本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種化學(xué)修飾ung酶及其修飾方法、在核酸擴(kuò)增中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

pcr是一種極靈敏的擴(kuò)增技術(shù)，易受污染的影響，小量的外源dna污染就可以與目的模板一起被擴(kuò)增，從而影響擴(kuò)增結(jié)果和判斷。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物由于誤操作(主要是以氣溶膠的形式)而進(jìn)入新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來源的污染，這稱之為殘余污染；從其他樣品中純化的dna或克隆的dna也會(huì)是污染源。

由于擴(kuò)增產(chǎn)物的量大且非常容易以氣溶膠的形式擴(kuò)散，即使實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分區(qū)，也難免因?yàn)檎`操作而受到污染。為保證pcr結(jié)果的準(zhǔn)確性，要預(yù)防非特異性pcr擴(kuò)增和污染。常用的措施是使用ung酶(uracil-n-glycosylase)(也稱為udg，uracil-dnaglycocasylase，以下簡(jiǎn)稱為ung酶)和taq酶熱啟動(dòng)。

ung酶是克隆有uracil-n-glycosylase基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，再經(jīng)三次過柱純化分離出來的重組蛋白。ung酶的作用原理是選擇性水解斷裂含有dump的雙鏈或單鏈dna中的尿嘧啶糖苷鍵，形成的有缺失堿基的dna鏈，在堿性介質(zhì)以及高溫下會(huì)進(jìn)一步水解斷裂，從而被消除。本發(fā)明所用的ung酶是thermusaquaticus在大腸桿菌中表達(dá)的，最佳活性溫度為50-65℃，95℃下10分鐘滅活。

ung酶防污染技術(shù)原理是在擴(kuò)增過程中以脫氧尿苷(dutp)代替脫氧胸苷(dttp)，或者以一定比例把dutp加入到dntp中，從而得到含有dump的擴(kuò)增產(chǎn)物。尿苷酶(ung)能特異地破壞含有dump的dna產(chǎn)物，使之不能作為擴(kuò)增模版，但對(duì)天然的不含dump的核酸不起作用。故只要在擴(kuò)增反應(yīng)前加入ung酶，就可以破壞過往擴(kuò)增反應(yīng)殘余的含有d-ump的dna，但對(duì)不含d-ump的目標(biāo)dna不起作用，從而使目標(biāo)dna得到擴(kuò)增。隨后將ung酶高溫滅活，再進(jìn)行擴(kuò)增。這樣就可以有效地防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物的殘余污染，避免假陽性的出現(xiàn)。

現(xiàn)有技術(shù)將ung酶運(yùn)用于pcr擴(kuò)增防污染，在pcr開始前增加30℃～37℃的保溫步驟，ung酶即可將反應(yīng)體系中已有的dump的dna污染物中的尿嘧啶堿基降解，并在隨后變性這一步驟的條件下dna鏈斷裂，消除由于污染dna產(chǎn)生的擴(kuò)增。這個(gè)處理對(duì)pcr有效，但是卻無法用于等溫或常溫?cái)U(kuò)增。由于ung酶在一定溫度范圍內(nèi)(30℃-90℃)均有活性，在pcr擴(kuò)增的時(shí)候，dutp摻入擴(kuò)增產(chǎn)物過程中，ung酶會(huì)切除該堿基，影響最終擴(kuò)增效率，因此在普通pcr開始之前，必須有一步熱處理使ung變性而失活。變性的溫度要求較高(95℃左右)，而等溫反應(yīng)的酶在這樣溫度下會(huì)失活。同時(shí)，pcr防污染體系在擴(kuò)增檢測(cè)之前，增加了檢測(cè)的時(shí)間，雖然高溫下，ung酶會(huì)變性失活，但是也有報(bào)道提示殘留的ung酶活性會(huì)干擾后續(xù)的擴(kuò)增檢測(cè)。

