本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ascpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

基因編輯是在基因組水平上進行精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點刪除突變、基因定點插入突變、多位點同時突變和小片段的刪失等?；蚓庉嫾夹g(shù)可用于基因功能及疾病發(fā)病機理研究、構(gòu)建疾病動物模型、生物治療、遺傳和腫瘤相關(guān)疾病研究、整合病毒疾病研究和改良農(nóng)畜牧物種。crispr-cas9是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶(zfn)”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(talen)”之后出現(xiàn)的第三代基因組定點編輯技術(shù)。

ascpf1(acidaminococcμssp.cpf1)是一種rna介導(dǎo)的v型crispr-cas9系統(tǒng)內(nèi)切酶，在單鏈crrna(crisprrna)存在的情況下，ascpf1識別雙鏈dna的5’-tttn-3’pam(protospaceradjacentmotif)，并在雙鏈dna的與crrna互補鏈的第18個堿基和非互補鏈的第23個堿基處對dna進行切割。與crispr-cas9基因編輯系統(tǒng)相比，crispr-ascpf1系統(tǒng)具有不需要tracrrna(trans-activatingcrrna)、切割靶向dna效率高、切割產(chǎn)生粘性末端等特點，是潛在的、可用于真核生物基因組編輯的工具。

pd-1(programmeddeath1)，程序性死亡受體，是一種重要的免疫抑制分子，為cd28超家族成員，最初是從凋亡的小鼠t細胞雜交瘤2b4.11克隆出來。作為癌癥免疫治療的重要靶點，以基因編輯t細胞的pd-1基因為靶點的免疫調(diào)節(jié)對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種ascpf1突變體蛋白，可用于編輯t細胞的pd-1基因。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的ascpf1突變體蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

本發(fā)明的目的之二是提供一種重組ascpf1基因突變體，對ascpf1基因進行結(jié)構(gòu)改造，可用于編碼上述ascpf1突變體蛋白。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種重組ascpf1基因突變體ascpf1(s589q/p711t)，其核苷酸序列如seqidno：2所示。ascpf1(s589q/p711t)是對ascpf1基因進行密碼子優(yōu)化，并將野生型ascpf1中的兩個氨基酸位點(s598q和p711t)突變得到。

本發(fā)明的目的之三是提供一種含重組ascpf1基因突變體的重組表達載體。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的重組表達載體pet15b-ascpf1(s589q/p711t)，是以seqidno：2所示的ascpf1(s589q/p711t)為模板設(shè)計引物進行pcr擴增，再將純化的pcr產(chǎn)物用無縫克隆方法插入pet15b載體的多克隆位點ncoi和xhoi之間得到。

本發(fā)明的目的之四是提供ascpf1突變體蛋白的制備方法，得到高純度的ascpf1突變體蛋白。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的ascpf1突變體蛋白的制備方法，包括如下步驟：

①編碼ascpf1突變體蛋白原核表達載體的構(gòu)建：以合成的ascpf1(s589q/p711t)基因組dna為模板，用pcr的方法擴增ascpf1(s589q/p711t)編碼序列，將得到的pcr產(chǎn)物進行純化，用無縫克隆方法插入pet15b載體的多克隆位點ncoi和xhoi之間，得到重組表達載體，經(jīng)測序驗證閱讀框及dna序列全部正確，即成功構(gòu)建了含重組ascpf1基因突變體的原核表達載體，命名為pet15b-ascpf1(s589q/p711t)；

②ascpf1突變體蛋白的表達：將原核表達載體pet15b-ascpf(s589q/p711t)轉(zhuǎn)入表達宿主菌escherichiacolibl21(de3)，挑取單克隆接種至新鮮的含50mg/l氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基，經(jīng)37℃搖床培養(yǎng)至od600為0.6，加入終濃度為0.6mm的iptg誘導(dǎo)ascpf1(s589q/p711t)的表達；

③ascpf1突變體蛋白的純化：收集一升發(fā)酵液的細胞，并用40ml冰浴的buffera重懸，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過ni-ida柱；上樣完畢用50mlbuffere洗滌ni-ida柱；50mlbufferg洗脫ni-ida柱，分管收集；將洗脫到的目的蛋白過cm離子柱；100mlbufferd洗滌cm離子柱；10mlbufferb洗脫cm離子柱，分管收集；使用專業(yè)分析軟件grab-it2.5分析tat-as-cpf1蛋白純度；洗脫的ascpf1(s589q/p711t)合并后將蛋白透析至20mmtris，50mmnaclph7.5，20％glycerol中；其中，buffera的組成為：20mmtris-hcl，50mmnacl，1％triton-100，20％glycerolph7.5；buffere的組成為：20mmtris-hclph7.5，2mnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol；bufferg的組成為：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，500mm咪唑，20％glycerol；bufferd的組成為：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol；bufferb的組成為：20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol。

