本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來(lái)說(shuō)是一種耐用型固定化單寧酶的制備及采用固定化單寧酶制備沒(méi)食子酸的新工藝。
背景技術(shù)：
：中國(guó)是五倍子種植大國(guó)，五倍子提取物的產(chǎn)量位居世界前列。五倍子提取物中的主要成分為單寧酸。單寧酸分子是葡萄糖與沒(méi)食子酸形成的酯結(jié)構(gòu)。沒(méi)食子酸是一種重要的化工中間體，通常是由沒(méi)食子酸水解制備而來(lái)。由單寧酸制備沒(méi)食子酸的工藝主要有：(1)酸或堿性條件下，加熱水解；(2)生物發(fā)酵法；(3)酶法。目前國(guó)內(nèi)幾個(gè)主要廠家的生產(chǎn)工藝仍是以酸或堿性條件下加熱水解，但這種工藝能耗高、污水多、單寧酸轉(zhuǎn)化率低、安全性差。而生物發(fā)酵法生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，且單寧酸通常水解不完全。酶法則是使用單寧酶進(jìn)行催化水解。單寧酶(tannase,ec3.1.1.20)，全稱(chēng)單寧酯酰水解酶，能將單寧酸水解為沒(méi)食子酸和葡萄糖。采用酶法也有兩個(gè)明顯的問(wèn)題：(1)采用游離的單寧酶，使用成本較高；(2)采用固定化的單寧酶，使用成本低，但單寧酸轉(zhuǎn)化率也低。如何解決固定化單寧酶單寧酸轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，既需要改進(jìn)固定化方法，也需要更合適的應(yīng)用工藝。本發(fā)明的耐用型固定化單寧酶，解決了固定化單寧酶的耐用性問(wèn)題，降低了使用成本，同時(shí)，發(fā)明了一種新的應(yīng)用方法，大大提高了單寧酸的轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明的固定化單寧酶催化反應(yīng)方程式如下：技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有固定化單寧酶，催化批次少、單寧酸殘留高、轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種耐用型固定化單寧酶的制備，及在沒(méi)食子酸中的應(yīng)用新工藝。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采取的技術(shù)手段如下：一種固定化單寧酶，采用胺基型載體。制備所述的固定化單寧酶的方法，具體步驟如下：(1)胺基型載體的制備；將單體和交聯(lián)劑利用懸浮聚合法，制備環(huán)氧型基球，再將環(huán)氧型基球與有機(jī)胺進(jìn)行反應(yīng)，得到胺基型載體；具體步驟為：將分散劑和去離子水作為分散相；將單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑混合均勻，為有機(jī)相。將有機(jī)相加入至分散相中，調(diào)節(jié)粒度，在一定溫度下進(jìn)行懸浮聚合。聚合反應(yīng)結(jié)束，用丙酮或乙醇淋洗致孔劑。篩分出合適的粒度，得環(huán)氧型基球。將有機(jī)胺配置一定濃度，加入環(huán)氧型基球，在一定溫度下進(jìn)行胺化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束，洗凈殘液，得胺基型載體。所述的大孔吸附樹(shù)脂環(huán)氧型基球在懸浮聚合中所選用的單體是甲基丙烯酸縮水甘油酯、丙烯酸縮水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇二丙烯酸酯、丙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇四甲基丙烯酸酯、季戊四醇三甲基丙烯酸酯、季戊四醇二甲基丙烯酸酯、葡萄糖五甲基丙烯酸酯、葡萄糖四甲基丙烯酸酯、葡萄糖三甲基丙烯酸酯、葡萄糖二甲基丙烯酸酯中的一種或幾種組合；所述的大孔吸附樹(shù)脂環(huán)氧型基球在懸浮聚合中所選用的交聯(lián)劑是二乙烯苯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、衣康酸烯丙酯、甲基丙烯酸烯丙酯、三聚異氰酸烯丙酯中的一