恒溫?cái)U(kuò)增的防污染的方法如美國(guó)專利(專利號(hào)us8945845b2)披露的需要開管加入ung酶，然后加入反應(yīng)試劑和ung酶抑制劑，需要開管兩次，增加了實(shí)驗(yàn)操作步驟和核酸泄漏風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種化學(xué)修飾ung酶、化學(xué)修飾方法以及化學(xué)修飾ung酶的應(yīng)用。這種化學(xué)修飾ung酶能在低于某一溫度下不表現(xiàn)酶活性，而在該溫度以上孵育一段時(shí)間后去修飾就可以恢復(fù)正?；钚?，從而實(shí)現(xiàn)活性可控。該化學(xué)修飾ung酶應(yīng)用于常溫或等溫?cái)U(kuò)增中，可建立核酸常溫或等溫?cái)U(kuò)增的防污染體系，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，有效清除殘余污染。

為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種化學(xué)修飾ung酶，所述化學(xué)修飾ung酶是用酸酐修飾的ung酶。

優(yōu)選的，所述用于化學(xué)修飾ung酶的酸酐是檸康酸酐、馬來酸酐或者馬來酸酐的衍生物。

優(yōu)選的，所述馬來酸酐的衍生物是其2’位、3’位具有官能取代物，或者2’3’位同時(shí)具有官能取代物，如2，3-二甲基馬來酸酐。

所述化學(xué)修飾ung酶的酸酐具有以下結(jié)構(gòu)式：

其中，r1、r2可以為h、ch3、ch3ch2，或f，cl。但r1、r2不限于這些基團(tuán)。

優(yōu)選的，所述化學(xué)修飾ung酶具有45℃-70℃的熱啟動(dòng)溫度。

檸康酸酐、馬來酸酐或其衍生物能與ung酶的賴氨酸中的氨基進(jìn)行反應(yīng)，使賴氨酸殘基的凈電荷發(fā)生改變，失去活性。通過控制修飾的條件，能保證ung酶在某一溫度或以下不表現(xiàn)酶活性，而在特定溫度下孵育一段時(shí)間后去修飾，ung酶即恢復(fù)正?；钚?。

本發(fā)明采用不同的酸酐及不同的酸酐量修飾ung酶，可以使ung酶在正常擴(kuò)增時(shí)(37℃-42℃)無活性，通過升溫處理(45℃-70℃)5-10min后，化學(xué)修飾ung酶有活性從而能降解擴(kuò)增產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供一種化學(xué)修飾ung酶的方法，所述方法包括以下步驟：ung酶預(yù)冷→化學(xué)修飾→修飾酶純化→收集純化酶。

具體的，所述化學(xué)修飾ung酶的方法包括以下步驟：

1)、ung酶預(yù)冷：將ung酶于冰上靜置；

2)、化學(xué)修飾：于冰上向ung酶中加入用于修飾的酸酐，再加入naoh并維持ph在7.5-9.0之間；

3)、修飾酶純化：將上步所得ung酶轉(zhuǎn)移至透析袋并加入tris-kac溶液后封口，放入4℃的tris(ph7.5-9.0)和kac溶液中透析；或?qū)⑸喜剿胾ng酶通過g-25分子篩純化；

4)、收集純化酶，將經(jīng)過透析或純化的酶收集，離心除去不溶沉淀，取上清分裝，即是以酸酐修飾的ung酶。

優(yōu)選的，所述用于修飾的酸酐是檸康酸酐、馬來酸酐或者馬來酸酐的衍生物。

優(yōu)選的，所述化學(xué)修飾ung酶具有45℃-70℃的熱啟動(dòng)溫度。

本發(fā)明還提供一種化學(xué)修飾ung酶的應(yīng)用，所述化學(xué)修飾ung酶用于核酸常溫?cái)U(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增中降解擴(kuò)增產(chǎn)物；所述化學(xué)修飾ung酶是由檸康酸酐、馬來酸酐或者馬來酸酐的衍生物修飾的ung酶；

