本發(fā)明涉及基因組學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的預(yù)捕獲引物、捕獲探針及構(gòu)建方法、測序方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：線粒體是真核生物細(xì)胞內(nèi)非常重要的細(xì)胞器，是真核生物進(jìn)行氧化代謝的主要部位，是糖類等物質(zhì)在細(xì)胞中最終氧化釋放能量的場所。線粒體自身具有一套獨(dú)立的基因組，它只在卵母細(xì)胞中進(jìn)行分裂，因此具有母系遺傳的特點(diǎn)，即只通過女性向下一代進(jìn)行傳遞。線粒體dna基因突變的傳遞有一定數(shù)量上的特點(diǎn)。每個(gè)細(xì)胞中含有大量線粒體，如果細(xì)胞內(nèi)所有的線粒體dna上的某一位點(diǎn)均為同一類型的堿基，即全部都是正?；蚧蛲瑸橥蛔兓?，則該細(xì)胞為純質(zhì)的；如果細(xì)胞內(nèi)所有的線粒體dna上的某一位點(diǎn)同時(shí)存在正?；蚝屯蛔兓?，則該細(xì)胞為異質(zhì)的。當(dāng)異質(zhì)率到達(dá)一定的水平后，就有可能對細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生影響。研究顯示，線粒體基因的突變會(huì)導(dǎo)致：kss綜合癥，leigh氏病或稱亞急性壞死性腦肌病，elas綜合癥，merrf綜合癥，leber氏遺傳性視神經(jīng)萎縮癥，alper綜合癥，慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹，線粒體神經(jīng)消化道腦肌病，pearson綜合癥等。目前對人類線粒體基因組進(jìn)行測序的方法主要有以下幾種：1)使用多對引物擴(kuò)增線粒體序列后，用一代測序方法進(jìn)行檢測。該方法需要引物序列從16-24對引物不等，需要將每對引物進(jìn)行擴(kuò)增后，進(jìn)行一代測序。用該方法進(jìn)行檢測耗時(shí)長，對于低異質(zhì)性突變不能有效進(jìn)行檢測。2)使用nimblegen芯片雜交系統(tǒng)、agilent液相雜交系統(tǒng)或其他雜交系統(tǒng)進(jìn)行雜交后進(jìn)行高通量檢測。使用液相雜交系統(tǒng)需要合成大規(guī)模探針，合成價(jià)格較高的分子探針、均一性較差、難以對一些區(qū)域較大的基因組序列進(jìn)行捕獲等缺點(diǎn)。同時(shí)進(jìn)行雜交捕獲需要試劑組份較多，步驟繁雜，操作流程長，儀器要求嚴(yán)格。通過高通量測序儀進(jìn)行檢測，能對突變頻率較低的異質(zhì)性突變進(jìn)行有效檢測，但不能有效排除基因組dna對線粒體dna信息的干擾。因此，開發(fā)一種能夠快速、準(zhǔn)確、操作簡單、省時(shí)省力的針對人類線粒體基因組進(jìn)行測序的方法尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的預(yù)捕獲引物，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的捕獲探針，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種人類線粒體dna文庫的構(gòu)建方法，本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種人類線粒體dna文庫的測序方法，本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述方法在分析人類線粒體dna異質(zhì)性中的應(yīng)用，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的步驟繁雜，操作流程長，儀器要求嚴(yán)格，且檢測效率低的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的預(yù)捕獲引物，包括如下引物對：引物對1：包括e1fa和e1ra，所述e1fa具有如seqidno.1所示序列，e1ra具有如seqidno.2所示序列；引物對2：包括e2fa和e2ra，所述e2fa具有如seqidno.3所示序列，e2ra具有如seqidno.4所示序列；引物對3：包括e3fa和e3ra，所述e3fa具有如seqidno.5所示序列，e3ra具有如seqidno.6所示序列；引物對4：包括e4fa和e4ra，所述e4fa具有如seqidno.7所示序列，e4ra具有如seqidno.8所示序列；引物對5：包括e5fa和e5ra，所述e5fa具有如seqidno.9所示序列，e5ra具有如seqidno.10所示序列；引物對6：包括e6fa和e6ra，所述e6fa具有如seqidno.11所示序列，e6ra具有如seqidno.12所示序列。本發(fā)明還提供了用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的捕獲探針，包括如下探針組：探針組1：e1f具有如seqidno.13所示序列，e1r具有如seqidno.14所示序列，e8f具有如seqidno.15所示序列，e8r具有如seqidno.16所示序列，e15f具有如seqidno.17所示序列，e15r具有如seqidno.18所示序列，e22f具有如seqidno.19所示序列，e22r具有如seqidno.20所示序列，e29f具有如seqidno.21所示序列，e29r具有如seqidno.22所示序列，e36f具有如seqidno.23所示序列，e36r具有如seqidno.24所示序列，e43f具有如seqidno.25所示序列，e43r具有如seqidno.26所示序列，e50f具有如seqidno.27所示序列，e50r具有如seqidno.28所示序列，e57f具有如seqidno.29所示序列，e57r具有如seqidno.30所示序列；探針組2：e2f具有如seqidno.31所示序列，e2r具有如seqidno.32所示序列，e9f具有如seqidno.33所示序列，e9r具有如seqidno.34所示序列，e16f具有如seqidno.35所示序列，e16r具有如seqidno.36所示序列，e23f具有如seqidno.37所示序列，e23r具有如seqidno.38所示序列，e30f具有如seqidno.39所示序列，e30r具有如seqidno.40所示序列，e37f具有如seqidno.41所示序列，e37r具有如seqidno.42所示序列，e44f具有如seqidno.43所示序列，e44r具有如seqidno.44所示序列，e51f具有如seqidno.45所示序列，e51r具有如seqidno.46所示序列，e58f具有如seqidno.47所示序列，e58r具有如seqidno.48所示序列；探針組3：e3f具有如seqidno.49所示序列，e3r具有如seqidno.50所示序列，e10f具有如seqidno.51所示序列，e10r具有如seqidno.52所示序列，e17f具有如seqidno.53所示序列，e17r具有如seqidno.54所示序列，e24f具有如seqidno.55所示序列，e24r具有如seqidno.56所示序列，e31f具有如seqidno.57所示序列，e31r具有如seqidno.58所示序列，e38f具有如seqidno.59所示序列，e38r具有如seqidno.60所示序列，e45f