種或多種組合；所述的環(huán)氧型基球的環(huán)氧值在300～500umol/g(環(huán)氧值高說(shuō)明載體上的固定化基團(tuán)較多，有利于酶的固定化，但環(huán)氧值過(guò)高，導(dǎo)致載體功能基團(tuán)太多而交聯(lián)度不夠，影響載體的強(qiáng)度)；孔徑在50～100nm(孔徑大有利于底物在孔道內(nèi)的擴(kuò)散，但孔徑過(guò)大，載體強(qiáng)度低)；強(qiáng)度測(cè)試時(shí)，濁度小于200(濁度越大，載體強(qiáng)度越差，影響固定化酶的使用壽命)；粒徑在100-1000um；含水量在35-85％。(2)胺基型載體的預(yù)處理；將步驟(1)所制得的胺基型載體用磷酸緩沖溶液進(jìn)行處理，處理后，用戊二醛溶液進(jìn)行活化；具體為：將胺基型載體放至層析柱中，用1～10倍載體床層體積的磷酸緩沖液從上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游離水；再把載體轉(zhuǎn)移至1～10倍體積的戊二醛溶液(濃度為0.5～5％)中，在10～40℃下攪拌0.5～24h；過(guò)濾，用1～10倍體積的磷酸緩沖液沖洗，抽干。(3)單寧酶酶液的固定化；將游離型的單寧酶酶液加入至磷酸緩沖溶液中溶解，再將步驟(2)中活化過(guò)的胺基型載體加至溶有單寧酶酶液的磷酸鹽緩沖液中，活化后的胺基型載體占溶解后的單寧酶酶液重量的0.05～0.5倍，在20-30℃下振蕩15-40h后過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行沖洗，得到固定化的單寧酶。步驟(1)中所述的環(huán)氧型基球是苯乙烯系大孔吸附樹(shù)脂、丙烯酸系大孔吸附樹(shù)脂環(huán)氧型基球中的一種或兩種組合。步驟(3)中所述的游離型單寧酶酶液為黑曲霉或米曲霉來(lái)源的單寧酶酶液。步驟(3)中所得到的固定化單寧酶的酶活力為50～250u/g。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將固定化單寧酶裝至層析柱中，制得酶床層；(2)配置濃度為1～20％(w/v)的單寧酸溶液作為底物，讓單寧酸溶液勻速流過(guò)步驟(1)制備的酶床層中，流速為0.1～2bv/h(bv為酶床層體積倍數(shù))，柱內(nèi)溫度控制在20-60℃，酶床層連續(xù)流過(guò)2～50bv的單寧酸溶液后，用去離子水0.2～10bv沖洗酶床層；沖洗后的酶床層繼續(xù)用于下一批次使用；(3)將步驟(2)中從酶床層流出的料液，去結(jié)晶精制得沒(méi)食子酸。步驟(1)中所述的將固定化單寧酶裝至層析柱中，其中層析柱中酶床層的徑高比為1/(1～20)。關(guān)于本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)，可以通過(guò)下述方面闡述：(1)采用了胺基型載體作為固定化單寧酶的載體，并提供了所選胺基型載體的制備工藝。這種載體功能基團(tuán)高，采用共價(jià)鍵進(jìn)行酶的固定化，酶的穩(wěn)定性好，酶不易脫落和衰減。因?yàn)檩d體強(qiáng)度好，不易破碎，生產(chǎn)中流失少。載體孔徑大，有利于底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，能提高單寧酸轉(zhuǎn)化率，減少雜質(zhì)對(duì)酶的污染。(2)目前市場(chǎng)上，未見(jiàn)有固定化單寧酶商品出售。從資料報(bào)道的固定化單寧酶看，也很少提供酶的使用壽命。本發(fā)明的固定化單寧酶，使用壽命周期在300批，連接載體和酶的共價(jià)鍵牢固，固定化酶的載體強(qiáng)度好，不易破碎流失，耐污染。大幅降低了沒(méi)食子酸的生產(chǎn)成本。(3)本發(fā)明首次采用柱狀固定床式反應(yīng)器來(lái)使用固定化單寧酶。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，將固定化單寧酶加入單寧酸溶液中攪拌使用，但本發(fā)明在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)產(chǎn)物沒(méi)食子酸對(duì)單寧酶的酶活性有抑制作用，從而導(dǎo)致攪拌式的單寧酸轉(zhuǎn)化率低，同時(shí)攪拌式使用更易導(dǎo)致固定化單寧酶顆粒的破碎和流失。