本發(fā)明還提供一種ema防污染擴(kuò)增反應(yīng)體系，每10μl所述ema防污染擴(kuò)增反應(yīng)體系包括4mm巰基乙醇，50μmdntps，1mmatp，20nm真核dna擴(kuò)增環(huán)狀復(fù)合物，40nm增殖細(xì)胞核抗原，20nmpolδ復(fù)合酶，0.4μm真核dna復(fù)制蛋白a，20nmt4噬菌體紫外敏感蛋白1，20nmt4噬菌體紫外敏感蛋白2，200nm正反向引物，dna模板，200μmdutp，10ng/ul化學(xué)修飾ung酶。

常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(enzymes-mediated-amplification，ema)，以下簡(jiǎn)稱ema技術(shù)，是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)(參見專利cn104059905)，ema技術(shù)利用dna解旋酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、dna聚合酶及其他輔助因子，可達(dá)到在一定溫度范圍內(nèi)(30-42℃)、30分鐘內(nèi)使目的dna片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍。該方法操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增時(shí)間短、儀器要求低，非常適合用于疾病的快速診斷。

在現(xiàn)有技術(shù)中，ung酶無法應(yīng)用于常溫?cái)U(kuò)增體系的污染防控，因?yàn)槌財(cái)U(kuò)增沒有95℃變性和熱啟動(dòng)這一步驟，ung酶沒有經(jīng)熱處理而變性失活，會(huì)影響擴(kuò)增效果，使擴(kuò)增結(jié)果難以判定。本發(fā)明的經(jīng)化學(xué)修飾的ung酶能在某一溫度(如45℃或70℃)及以下不表現(xiàn)酶活性，而在特定溫度或以上孵育一段時(shí)間后去修飾就可以恢復(fù)正?；钚裕掖颂囟囟却蟠蟮陀?5℃，使本發(fā)明所述化學(xué)修飾ung酶可應(yīng)用于常溫或等溫?cái)U(kuò)增中，使核酸常溫或等溫?cái)U(kuò)增防污染擴(kuò)增體系，耗時(shí)更短，操作簡(jiǎn)單，清晰判定結(jié)果。

本發(fā)明選擇檸康酸酐、馬來酸酐及其衍生物對(duì)ung酶進(jìn)行化學(xué)修飾，檸康酸酐、馬來酸酐及其衍生物的化學(xué)構(gòu)象，保證了ung酶在被這些酸酐修飾之后，在升溫或者降低ph值的情況下，可以進(jìn)行脫酸酐的反應(yīng)，從而使因修飾而失活的ung酶恢復(fù)活性。而如果用其他的酸酐如醋酸酐修飾，則需要破壞性(高溫，強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性)的條件，才能脫去修飾。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還可以通過加入酸酐的量來調(diào)整ung酶的脫修飾溫度，從而實(shí)現(xiàn)ung酶活性的可控性。用不同量的酸酐進(jìn)行修飾，可以導(dǎo)致ung酶的賴氨酸中的ε-氨基修飾的比例不同，從而使脫修飾反應(yīng)條件不同。修飾程度低，則脫羧反應(yīng)需要的溫度低；修飾程度高，則脫羧反應(yīng)需要的溫度高。修飾ung酶所需要的酸酐的量不同，對(duì)反應(yīng)時(shí)所需要的溫度不同，如在0.5mg/ml的ung酶濃度下，加入10ul的酸酐，所得的酶可以在45℃溫度激活，而加入20ul的酸酐，則需要在70℃激活。這樣就實(shí)現(xiàn)了ung酶活性在溫度上的可控，使本發(fā)明所述的ung酶具有更廣泛的應(yīng)用性，不僅可以用于核酸常溫?cái)U(kuò)增，還可用于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如lamp、cpa、sta、rpa、near等。

本發(fā)明還提供一種化學(xué)修飾ung酶的方法，所述方法具體包括以下步驟：

1)、ung酶預(yù)冷：濃度為0.1-1.0mg/ml的1.0mlung酶于冰上靜置30分鐘；

2)、化學(xué)修飾：于冰上向ung酶加入1.0μl0.1-1.0m用于修飾的酸酐，加1.0μl0.1-1.0mnaoh并維持ph在7.5-9.0之間；檸康酸酐和naoh的加入總量在40μl；

