccagaaattcctgaacggttcttctgaaaaactggaagacttcaaaaaactgatccag360atcccggttgacgacctgcagatccagcgtaaagctatcaacgaactgatcaaagttatg420aacgacctgtctccgaaatctaacctgcgtaaacgtaaacgttctcagaacctgttccgt480ggtcgtcgtgcttctaccggtggtggtggttctggtggtggtggttcttgccacctgccg540cacacccactctctggctaaccgtcgtgttctgatgctgctgggtcagttacgtcgtgta600agcccgtcttcttgcctgcaggaccgtaacgacttcgctttcccgcaggaagctctgggt660ggttctcagctgcagaaagctcaggctatctctgttctgcacgaagttacccagcacacc720ttccagctgttctctaccgaaggttctgctaccacctgggacgaatctctgctggacaaa780ctgcgtgctgctctggaccagcagctgaccgacctgcaggcttgcctgcgtcaggaagaa840gaactgcagggtgctccgctgctgaaagaagactcttctctggctgttcgtaaatacttc900caccgtctgaccctgtacctgcaggaaaaaaaacactctccgtgcgcttgggaagttgtt960cgtgctcaggttatgcgtgctttctcttcttctaccaacctgcaggaatctttccgtcgt1020aaagac1026<210>4<211>498<212>dna<213>牛干擾素γ<400>4atgaaatatacaagctatttcttagctttactgctctgtgggcttttgggtttttctggt60tcttatggccagggccaattttttagagaaatagaaaacttaaaggagtattttaatgca120agtagcccagatgtagctaagggtgggcctctcttctcagaaattttgaagaattggaaa180gatgaaagtgacaaaaaaattattcagagccaaattgtctccttctacttcaaactcttt240gaaaacctcaaagataaccaggtcattcaaaggagcatggatatcatcaagcaagacatg300tttcagaagttcttgaatggcagctctgagaaactggaggacttcaaaaagctgattcaa360attccggtggatgatctgcagatccagcgcaaagccataaatgaactcatcaaagtgatg420aatgacctgtcaccaaaatctaacctcagaaagcggaagagaagtcagaatctctttcga480ggccggagagcatcaacg498<210>5<211>498<212>dna<213>牛干擾素α<400>5tgccacctgcctcacacccacagcctggccaacaggagggtcctgatgctcctgggacaa60ctgaggagggtctccccttcctcctgcctgcaggacagaaatgacttcgcattcccccag12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