本發(fā)明采用固定床式柱狀反應(yīng)器的使用方法，結(jié)合本發(fā)明的固定化單寧酶較高的酶活，底物單寧酸在床層中能高效催化，從而在床層內(nèi)的停留時(shí)間不需要很長(zhǎng)，并且轉(zhuǎn)化率更高，酶顆粒破碎更少?，F(xiàn)有沒(méi)食子酸生產(chǎn)中，因?yàn)樗夥磻?yīng)是可逆反應(yīng)，通過(guò)化學(xué)法，單寧酸的轉(zhuǎn)化率低，通常反應(yīng)中單寧酸的轉(zhuǎn)化率低于90％。而采用本發(fā)明的固定化單寧酶催化后，反應(yīng)液中單寧酸轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到98％。這既提高了單寧酸轉(zhuǎn)化率，也減少了產(chǎn)品中的雜質(zhì)。綜上所述，本發(fā)明的固定化單寧酶利用單寧酸制備了產(chǎn)物沒(méi)食子酸，該法提高了單寧酸的轉(zhuǎn)化率，使得成本降低，而且所制得的產(chǎn)品質(zhì)量較好。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例三固定化單寧酶使用壽命的考察(以連續(xù)兩批殘留濃度高于0.8g/l為終點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn))；圖2為實(shí)施例一固定化單寧酶催化時(shí)單寧酸轉(zhuǎn)化率隨批次的變化關(guān)系。具體實(shí)施方式本發(fā)明通過(guò)圖表對(duì)比和實(shí)施例來(lái)闡明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例一(1)胺基型載體的制備；將分散劑和去離子水作為分散相；將甲基丙烯酸縮水甘油酯、二乙烯苯、致孔劑、引發(fā)劑混合均勻，為有機(jī)相。將有機(jī)相加入至分散相中，調(diào)節(jié)粒度，在一定溫度下進(jìn)行懸浮聚合。聚合反應(yīng)結(jié)束，用丙酮淋洗致孔劑。篩分出合適的粒度，得環(huán)氧型基球。環(huán)氧型基球的環(huán)氧值在320umol/g；孔徑80nm；強(qiáng)度測(cè)試時(shí)，濁度180；粒徑400um；含水量55％。將環(huán)氧型基球與乙二胺進(jìn)行反應(yīng)，得到胺基型載體。(2)胺基型載體的預(yù)處理；將胺基型載體放至層析柱中，用2倍載體床層體積的磷酸緩沖液從上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游離水；再把載體轉(zhuǎn)移至8倍載體床層體積的戊二醛溶液(濃度為1％)中，在20℃下攪拌20h；過(guò)濾，用2倍體積的磷酸緩沖液沖洗，抽干。(3)單寧酶酶液的固定化；將游離型的來(lái)源于黑曲霉的單寧酶酶液加入至磷酸緩沖溶液中溶解，再將步驟(2)中活化過(guò)的胺基型載體加至溶有單寧酶酶液的磷酸鹽緩沖液中，活化后的胺基型載體占溶解后的單寧酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振蕩20h后過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行沖洗，得到固定化的單寧酶。所得到的固定化單寧酶的酶活力為70u/g。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將固定化單寧酶裝至層析柱中，制得酶床層，酶床層高徑比在10/1；(2)配置濃度為4％(w/v)的單寧酸溶液作為底物，讓單寧酸溶液勻速流過(guò)步驟(1)制備的酶床層中，流速為0.8bv/h(bv為酶床層體積倍數(shù))，柱內(nèi)溫度控制在45℃，酶床層連續(xù)流過(guò)25bv的單寧酸溶液后，用去離子水10bv沖洗酶床層；沖洗后的酶床層繼續(xù)用于下一批次使用；(3)將步驟(2)中從酶床層流出的料液，去結(jié)晶精制得沒(méi)食子酸。清洗后的酶床層用于下一批催化反應(yīng)。實(shí)施例二(1)胺基型載體的制備；將分散劑和去離子水作為分散相；將乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚異氰酸烯丙酯、二乙烯苯、致孔劑、引發(fā)劑混合均勻，為有機(jī)相。