3)、修飾酶純化：將上步所得ung酶轉(zhuǎn)移至透析袋并加入3mltris-kac溶液后封口，放入4℃500ml的30mmtris(7.5-9.0)，50mmkac溶液中透析2-3次；或?qū)⑸喜剿胾ng酶通過g-25分子篩純化；

4)、收集純化酶，將經(jīng)過透析或純化的酶收集，離心除去不溶沉淀，取上清分裝，即為酸酐修飾的ung酶。

所得到的化學(xué)修飾ung酶具有優(yōu)選45℃-70℃的熱啟動(dòng)溫度。

酸酐修飾ung酶的過程中對(duì)ph值的要求較高，在高ph條件下，有利于修飾作用，但是容易導(dǎo)致酶變性失活，而低ph值導(dǎo)致脫羧反應(yīng)，因此本發(fā)明中化學(xué)修飾的ph維持在7.5-9.0之間。

本發(fā)明中部分術(shù)語如：真核dna擴(kuò)增環(huán)狀復(fù)合物、增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen簡(jiǎn)稱pcna)、polδ復(fù)合酶、真核dna復(fù)制蛋白a(rpa，replicationproteina)、t4噬菌體紫外敏感蛋白1、t4噬菌體紫外敏感蛋白2，均參見中國(guó)專利cn104059905。

本發(fā)明的有益效果在于：

1)本發(fā)明用檸康酸酐、馬來酸酐或其衍生物修飾耐熱的ung酶，使其熱處理溫度大大降低，從而可以應(yīng)用于核酸常溫?cái)U(kuò)增中。

2)本發(fā)明可以通過加入酸酐的量的不同來控制ung酶活性以及反應(yīng)所需的溫度，從而實(shí)現(xiàn)ung酶在溫度上的可控性，這樣不僅可以應(yīng)用于30-42℃的核酸等溫?cái)U(kuò)增，也可以應(yīng)用于溫度更高比如60-65℃基于bstdna聚合酶的等溫?cái)U(kuò)增。

3)本發(fā)明可以在閉管的情況下，通過調(diào)整溫度達(dá)到程序性降解反應(yīng)產(chǎn)物。而本發(fā)明可以閉管調(diào)整溫度達(dá)到程序性降解反應(yīng)產(chǎn)物，減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟，節(jié)省成本，方便使用，加快了檢測(cè)效率。

4)本發(fā)明可以通用于其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如lamp，cpa，sta，rpa，near或其它等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)，延展性較好。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1的擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)圖。

圖2是實(shí)施例4的擴(kuò)增結(jié)果比較圖。

圖3是實(shí)施例4不同熱處理溫度下的處理結(jié)果比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明限定的范圍內(nèi)。

實(shí)施例1，一種檸康酸酐修飾的ung酶

用檸康酸酐化學(xué)修飾ung酶的步驟如下：

1)、ung酶預(yù)冷：1.0mlung酶(濃度為0.1-1.0mg/ml)于冰上靜置30分鐘；

2)、化學(xué)修飾：于冰上向ung酶中加入1.0μl0.1-1.0m檸康酸酐，加1.0μl0.1-1.0mnaoh并維持ph在7.5-9.0之間；檸康酸酐和naoh的加入總量不超過40ul；

3)、修飾酶純化：將上步所得ung酶轉(zhuǎn)移至透析袋并加入3.0ml配制好的tris-kac溶液后封口，放入4℃、500ml的30mmtris(ph7.5-9.0)、50mmkac溶液中透析2-3次；

4)、收集透析酶，離心除去不溶沉淀，取上清分裝備用，即得到檸康酸酐修飾的ung酶。

實(shí)施例2，一種馬來酸酐修飾的ung酶

用馬來酸酐修飾ung酶的步驟如下：

1)、ung酶預(yù)冷：1.0mlung酶(濃度為0.1-1.0mg/ml)于冰上靜置30分鐘；

2)、化學(xué)修飾：于冰上向ung酶中加入1.0μl0.1-1.0m馬來酸酐，加1.0μl0.1-1.0mnaoh并維持ph在7.5-9.0之間；馬來酸酐和naoh的加入總量不超過40ul；