具有如seqidno.61所示序列，e45r具有如seqidno.62所示序列，e52f具有如seqidno.63所示序列，e52r具有如seqidno.64所示序列，e59f具有如seqidno.65所示序列，e59r具有如seqidno.66所示序列；探針組4：e4f具有如seqidno.67所示序列，e4r具有如seqidno.68所示序列，e11f具有如seqidno.69所示序列，e11r具有如seqidno.70所示序列，e18f具有如seqidno.71所示序列，e18r具有如seqidno.72所示序列，e25f具有如seqidno.73所示序列，e25r具有如seqidno.74所示序列，e32f具有如seqidno.75所示序列，e32r具有如seqidno.76所示序列，e39f具有如seqidno.77所示序列，e39r具有如seqidno.78所示序列，e46f具有如seqidno.79所示序列，e46r具有如seqidno.80所示序列，e53f具有如seqidno.81所示序列，e53r具有如seqidno.82所示序列，e60f具有如seqidno.83所示序列，e60r具有如seqidno.84所示序列；探針組5：e5f具有如seqidno.85所示序列，e5r具有如seqidno.86所示序列，e12f具有如seqidno.87所示序列，e12r具有如seqidno.88所示序列，e19f具有如seqidno.89所示序列，e19r具有如seqidno.90所示序列，e26f具有如seqidno.91所示序列，e26r具有如seqidno.92所示序列，e33f具有如seqidno.93所示序列，e33r具有如seqidno.94所示序列，e40f具有如seqidno.95所示序列，e40r具有如seqidno.96所示序列，e47f具有如seqidno.97所示序列，e47r具有如seqidno.98所示序列，e54f具有如seqidno.99所示序列，e54r具有如seqidno.100所示序列，e61f具有如seqidno.101所示序列，e61r具有如seqidno.102所示序列；探針組6：e6f具有如seqidno.103所示序列，e6r具有如seqidno.104所示序列，e13f具有如seqidno.105所示序列，e13r具有如seqidno.106所示序列，e20f具有如seqidno.107所示序列，e20r具有如seqidno.108所示序列，e27f具有如seqidno.109所示序列，e27r具有如seqidno.110所示序列，e34f具有如seqidno.111所示序列，e34r具有如seqidno.112所示序列，e41f具有如seqidno.113所示序列，e41r具有如seqidno.114所示序列，e48f具有如seqidno.115所示序列，e48r具有如seqidno.116所示序列，e55f具有如seqidno.117所示序列，e55r具有如seqidno.118所示序列，e62f具有如seqidno.119所示序列，e62r具有如seqidno.120所示序列；探針組7：e7f具有如seqidno.121所示序列，e7r具有如seqidno.122所示序列，e14f具有如seqidno.123所示序列，e14r具有如seqidno.124所示序列，e21f具有如seqidno.125所示序列，e21r具有如seqidno.126所示序列，e28f具有如seqidno.127所示序列，e28r具有如seqidno.128所示序列，e35f具有如seqidno.129所示序列，e35r具有如seqidno.130所示序列，e42f具有如seqidno.131所示序列，e42r具有如seqidno.132所示序列，e49f具有如seqidno.133所示序列，e49r具有如seqidno.134所示序列，e56f具有如seqidno.135所示序列，e56r具有如seqidno.136所示序列，e63f具有如seqidno.137所示序列，e63r具有如seqidno.138所示序列。本發(fā)明還提供了一種人類線粒體dna文庫的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括：以待測dna為模板，使用上述的預(yù)捕獲引物預(yù)捕獲得到預(yù)捕獲產(chǎn)物，以所述預(yù)捕獲產(chǎn)物為模板，使用上述的捕獲探針捕獲得到捕獲產(chǎn)物，在所述捕獲產(chǎn)物兩端連接接頭序列，構(gòu)建所述人類線粒體dna文庫。進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括在接頭序列上引入標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽序列用于標(biāo)記不同來源樣品dna。進(jìn)一步地，所述標(biāo)簽序列位于所述接頭序列的末端。進(jìn)一步地，所述待測dna為由家系成員外周靜脈血中提取的血液全基因組dna。進(jìn)一步地，所述接頭序列可根據(jù)不同測序平臺(tái)進(jìn)行替換。本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的人類線粒體dna文庫的測序方法，所述測序方法包括：將構(gòu)建得到的人類線粒體dna文庫在測序平臺(tái)，采用邊合成邊測序的方法進(jìn)行序列的測定，得到測序數(shù)據(jù)。進(jìn)一步地，所述測序方法還包括對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。另外，本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法和測序方法在分析人類線粒體dna異質(zhì)性中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的預(yù)捕獲引物和捕獲探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對人類線粒體序列的快速捕獲。本發(fā)明提供的構(gòu)建方法，能夠降低基因組dna中同源序列影響線粒體序列分析的干擾，在構(gòu)建文庫時(shí)，只需要進(jìn)行三步pcr的方法即可完成從目標(biāo)序列篩選，到目標(biāo)序列捕獲，到接頭序列引入的過程，降低了操作難度和提高了實(shí)驗(yàn)效率，并且，由于本發(fā)明的主要流程均在pcr儀上完成，使用試劑便捷，價(jià)格低廉，在普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)即可完成。附圖說明圖1為本發(fā)明提供的人類線粒體dna文庫的構(gòu)建方法及測序方法的流程圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例3提供的預(yù)捕獲步驟后e1-e5引物的捕獲產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的預(yù)捕獲步驟后e6引物的捕獲產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明實(shí)施例3提供的捕獲步驟后7組探針的捕獲產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供的一種人類線粒體dna文庫的構(gòu)建方法，包括：以待測dna為模板，分別使用本發(fā)明提供的6對預(yù)捕獲引物預(yù)捕獲得到預(yù)捕獲產(chǎn)物，進(jìn)行初步富集；將預(yù)捕獲產(chǎn)物混合并純化后，以預(yù)捕獲產(chǎn)物為模板，分別使用本發(fā)明提供的捕獲探針捕獲得到捕獲產(chǎn)物，進(jìn)行再次富集；在捕獲產(chǎn)物兩端連接接頭序列，構(gòu)建人類線粒體dna文庫。