將有機(jī)相加入至分散相中，調(diào)節(jié)粒度，在一定溫度下進(jìn)行懸浮聚合。聚合反應(yīng)結(jié)束，用丙酮淋洗致孔劑。篩分出合適的粒度，得環(huán)氧型基球。環(huán)氧型基球的環(huán)氧值在330umol/g；孔徑70nm；強(qiáng)度測(cè)試時(shí)，濁度160；粒徑300um；含水量65％。將環(huán)氧型基球與丁二胺進(jìn)行反應(yīng)，得到胺基型載體。(2)胺基型載體的預(yù)處理；將胺基型載體放至層析柱中，用5倍載體床層體積的磷酸緩沖液從上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游離水；再把載體轉(zhuǎn)移至8倍載體床層體積的戊二醛溶液(濃度為5％)中，在30℃下攪拌24h；過(guò)濾，用10倍體積的磷酸緩沖液沖洗，抽干。(3)單寧酶酶液的固定化；將游離型的來(lái)源于米曲霉的單寧酶酶液加入至磷酸緩沖溶液中溶解，再將步驟(2)中活化過(guò)的胺基型載體加至溶有單寧酶酶液的磷酸鹽緩沖液中，活化后的胺基型載體占溶解后的單寧酶酶液重量的0.2倍，在30℃下振蕩15h后過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行沖洗，得到固定化的單寧酶。所得到的固定化單寧酶的酶活力為110u/g。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將固定化單寧酶裝至層析柱中，制得酶床層，酶床層高徑比在20/1；(2)配置濃度為6％(w/v)的單寧酸溶液作為底物，讓單寧酸溶液勻速流過(guò)步驟(1)制備的酶床層中，流速為0.8bv/h(bv為酶床層體積倍數(shù))，柱內(nèi)溫度控制在50℃，酶床層連續(xù)流過(guò)16.7bv的單寧酸溶液后，用去離子水10bv沖洗酶床層；沖洗后的酶床層繼續(xù)用于下一批次使用；(3)將步驟(2)中從酶床層流出的料液，去結(jié)晶精制得沒(méi)食子酸。清洗后的酶床層用于下一批催化反應(yīng)。實(shí)施例三(1)胺基型載體的制備；將分散劑和去離子水作為分散相；將甲基丙烯酸縮水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、三聚異氰酸烯丙酯、致孔劑、引發(fā)劑混合均勻，為有機(jī)相。將有機(jī)相加入至分散相中，調(diào)節(jié)粒度，在一定溫度下進(jìn)行懸浮聚合。聚合反應(yīng)結(jié)束，用丙酮淋洗致孔劑。篩分出合適的粒度，得環(huán)氧型基球。環(huán)氧型基球的環(huán)氧值在330umol/g；孔徑70nm；強(qiáng)度測(cè)試時(shí)，濁度160；粒徑300um；含水量65％。將環(huán)氧型基球與己二胺進(jìn)行反應(yīng)，得到胺基型載體。(2)胺基型載體的預(yù)處理；將胺基型載體放至層析柱中，用6倍載體床層體積的磷酸緩沖液從上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游離水；再把載體轉(zhuǎn)移至6倍載體床層體積的戊二醛溶液(濃度為0.8％)中，在25℃下攪拌20h；過(guò)濾，用6倍體積的磷酸緩沖液沖洗，抽干。(3)單寧酶酶液的固定化；將游離型的單寧酶酶液加入至磷酸緩沖溶液中溶解，再將步驟(2)中活化過(guò)的胺基型載體加至溶有單寧酶酶液的磷酸鹽緩沖液中，活化后的胺基型載體占溶解后的單寧酶酶液重量的0.2倍，在30℃下振蕩20h后過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行沖洗，得到固定化的單寧酶。所得到的固定化單寧酶的酶活力為95u/g。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將固定化單寧酶裝至層析柱中，制得酶床層，酶床層高徑比在20/1；(2)配置濃度為6％(w/v)的單寧酸溶液作為底物，讓單寧酸溶液勻速流過(guò)步驟(1)制備的酶床層中，流速為0.8bv/h(bv為酶床層體積倍數(shù))，柱內(nèi)溫度控制在50℃，酶床層連續(xù)流過(guò)16.7bv的單寧酸溶液后，用去離子水10bv沖洗酶床層；沖洗后的酶床層繼續(xù)用于下一批次使用；(3)將步驟(2)中從酶床層流出的料液，去結(jié)晶精制得沒(méi)食子酸。