3)、修飾酶純化：將ung酶轉(zhuǎn)移至透析袋并加入3.0ml配制好的tris-kac溶液后封口，放入4℃、500ml的30mmtris(ph7.5-9.0)，50mmkac溶液中透析2-3次；

4)、收集透析酶，離心除去不溶沉淀，取上清分裝備用，即得到馬來酸酐修飾的ung酶。

實(shí)施例3，將檸康酸酐修飾ung酶應(yīng)用于ema實(shí)驗(yàn)中

常溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(enzymes-mediated-amplification，ema)，簡(jiǎn)稱ema技術(shù)，是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)(參見專利cn104059905a)，ema技術(shù)利用dna解旋酶、單鏈dna結(jié)合蛋白、dna聚合酶及其他輔助因子，可達(dá)到在一定溫度范圍內(nèi)(30～42℃)、30分鐘內(nèi)使目的dna片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍。該方法操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增溫度低、擴(kuò)增時(shí)間短、儀器要求低、非常適合用于疾病的快速診斷。

本發(fā)明的化學(xué)修飾ung酶可用于核酸常溫?cái)U(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增中降解擴(kuò)增產(chǎn)物。

本實(shí)施例所用檸康酸酐修飾的ung酶是在0.5mg/ml的ung酶濃度下，加入20ul檸康酸酐所得的檸康酸酐修飾ung酶。制備步驟：

1)、ung酶預(yù)冷：1.0mlung酶(濃度為0.5mg/ml)于冰上靜置30分鐘；

2)、化學(xué)修飾：于冰上向ung酶中加入20μl的檸康酸酐，加1.0μlnaoh并維持ph在7.5-9.0之間；

3)、修飾酶純化：將上步所得ung酶轉(zhuǎn)移至透析袋并加入3.0ml配制好的tris-kac溶液后封口，放入4℃、500ml的30mmtris(ph7.5-9.0)、50mmkac溶液中透析3次；

4)、收集透析酶，離心除去不溶沉淀，取上清分裝備用，即得到檸康酸酐修飾ung酶。

ema反應(yīng)體系配制：

10μlema擴(kuò)增反應(yīng)體系包括4mm巰基乙醇，50μmdntps，1mmatp，20nm真核dna擴(kuò)增環(huán)狀復(fù)合物，40nm增殖細(xì)胞核抗原，20nmpolδ復(fù)合酶，0.4μm真核dna復(fù)制蛋白a，20nmt4噬菌體紫外、敏感蛋白1，20nmt4噬菌體紫外敏感蛋白2，200nm正反向引物，dna模板，200μmdutp，10ng/ul檸康酸酐修飾ung酶。

ema反應(yīng)程序：37℃擴(kuò)增45min，升溫至70℃處理5min。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)1：ema反應(yīng)體系與實(shí)施例3相同；ema反應(yīng)程序：37℃擴(kuò)增45min。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)2：ema反應(yīng)體系：10μlema擴(kuò)增反應(yīng)體系包括4mm巰基乙醇，50μmdntps，1mmatp，20nm真核dna擴(kuò)增環(huán)狀復(fù)合物，40nm增殖細(xì)胞核抗原，20nmpolδ復(fù)合酶，0.4μm真核dna復(fù)制蛋白a，20nmt4噬菌體紫外敏感蛋白1，20nmt4噬菌體紫外敏感蛋白2，200nm正反向引物，dna模板，200μmdutp。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)2的ema反應(yīng)程序與實(shí)施例3相同：37℃擴(kuò)增45min，升溫至70℃處理5min。

結(jié)果：實(shí)施例3與對(duì)比實(shí)驗(yàn)1、2的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，可見實(shí)施例3的經(jīng)37℃擴(kuò)增45min后升溫至70℃處理5min的擴(kuò)增產(chǎn)物被完全降解，而對(duì)比實(shí)驗(yàn)1沒有70℃升溫處理的擴(kuò)增效率跟對(duì)比實(shí)驗(yàn)2不加修飾ung酶的效率基本一樣，均可見擴(kuò)增產(chǎn)物，表明升溫至70℃后檸康酸酐修飾ung酶發(fā)揮降解作用，將擴(kuò)增產(chǎn)物全部降解。這樣處理后，在常溫?cái)U(kuò)增結(jié)束時(shí)就很方便自然地降解了污染物，不需要再采用特別的程序和步驟去消除污染，能夠有效簡(jiǎn)單地防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