其中，預(yù)捕獲產(chǎn)物為大片段的線粒體基因組。在本發(fā)明中，構(gòu)建方法還包括在接頭序列上引入標(biāo)簽序列，用于標(biāo)記不同來源樣品dna。其中，標(biāo)簽序列位于所述接頭序列的末端。在本發(fā)明中，待測dna為由家系成員外周靜脈血中提取的血液全基因組dna。在本發(fā)明中，接頭序列可根據(jù)不同測序平臺(tái)進(jìn)行替換。其中，替換方法為將本發(fā)明提供的捕獲探針序列中的:“ctttccctacacgacgctcttccgatct”和“tggagttcagacgtgtgctcttccgatct”序列根據(jù)測序平臺(tái)進(jìn)行更改替換。例如可以為，但不限于將“ctttccctacacgacgctcttccgatct”替換為“ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag”，將“tggagttcagacgtgtgctcttccgatct”替換為“cctctctatgggcagtcggtgat”，即可用于iontorrent平臺(tái)檢測。只需要更換為所使用測序平臺(tái)提供的對應(yīng)接頭探針序列，即可適用于illumina、roche454或iontorrent等第二代測序平臺(tái)，有較廣的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供了上述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的人類線粒體dna文庫的測序方法，包括：將構(gòu)建得到的人類線粒體dna文庫在測序平臺(tái)，采用邊合成邊測序的方法進(jìn)行序列的測定，得到測序數(shù)據(jù)。在本發(fā)明中，測序方法還包括對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。其中，分析所用的方法或軟件例如可以為，但不限于spades、gapcloser、gapfiller、prinses-g或samtools。另外，本發(fā)明還提供了上述構(gòu)建方法和測序方法在分析人類線粒體dna異質(zhì)性中的應(yīng)用。為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1設(shè)計(jì)引物和探針根據(jù)發(fā)明所需，設(shè)計(jì)預(yù)捕獲引物如表1所示：表1預(yù)捕獲引物名稱序列序號(hào)e1fagggagctctccatgcatttgseqidno.1e2fagcacacccgtctatgtagcaseqidno.3e3fatcctactcctcattgtacccaseqidno.5e4faccatccttaccaccctcgttseqidno.7e5fagaaaaccccacaaaccccattseqidno.9e6faaaggactgcaaaaccccactseqidno.11e1racaggcggtgcctctaatactseqidno.2e2racctgcggcgtattcgatgttseqidno.4e3ragtgggtttaagtcccattggtseqidno.6e4ratggtcgtggttgtagtccgtseqidno.8e5raggatgaggcaggaatcaaagacseqidno.10e6raaaggtggatgcgacaatggaseqidno.12根據(jù)發(fā)明所需，設(shè)計(jì)捕獲探針和分組如下所示：探針組1：e1f具有如seqidno.13所示序列，e1r具有如seqidno.14所示序列，e8f具有如seqidno.15所示序列，e8r具有如seqidno.16所示序列，e15f具有如seqidno.17所示序列，e15r具有如seqidno.18所示序列，e22f具有如seqidno.19所示序列，e22r具有如seqidno.20所示序列，e29f具有如seqidno.21所示序列，e29r具有如seqidno.22所示序列，e36f具有如seqidno.23所示序列，e36r具有如seqidno.24所示序列，e43f具有如seqidno.25所示序列，e43r具有如seqidno.26所示序列，e50f具有如seqidno.27所示序列，e50r具有如seqidno.28所示序列，e57f具有如seqidno.29所示序列，e57r具有如seqidno.30所示序列；探針組2：e2f具有如seqidno.31所示序列，e2r具有如seqidno.32所示序列，e9f具有如seqidno.33所示序列，e9r具有如seqidno.34所示序列，e16f具有如seqidno.35所示序列，e16r具有如seqidno.36所示序列，e23f具有如seqidno.37所示序列，e23r具有如seqidno.38所示序列，e30f具有如seqidno.39所示序列，e30r具有如seqidno.40所示序列，e37f具有如seqidno.41所示序列，e37r具有如seqidno.42所示序列，e44f具有如seqidno.43所示序列，e44r具有如seqidno.44所示序列，e51f具有如seqidno.45所示序列，e51r具有如seqidno.46所示序列，e58f具有如seqidno.47所示序列，e58r具有如seqidno.48所示序列；探針組3：e3f具有如seqidno.49所示序列，e3r具有如seqidno.50所示序列，e10f具有如seqidno.51所示序列，e10r具有如seqidno.52所示序列，e17f具有如seqidno.53所示序列，e17r具有如seqidno.54所示序列，e24f具有如seqidno.55所示序列，e24r具有如seqidno.56所示序列，e31f具有如seqidno.57所示序列，e31r具有如seqidno.58所示序列，e38f具有如seqidno.59所示序列，e38r具有如seqidno.60所示序列，e45f具有如seqidno.61所示序列，e45r具有如seqidno.62所示序列，e52f具有如seqidno.63所示序列，e52r具有如seqidno.64所示序列，e59f具有如seqidno.65所示序列，e59r具有如seqidno.66所示序列；探針組4：e4f具有如seqidno.67所示序列，e4r具有如seqidno.68所示序列，e11f具有如seqidno.69所示序列，e11r具有如seqidno.70所示序列，e18f具有如seqidno.71所示序列，e18r具有如seqidno.72所示序列，e25f具有如seqidno.73所示序列，e25r具有如seqidno.74所示序列，e32f具有如seqidno.75所示序列，e32r具有如seqidno.76所示序列，e39f具有如seqidno.77所示序列，e39r具有如seqidno.78所示序列，e46f具有如seqidno.79所示序列，e46r具有如seqidno.80所示序列，e53f具有如seqidno.81所示序列，e53r具有如seqidno.82所示序列，e60f具有如seqidno.83所示序列，e60r具有如seqidno.84所示序列；探針組5：e5f具有如seqidno.85所示序列，e5r具有如seqidno.86所示序列，e12f具有如seqidno.87所示序列，e12r具有如seqidno.88所示序列，e19f具有如seqidno.89所示序列，e19r具有如seqidno.90所示序列，e26f具有如seqidno.91所示序列，e26r具有如seqidno.92所示序列，e33f具有如seqidno.93所示序列，e33r具有如seqidno.94所示序列，e40f具有如seqidno.95所示序列，e40r具有如seqidno.96所示序列，e47f具有如seqidno.97所示序列，e47r具有如seqidno.98所示序列，e54f具有如seqidno.99所示序列，e54r具有如seqidno.100所示序列，e61f具有如seqidno.101所示序列，e61r具有如seqidno.102所示序列；探針組6：e6f具有如seqidno.103所示序列，e6r具有如seqidno.104所示序列，e13f具有如seqidno.105所示序列，e13r具有如seqidno.106所示序列，e20f具有如seqidno.107所示序列，e20r具有如seqidno.108所示序列，e27f具有如seqidno.109所示序列，e27r具有如seqidno.110所示序列，e34f具有如seqidno.111所示序列，e34r具有如seqidno.112所示序列，e41f具有如seqidno.113所示序列，e41r具有如seqidno.114所示序列，e48f具有如seqidno.115所示序列，e48r具有如seqidno.116所示序列，e55f具有如seqidno.117所示序列，e55r具有如seqidno.118所示序列，e62f具有如seqidno.119所示序列，e62r具有如seqidno.120所示序列；探針組7：e7f具有如seqidno.121所示序列，e7r具有如seqidno.122所示序列，e14f具有如seqidno.123所示序列，e14r具有如seqidno.124所示序列，e21f具有如seqidno.125所示序列，e21r具有如seqidno.126所示序列，e28f具有如seqidno.127所示序列，e28r具有如seqidno.128所示序列，e35f具有如seqidno.129所示序列，e35r具有如seqidno.130所示序列，e42f具有如seqidno.131所示序列，e42r具有如seqidno.132所示序列，e49f具有如seqidno.133所示序列，e49r具有如seqidno.134所示序列，e56f具有如seqidno.135所示序列，e56r具有如seqidno.136所示序列，e63f具有如seqidno.137所示序列，e63r具有如seqidno.138所示序列。實(shí)施例2樣本制備dna提取1.采集標(biāo)本：經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)、家系成員簽署知情同意書后收集家系成員外周靜脈血2ml，用于基因檢測。2.全基因組dna的抽提：按血液基因組dna抽提試劑盒操作說明進(jìn)行操作，試劑盒為dneasyblood&tissuekit。實(shí)施例3人類線粒體dna文庫的構(gòu)建(1)預(yù)捕獲以實(shí)施例2中提取的dna為模板，分別使用本發(fā)明實(shí)施例1提供的6對預(yù)捕獲引物(表1所示)捕獲pcr，獲得靶序列預(yù)捕獲產(chǎn)物。預(yù)捕獲反應(yīng)體系參見表3。表3預(yù)捕獲體系試劑體積10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl模板dna2μlddh2o16.375μl反應(yīng)條件為95℃，3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min，共擴(kuò)增30循環(huán)；最終72℃延伸10min。結(jié)果如圖2和圖3所示，從圖2和圖3中可以看出，使用預(yù)捕獲引物捕獲的片段完成，特異性良好，說明預(yù)捕獲引物能有效發(fā)揮去除基因組dna干擾，富集線粒體dna片段的作用。(2)預(yù)捕獲樣本混合將步驟(1)獲得的樣本混合后，使用磁珠純化后，作為模板進(jìn)行捕獲。(3)捕獲捕獲探針配比如本發(fā)明實(shí)施例1所示，分為7組，每組探針分別進(jìn)行捕獲。獲反應(yīng)體系參見表4。表格4捕獲反應(yīng)體系試劑體積10×pcrbufferwithmg2+2.5μldntpmixture(2.5mmeach)2μltaqdna聚合酶(5u/μl)0.125μl捕獲探針1μl步驟(2)獲得模板2μlddh2o16.375μl反應(yīng)條件為95℃，3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共擴(kuò)增30循環(huán)；最終72℃延伸10min。結(jié)果如圖4所示，從圖4中可以看出，7組探針捕獲產(chǎn)物結(jié)果均一，說明捕獲質(zhì)量良好。將7組探針捕獲產(chǎn)物混合后，使用磁珠純化捕獲產(chǎn)物。(5)pcr擴(kuò)增捕獲文庫pcr擴(kuò)增捕獲產(chǎn)物，使用接頭為illumina提供序列。pcr體系如表5所示：表5pcr擴(kuò)增體系試劑體積來自步驟(4)模板21μlhifimix25μlann公共引物(10pmol/μl)2μlannindex(10pmol/μl)2μltotal50μl反應(yīng)條件為95℃，3min；95℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸60s，共擴(kuò)增8個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10min。(6)pcr產(chǎn)物用磁珠純化，最后溶于30μl純水中。實(shí)施例4人類線粒體dna文庫的測序?qū)悠酚趇llumina測序平臺(tái)中進(jìn)行雙末端測序，同時(shí)對樣品上的標(biāo)簽序列也進(jìn)行測序。通過數(shù)據(jù)分析測序數(shù)據(jù)的樣品來源，并對樣品的捕獲效果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，捕獲樣本拼接結(jié)果如下：all_length:16696；n_num:0；max_len:16696；average_len:16696；contig_num:1；n50:16696；gap_num:0；gc_content:44.49。捕獲樣本突變注釋結(jié)果如表7所示。表7捕獲樣本突變注釋結(jié)果綜上所述，通過對結(jié)果進(jìn)行分析，使用本方法能有效捕獲線粒體序列全長，并進(jìn)行拼接，覆蓋度達(dá)到100％，平均測序深度3500x以上，結(jié)合二代測序的大數(shù)據(jù)量優(yōu)勢，能有效對人類線粒體序列進(jìn)行分析。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。