清洗后的酶床層用于下一批催化反應(yīng)。實(shí)施例四(1)胺基型載體的制備；將分散劑和去離子水作為分散相；將甲基丙烯酸縮水甘油酯、二乙烯苯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、致孔劑、引發(fā)劑混合均勻，為有機(jī)相。將有機(jī)相加入至分散相中，調(diào)節(jié)粒度，在一定溫度下進(jìn)行懸浮聚合。聚合反應(yīng)結(jié)束，用丙酮淋洗致孔劑。篩分出合適的粒度，得環(huán)氧型基球。環(huán)氧型基球的環(huán)氧值在330umol/g；孔徑70nm；強(qiáng)度測(cè)試時(shí)，濁度160；粒徑300um；含水量65％。將環(huán)氧型基球與丁二胺進(jìn)行反應(yīng)，得到胺基型載體。(2)胺基型載體的預(yù)處理；將胺基型載體放至層析柱中，用4倍載體床層體積的磷酸緩沖液從上往下淋洗；淋洗后，用真空抽去游離水；再把載體轉(zhuǎn)移至4倍載體床層體積的戊二醛溶液(濃度為3％)中，在30℃下攪拌16h；過(guò)濾，用4倍體積的磷酸緩沖液沖洗，抽干。(3)單寧酶酶液的固定化；將游離型的來(lái)源于黑曲霉的單寧酶酶液加入至磷酸緩沖溶液中溶解，再將步驟(2)中活化過(guò)的胺基型載體加至溶有單寧酶酶液的磷酸鹽緩沖液中，活化后的胺基型載體占溶解后的單寧酶酶液重量的0.1倍，在25℃下振蕩36h后過(guò)濾，用磷酸緩沖溶液進(jìn)行沖洗，得到固定化的單寧酶。所得到的固定化單寧酶的酶活力為85u/g。固定化單寧酶在催化單寧酸制備沒(méi)食子酸方面的應(yīng)用，具體步驟如下：(1)將固定化單寧酶裝至層析柱中，制得酶床層，酶床層高徑比在20/1；(2)配置濃度為6％(w/v)的單寧酸溶液作為底物，讓單寧酸溶液勻速流過(guò)步驟(1)制備的酶床層中，流速為0.8bv/h(bv為酶床層體積倍數(shù))，柱內(nèi)溫度控制在50℃，酶床層連續(xù)流過(guò)16.7bv的單寧酸溶液后，用去離子水10bv沖洗酶床層；沖洗后的酶床層繼續(xù)用于下一批次使用；(3)將步驟(2)中從酶床層流出的料液，去結(jié)晶精制得沒(méi)食子酸。清洗后的酶床層用于下一批催化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)例對(duì)實(shí)施例一～四所得的沒(méi)食子酸產(chǎn)品進(jìn)行性能測(cè)試純度、單寧酸殘留主要用hplc檢測(cè)；色級(jí)主要檢測(cè)方法為中國(guó)藥典的方法。對(duì)沒(méi)食子酸產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下表所示：純度％單寧酸殘留％色級(jí)實(shí)施例一99.40.322#實(shí)施例二99.30.382#實(shí)施例三99.40.272#實(shí)施例四99.20.492#使用批次的考察實(shí)驗(yàn)：模擬生產(chǎn)過(guò)程進(jìn)行小試反應(yīng)，讓單寧酸料液從裝有酶床層的柱床流過(guò)。流出產(chǎn)物，固定化酶留在柱床中，經(jīng)清水清洗后的固定化單寧酶酶床層繼續(xù)用于下一批的催化反應(yīng)中。從進(jìn)單寧酸料液至柱中，到全部放出反應(yīng)產(chǎn)物，為固定化單寧酶的一個(gè)使用批次。使用固定化酶進(jìn)行催化實(shí)驗(yàn)，初始流速快，隨著批次的增多，酶逐漸衰減，需要降低反應(yīng)流速確保產(chǎn)物的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中以反應(yīng)流速降至初始流速的一半時(shí)，視為酶的壽命終點(diǎn)。達(dá)到酶的壽命終點(diǎn)時(shí)，固定化單寧酶共使用批次的量，為固定化單寧酶的壽命或酶能使用的批次數(shù)。從實(shí)施例和附圖對(duì)比來(lái)看：本發(fā)明所得產(chǎn)品，使用批次多，穩(wěn)定性好，產(chǎn)品質(zhì)量好，顏色淺。從附圖1和圖2可知，本發(fā)明的固定化單寧酶酶催化時(shí)，能達(dá)300批以上，使用壽命長(zhǎng)；單寧酸殘留低，轉(zhuǎn)化率高，單寧酸轉(zhuǎn)化率高于98％。當(dāng)前第1頁(yè)12