實(shí)施例4，檸康酸酐不同修飾條件導(dǎo)致不同溫度激活修飾后的ung酶

本發(fā)明還可以通過加入酸酐的量來調(diào)整ung酶的脫修飾溫度，從而實(shí)現(xiàn)ung酶活性的可控性。

ema反應(yīng)體系配制：

10μlema擴(kuò)增反應(yīng)體系包括4mm巰基乙醇，50μmdntps，1mmatp，20nm真核dna擴(kuò)增環(huán)狀復(fù)合物，40nm增殖細(xì)胞核抗原，20nmpolδ復(fù)合酶，0.4μm真核dna復(fù)制蛋白a，20nmt4噬菌體紫外、敏感蛋白1，20nmt4噬菌體紫外、敏感蛋白2，200nm正反向引物，dna模板，200μmdutp，10ng/ul檸康酸酐修飾的ung酶。

a為在0.5mg/ml的ung酶濃度下，加入10ul的檸康酸酐：按照前述檸康酸酐化學(xué)修飾ung酶的方法和步驟操作，所得的檸康酸酐修飾ung酶加入ema反應(yīng)體系進(jìn)行ema擴(kuò)增。a-1ema反應(yīng)程序：37℃(或42℃)擴(kuò)增45min(或30min)。a-2ema反應(yīng)程序：37℃(或42℃)擴(kuò)增45min(或30min)，升溫至45℃處理5min。

b是在0.5mg/ml的ung酶濃度下，加入20ul的檸康酸酐：按照前述檸康酸酐化學(xué)修飾ung酶的方法和步驟操作，所得的檸康酸酐修飾ung酶加入ema反應(yīng)體系進(jìn)行ema擴(kuò)增。b-1ema反應(yīng)程序：37℃(或42℃)擴(kuò)增45min(或30min)。b-2ema反應(yīng)程序：37℃(或42℃)擴(kuò)增45min(或30min)，升溫至70℃處理5min。

結(jié)果判定：擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，可見a-1體系未經(jīng)45℃升溫處理，其擴(kuò)增產(chǎn)物仍保留，a-2體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物在經(jīng)45℃處理后完全降解；b-1體系未經(jīng)70℃升溫處理，其擴(kuò)增產(chǎn)物仍保留，b-2體系中的擴(kuò)增產(chǎn)物在70℃處理后完全降解。說明加入不同量的檸康酸酐所得到的檸康酸酐修飾ung酶的熱處理溫度要求不同，表明通過控制修飾條件，可以達(dá)到控制ung酶熱啟動(dòng)的溫度。

修飾充分的ung酶在反應(yīng)后，呈現(xiàn)出溫度依賴的修飾活性，其在不同溫度處理后的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3所示，從1～6(未處理、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)都可見擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，在升溫70℃、5分鐘(第7)后，產(chǎn)物降解至電泳檢測(cè)不出的水平。這也體現(xiàn)了可通過溫度控制本發(fā)明參與的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明用檸康酸酐、馬來酸酐或其衍生物修飾ung酶，使其熱處理溫度大大降低，從而可以應(yīng)用于核酸常溫?cái)U(kuò)增中。本發(fā)明可通過控制修飾的條件，保證得到的化學(xué)修飾ung酶在某一溫度或以下不表現(xiàn)酶活性，而在特定溫度下孵育一段時(shí)間后去修飾，使得ung酶恢復(fù)正?；钚?。

本發(fā)明的用酸酐修飾ung酶的方法，簡(jiǎn)單便于操作，得到的化學(xué)修飾ung酶，活性可控。用于ema擴(kuò)增中，可使整個(gè)ema防污染擴(kuò)增體系耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，可以清晰判斷結(jié)果。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。