<110>杭州祥音生物醫(yī)藥科技有限公司<120>用于構(gòu)建人類線粒體dna文庫的預(yù)捕獲引物、捕獲探針及構(gòu)建方法、測序方法和應(yīng)用<160>138<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gggagctctccatgcatttg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2caggcggtgcctctaatact20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gcacacccgtctatgtagca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4cctgcggcgtattcgatgtt20<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<400>5tcctactcctcattgtaccca21<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<400>6gtgggtttaagtcccattggt21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ccatccttaccaccctcgtt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tggtcgtggttgtagtccgt20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9gaaaaccccacaaaccccatt21<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10ggatgaggcaggaatcaaagac22<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11aaggactgcaaaaccccact20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12aaggtggatgcgacaatgga20<210>13<211>48<212>dna<213>人工序列<400>13ctttccctacacgacgctcttccgatctgggagctctccatgcatttg48<210>14<211>50<212>dna<213>人工序列<400>14tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaagtgcataccgccaaaaga50<210>15<211>50<212>dna<213>人工序列<400>15ctttccctacacgacgctcttccgatctctgccaaaccccaaaaacaaag50<210>16<211>51<212>dna<213>人工序列<400>16tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcgtggtgatttagagggtgaa51<210>17<211>48<212>dna<213>人工序列<400>17ctttccctacacgacgctcttccgatctttagacgggctcacatcacc48<210>18<211>49<212>dna<213>人工序列<400>18tggagttcagacgtgtgctcttccgatctacgccggcttctattgactt49<210>19<211>49<212>dna<213>人工序列<400>19ctttccctacacgacgctcttccgatctctaaccccagggttggtcaat49<210>20<211>49<212>dna<213>人工序列<400>20tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgagcaagaggtggtgaggtt49<210>21<211>48<212>dna<213>人工序列<400>21ctttccctacacgacgctcttccgatctggcggtgcttcatatccctc48<210>22<211>50<212>dna<213>人工序列<400>22tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatacttgaggagggtgacggg50<210>23<211>49<212>dna<213>人工序列<400>23ctttccctacacgacgctcttccgatctgggtcgaaggtggatttagca49<210>24<211>49<212>dna<213>人工序列<400>24tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcgccaggtttcaatttct49<210>25<211>48<212>dna<213>人工序列<400>25ctttccctacacgacgctcttccgatcttgagctaaacctagccccaa48<210>26<211>49<212>dna<213>人工序列<400>26tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatcaccaggctcggtaggtt49<210>27<211>48<212>dna<213>人工序列<400>27ctttccctacacgacgctcttccgatctgcacacccgtctatgtagca48<210>28<211>49<212>dna<213>人工序列<400>28tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgggtgtgaggagttcagtt49<210>29<211>48<212>dna<213>人工序列<400>29ctttccctacacgacgctcttccgatctggcctaaaagcagccaccaa48<210>30<211>49<212>dna<213>人工序列<400>30tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcaggcggtgcctctaatact49<210>31<211>50<212>dna<213>人工序列<400>31ctttccctacacgacgctcttccgatctcaggcatgctcataaggaaagg50<210>32<211>50<212>dna<213>人工序列<400>32tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtttaggacctgtgggtttg50<210>33<211>49<212>dna<213>人工序列<400>33ctttccctacacgacgctcttccgatctgcgggcataacacagcaagac49<210>34<211>52<212>dna<213>人工序列<400>34tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctggattactccggtctgaact52<210>35<211>47<212>dna<213>人工序列<400>35ctttccctacacgacgctcttccgatctcgatggtgcagccgctatt47<210>36<211>49<212>dna<213>人工序列<400>36tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgttggggcctttgcgtagtt49<210>37<211>49<212>dna<213>人工序列<400>37ctttccctacacgacgctcttccgatcttcctactcctcattgtaccca49<210>38<211>50<212>dna<213>人工序列<400>38tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcagggcgtagtttgagtttg50<210>39<211>49<212>dna<213>人工序列<400>39ctttccctacacgacgctcttccgatctcctcaacctaggcctcctatt49<210>40<211>49<212>dna<213>人工序列<400>40tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctgcggcgtattcgatgtt49<210>41<211>48<212>dna<213>人工序列<400>41ctttccctacacgacgctcttccgatctctccacactagcagagacca48<210>42<211>50<212>dna<213>人工序列<400>42tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatgctagggtgagtggtagga50<210>43<211>48<212>dna<213>人工序列<400>43ctttccctacacgacgctcttccgatctcatacccccgattccgctac48<210>44<211>49<212>dna<213>人工序列<400>44tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagtgtgcctgcaaagatggt49<210>45<211>46<212>dna<213>人工序列<400>45ctttccctacacgacgctcttccgatctcgggcccataccccgaaa46<210>46<211>49<212>dna<213>人工序列<400>46tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgggtgccttgggtaacctct49<210>47<211>49<212>dna<213>人工序列<400>47ctttccctacacgacgctcttccgatctccggacaatgaaccataacca49<210>48<211>51<212>dna<213>人工序列<400>48tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagttgagtagtaggaatgcggt51<210>49<211>51<212>dna<213>人工序列<400>49ctttccctacacgacgctcttccgatctaccgtacaaccctaacataacca51<210>50<211>49<212>dna<213>人工序列<400>50tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggaggaatggggtgggtttt49<210>51<211>49<212>dna<213>人工序列<400>51ctttccctacacgacgctcttccgatctacgcctaatctactccacctc49<210>52<211>50<212>dna<213>人工序列<400>52tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtgggtttaagtcccattggt50<210>53<211>48<212>dna<213>人工序列<400>53ctttccctacacgacgctcttccgatctaaggactgcaaaaccccact48<210>54<211>49<212>dna<213>人工序列<400>54tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaatagtcaacggtcggcgaa49<210>55<211>49<212>dna<213>人工序列<400>55ctttccctacacgacgctcttccgatctacctcggagctggtaaaaaga49<210>56<211>50<212>dna<213>人工序列<400>56tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgccaaagcctccgattatga50<210>57<211>50<212>dna<213>人工序列<400>57ctttccctacacgacgctcttccgatctgcaaccttctaggtaacgacca50<210>58<211>48<212>dna<213>人工序列<400>58tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcgaagaggggcgtttggta48<210>59<211>49<212>dna<213>人工序列<400>59ctttccctacacgacgctcttccgatctggggccatcaatttcatcaca49<210>60<211>50<212>dna<213>人工序列<400>60tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggtgtgctcacacgataaacc50<210>61<211>49<212>dna<213>人工序列<400>61ctttccctacacgacgctcttccgatcttcctaccaggcttcggaataa49<210>62<211>50<212>dna<213>人工序列<400>62tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtggaagtgggctacaacgta50<210>63<211>48<212>dna<213>人工序列<400>63ctttccctacacgacgctcttccgatcttggcctgactggcattgtat48<210>64<211>50<212>dna<213>人工序列<400>64tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcgaagcgaaggcttctcaaa50<210>65<211>48<212>dna<213>人工序列<400>65ctttccctacacgacgctcttccgatcttaccccgatgcatacaccac48<210>66<211>50<212>dna<213>人工序列<400>66tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtagacctacttgcgctgcat50<210>67<211>48<212>dna<213>人工序列<400>67ctttccctacacgacgctcttccgatctcacacattcgaagaacccgt48<210>68<211>49<212>dna<213>人工序列<400>68tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaggatgcgtagggatggga49<210>69<211>49<212>dna<213>人工序列<400>69ctttccctacacgacgctcttccgatctacatctcagacgctcaggaaa49<210>70<211>49<212>dna<213>人工序列<400>70tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggtcgtgtagcggtgaaagt49<210>71<211>48<212>dna<213>人工序列<400>71ctttccctacacgacgctcttccgatctgctgtccccacattaggctt48<210>72<211>49<212>dna<213>人工序列<400>72tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttggtgggccatacggtagta49<210>73<211>49<212>dna<213>人工序列<400>73ctttccctacacgacgctcttccgatctccctatagcaccccctctacc49<210>74<211>50<212>dna<213>人工序列<400>74tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgggtggtgattagtcggttgt50<210>75<211>49<212>dna<213>人工序列<400>75ctttccctacacgacgctcttccgatctattcattgcccccacaatcct49<210>76<211>49<212>dna<213>人工序列<400>76tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaatcactgtgcccgctcata49<210>77<211>48<212>dna<213>人工序列<400>77ctttccctacacgacgctcttccgatctacaactaacctcctcggact48<210>78<211>49<212>dna<213>人工序列<400>78tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggcttggattaaggcgacag49<210>79<211>48<212>dna<213>人工序列<400>79ctttccctacacgacgctcttccgatctattactgcaggccacctact48<210>80<211>50<212>dna<213>人工序列<400>80tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttggccttggtatgtgctttct50<210>81<211>48<212>dna<213>人工序列<400>81ctttccctacacgacgctcttccgatctccactccataacgctcctca48<210>82<211>49<212>dna<213>人工序列<400>82tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaggggatttagcggggtgat49<210>83<211>48<212>dna<213>人工序列<400>83ctttccctacacgacgctcttccgatctgagccttttaccactccagc48<210>84<211>50<212>dna<213>人工序列<400>84tggagttcagacgtgtgctcttccgatctatgacgtgaagtccgtggaag50<210>85<211>48<212>dna<213>人工序列<400>85ctttccctacacgacgctcttccgatctcttcgagtctcccttcacca48<210>86<211>49<212>dna<213>人工序列<400>86tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagccgttgagttgtggtagt49<210>87<211>53<212>dna<213>人工序列<400>87ctttccctacacgacgctcttccgatctctccatctattgatgagggtcttac53<210>88<211>50<212>dna<213>人工序列<400>88tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgccagacttagggctaggatg50<210>89<211>49<212>dna<213>人工序列<400>89ctttccctacacgacgctcttccgatcttacccctaccatgagccctac49<210>90<211>49<212>dna<213>人工序列<400>90tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgctaagagggagtgggtgtt49<210>91<211>50<212>dna<213>人工序列<400>91ctttccctacacgacgctcttccgatctatcgctcacacctcatatcctc50<210>92<211>50<212>dna<213>人工序列<400>92tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaattaggctgtgggtggttgt50<210>93<211>51<212>dna<213>人工序列<400>93ctttccctacacgacgctcttccgatcttgctaaaactaatcgtcccaaca51<210>94<211>49<212>dna<213>人工序列<400>94tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgccaaggtggggataagtgt49<210>95<211>49<212>dna<213>人工序列<400>95ctttccctacacgacgctcttccgatctacgccacttatccagtgaacc49<210>96<211>49<212>dna<213>人工序列<400>96tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcgacatgggctttagggagt49<210>97<211>50<212>dna<213>人工序列<400>97ctttccctacacgacgctcttccgatcttactcactctcactgcccaaga50<210>98<211>50<212>dna<213>人工序列<400>98tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgagggctatgtggctgattga50<210>99<211>48<212>dna<213>人工序列<400>99ctttccctacacgacgctcttccgatctcaagctccatctgcctacga48<210>100<211>51<212>dna<213>人工序列<400>100tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggagaacgtggttactagcaca51<210>101<211>51<212>dna<213>人工序列<400>101ctttccctacacgacgctcttccgatctggacttcaaactctactcccact51<210>102<211>49<212>dna<213>人工序列<400>102tggagttcagacgtgtgctcttccgatctccggtaatgatgtcggggtt49<210>103<211>49<212>dna<213>人工序列<400>103ctttccctacacgacgctcttccgatcttcacacgagaaaacaccctca49<210>104<211>49<212>dna<213>人工序列<400>104tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaaggtggatgcgacaatgga49<210>105<211>48<212>dna<213>人工序列<400>105ctttccctacacgacgctcttccgatctccatccttaccaccctcgtt48<210>106<211>49<212>dna<213>人工序列<400>106tggagttcagacgtgtgctcttccgatctccctctcagccgatgaacag49<210>107<211>53<212>dna<213>人工序列<400>107ctttccctacacgacgctcttccgatcttcagacccaaacattaatcagttct53<210>108<211>49<212>dna<213>人工序列<400>108tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggtgaggcttggattagcgt49<210>109<211>48<212>dna<213>人工序列<400>109ctttccctacacgacgctcttccgatctatcggtttcatcctcgcctt48<210>110<211>49<212>dna<213>人工序列<400>110tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgtggtgatagcgcctaagca49<210>111<211>50<212>dna<213>人工序列<400>111ctttccctacacgacgctcttccgatctttcttactcatccgcttccacc50<210>112<211>49<212>dna<213>人工序列<400>112tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgctaatgctaggctgccaat49<210>113<211>49<212>dna<213>人工序列<400>113ctttccctacacgacgctcttccgatctctccgggtccatcatccacaa49<210>114<211>50<212>dna<213>人工序列<400>114tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgatgcgggggaaatgttgtta50<210>115<211>48<212>dna<213>人工序列<400>115ctttccctacacgacgctcttccgatctacctcgcttccccaccctta48<210>116<211>50<212>dna<213>人工序列<400>116tggagttcagacgtgtgctcttccgatctgaggagtaggggcaggttttg50<210>117<211>50<212>dna<213>人工序列<400>117ctttccctacacgacgctcttccgatctttctaccctagcatcacacacc50<210>118<211>49<212>dna<213>人工序列<400>118tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcagggttgattcgggagga49<210>119<211>49<212>dna<213>人工序列<400>119ctttccctacacgacgctcttccgatctattcccccgagcaatctcaat49<210>120<211>51<212>dna<213>人工序列<400>120tggagttcagacgtgtgctcttccgatctagggggaatgatggttgtcttt51<210>121<211>48<212>dna<213>人工序列<400>121ctttccctacacgacgctcttccgatcttcaccaagacctcaacccct48<210>122<211>49<212>dna<213>人工序列<400>122tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttggtcgtggttgtagtccgt49<210>123<211>49<212>dna<213>人工序列<400>123ctttccctacacgacgctcttccgatctgaaaaccccacaaaccccatt49<210>124<211>49<212>dna<213>人工序列<400>124tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgaggcgtctggtgagtagt49<210>125<211>49<212>dna<213>人工序列<400>125ctttccctacacgacgctcttccgatctgaaacttcggctcactccttg49<210>126<211>49<212>dna<213>人工序列<400>126tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgtatgggatggcggatagt49<210>127<211>50<212>dna<213>人工序列<400>127ctttccctacacgacgctcttccgatctgcttgcaactatagcaacagcc50<210>128<211>48<212>dna<213>人工序列<400>128tggagttcagacgtgtgctcttccgatctcgcctaggaggtctggtga48<210>129<211>47<212>dna<213>人工序列<400>129ctttccctacacgacgctcttccgatctcaaagacgccctcggctta47<210>130<211>50<212>dna<213>人工序列<400>130tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggttgtcctccgattcaggtt50<210>131<211>51<212>dna<213>人工序列<400>131ctttccctacacgacgctcttccgatctcctagcaataatccccatcctcc51<210>132<211>50<212>dna<213>人工序列<400>132tggagttcagacgtgtgctcttccgatcttttgggtgctaatggtggagt50<210>133<211>48<212>dna<213>人工序列<400>133ctttccctacacgacgctcttccgatctcaccagtcttgtaaaccgga48<210>134<211>50<212>dna<213>人工序列<400>134tggagttcagacgtgtgctcttccgatctaagggtgggtaggtttgttgg50<210>135<211>48<212>dna<213>人工序列<400>135ctttccctacacgacgctcttccgatctaaccccctccccatgcttac48<210>136<211>48<212>dna<213>人工序列<400>136tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggggaacgtgtgggctatt48<210>137<211>48<212>dna<213>人工序列<400>137ctttccctacacgacgctcttccgatctatatcccgcacaagagtgct48<210>138<211>51<212>dna<213>人工序列<400>138tggagttcagacgtgtgctcttccgatctggatgaggcaggaatcaaagac51當(dāng)前第1頁12