本發(fā)明通過載體構(gòu)建將密碼子優(yōu)化的ascpf1(s589q/p711t)基因克隆到pet15b載體中，在低溫條件下ascpf1(s589q/p711t)在大腸桿菌中蛋白表達量可以達到18％，可溶性達到95％。

本發(fā)明的目的之五是提供ascpf1突變體蛋白、重組ascpf1基因突變體和重組表達載體在基因編輯原代t細胞pd-1方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的之六是提供ascpf1突變體蛋白編輯原代t細胞pd-1的方法，能更有效、便捷地編輯原代t細胞pd-1的基因。

具體包括以下步驟：

(1)原代t細胞pd-1基因部分序列擴增

以提取的原代t細胞pd-1基因組dna為模板，pcr擴增并回收擴增片段，pcr擴增所用正向引物為：5’-actccccagacaggccctg-3’(seqidno：6)，反向引物為：5’-caggggctggccggtgcg-3’(seqidno：7)；pcr反應(yīng)體系為：基因組dna模板100ng，20μm正向引物1μl，20μm反向引物1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至總體積50μl；pcr反應(yīng)條件為：94℃熱變性5分鐘，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)；

(2)ascpf1突變體蛋白體外切割pd-1

取1μg步驟(1)回收的pd-1產(chǎn)物、1μl純化的ascpf1突變體蛋白、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbuffer，配制成20μl體外切割反應(yīng)體系，37℃水浴30min后，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測切割；其中10*reactionbμffer的組成為：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃；

(3)westernblotting檢測ascpf1突變體蛋白處理原代t細胞后，pd-1表達水平變化

取1×10⁶個原代t細胞pd-1，加入20μg純化的ascpf1突變體蛋白，10μg合成的crrna混勻冰浴，電轉(zhuǎn)化儀點擊轉(zhuǎn)化后鋪6孔板，72h后提取蛋白，westernblotting檢測pd-1蛋白表達水平變化。

本發(fā)明純化得到的ascpf1突變體蛋白切割效率高，切割不需要復(fù)雜的tracrrna，操作方便，節(jié)約成本；發(fā)現(xiàn)了兩個新的pd-1基因編輯位點；利用ascpf1突變體蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)原代t細胞pd-1的敲降，為基因編輯t細胞pd-1基因及癌癥免疫治療打下基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是重組表達載體pet15b-ascpf1(s589q/p711t)的質(zhì)粒圖譜；

圖2是重組ascpf1(s589q/p711t)蛋白表達的sds-page分析：泳道m(xù)為蛋白marker(kd)，泳道1為iptg誘導(dǎo)前，泳道2和3為iptg誘導(dǎo)后ascpf1(s589q/p711t)的全菌蛋白表達；

圖3是ni-ida柱純化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析：泳道1：超聲上清；泳道2：流出；泳道3：50mm咪唑洗脫；泳道4：500mm咪唑洗脫1；泳道5：500mm咪唑洗脫2；泳道6：殘留；泳道m(xù)為蛋白marker(kd)；

圖4是cm柱純化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析：泳道1：ni-ida純化ascpf1(s589q/p711t)；泳道2：cm流出；泳道3：cm洗脫1；泳道4：cm洗脫2；泳道5：cm洗脫3；泳道6：殘留；泳道m(xù)為蛋白marker(kd)；

圖5是純化的ascpf1(s589q/p711t)與野生型ascpf1(wt)體外切割活性對比(體外切割貪銅菌copr基因片段)：

泳道m(xù)：dl2000；泳道1：copr+ascpf1(wt)；泳道2：copr+crrna；泳道3：copr+ascpf1(wt)+crrna；泳道4：copr+ascpf1(s589q)+crrna；泳道5：copr+ascpf1(p117t)+crrna；泳道6：copr+ascpf1(s589q/p711t)+crrna；

圖6是純化的ascpf1(s589q/p711t)體外切割pd-1：泳道m(xù)為dnamarker(dl2000)；泳道1：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)；泳道2：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna1；泳道3：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna2；泳道4：pd-1+ascpf1(s589q/p711t)+crrna3；

圖7是ascpf1(s589q/p711t)處理原代t細胞后，westernblotting檢測pd-1表達水平：

泳道1：con組1(原代t細胞不經(jīng)任何處理)；泳道2：con組2(原代t細胞+電擊處理)；泳道3：con組3(原代t細胞+ascpf1(s589q/p711t)+電擊處理)；泳道4：crrna1(原代t細胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna1+電擊處理)；泳道5：crrna2(原代t細胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna2+電擊處理)；泳道6：crrna3(原代t細胞+ascpf1(s589q/p711t)+crrna3+電擊處理)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖及具體實施例對發(fā)明作進一步詳細描述。

下述實例中所用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1：ascpf1的優(yōu)化設(shè)計和合成

首先對野生型ascpf1的序列進行以下優(yōu)化：

5’端加上穿膜肽tat編碼序列，編碼序列為tacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgt(seqidno：3)。

3’端加上核定位序列(nls)，編碼序列為：aaaaggccggcggccacgaaaaaggccggccaggcaaaaaagaaaaagggatcc(seqidno：4)。

3’端加上6*his標(biāo)簽序列，編碼序列為：catcatcatcatcatcac(seqidno：5)。

再將野生型ascpf1中的兩個氨基酸位點突變：s598q和p711t。

密碼子優(yōu)化后ascpf1基因進行全基因合成，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，命名為ascpf1(s589q/p711t)。合成的ascpf1(s589q/p711t)的核苷酸序列如seqidno：2所示。

實施例2：原核表達載體pet15b-ascpf1(s589q/p711t)的構(gòu)建

以合成的ascpf1(s589q/p711t)基因組dna為模板，用pcr的方法擴增ascpf1(s589q/p711t)編碼序列，設(shè)計的正向引物為：

5’-gtttaactttaagaaggagatataccatgtacggtcgtaaaaaacgtcgtcagcgtcgtcgtacacagttcgagggctttac-3’(seqidno：6)

反向引物為：

5’-tcgggctttgttagcagccggatcctcgagttagtgatgatgatgatgatgg-3’(seqidno：7)

pcr反應(yīng)體系為：合成的ascpf1(s589q/p711t)模板50ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至總體積50μl；

pcr擴增條件為：94℃熱變性5分鐘，60℃退火30秒，72℃延伸5分鐘，共進行30個循環(huán)。

將得到的pcr產(chǎn)物進行純化，用無縫克隆方法插入pet15b載體(購自novagen公司)的多克隆位點ncoi和xhoi之間，得到重組表達載體。對重組表達載體進行dna測序，分析其閱讀框和編碼序列的正確性。

將密碼子優(yōu)化的ascpf1(s589q/p711t)基因克隆至pet15b載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證，閱讀框及dna序列全部正確，即成功構(gòu)建了含重組ascpf1基因突變體的原核表達載體，命名為pet15b-ascpf1(s589q/p711t)，其簡圖參見圖1。

實施例3：ascpf1突變體蛋白的表達及純化

(1)ascpf1突變體蛋白的表達

分別將原核表達載體pet15b-ascpf(s589q/p711t)和對照載體pet15b轉(zhuǎn)入表達宿主菌escherichiacolibl21(de3)(購自newenglandbiolabs公司)，挑取單克隆接種至新鮮的lb培養(yǎng)基(含50mg/l氨芐青霉素)。待細菌長至od600為0.6左右，分別加入終濃度為0.6mm的iptg(異丙基-β-d-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)ascpf1(s589q/p711t)的表達。誘導(dǎo)兩個小時后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品經(jīng)13％sds-page電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)uvpwhite/ultraviolettransilluminator(購自美國upland公司)對考馬斯亮藍染色的凝膠進行掃描記錄，采用專業(yè)分析軟件grab-it2.5和gelwork分析目的蛋白占菌體總蛋白的比例。

本申請中，可溶性定義為：可溶性的目的蛋白/總的目的蛋白×100％。在iptg誘導(dǎo)后，出現(xiàn)了一條約為155kd的蛋白條帶，和理論分子量大小吻合，經(jīng)凝膠掃描灰度分析，ascpf1(s589q/p711t)蛋白約占菌體總蛋白的18％(圖2)，可溶性達到95％。

(2)ascpf1突變體蛋白的純化

收集一升發(fā)酵液的細胞，并用40ml冰浴的buffera(20mmtris-hcl，50mmnacl，1％triton-100，20％glycerolph7.5)重懸，冰浴超聲裂解細胞，離心取上清，上清通過ni-ida柱；上樣完畢用50mlbuffere(20mmtris-hclph7.5，2mnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗滌ni-ida柱；50mlbufferg(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，500mm咪唑，20％glycerol)洗脫ni-ida柱，分管收集；將洗脫到的目的蛋白過cm離子柱；100mlbufferd(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗滌cm離子柱；10mlbufferb(20mmtris-hclph7.5，50mmnacl，0.1％tritonx-100，20％glycerol)洗脫cm離子柱，分管收集。使用專業(yè)分析軟件grab-it2.5分析tat-as-cpf1蛋白純度為90％。洗脫的ascpf1(s589q/p711t)合并后將蛋白透析至20mmtris，50mmnaclph7.5，20％glycerol中。

ni-ida柱純化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析如圖3所示；cm柱純化后的ascpf1(s589q/p711t)的sds-page(13％)分析如圖4所示。

實施例4：純化的ascpf1突變體蛋白與野生型ascpf1(wt)切割活性對比

(1)copr基因序列擴增

采用常規(guī)方法從天然瀝青中提取貪銅菌，并以提取的貪銅菌基因組dna為模板，pcr擴增并回收copr基因片段，pcr擴增所用正向引物為：

5’-atgaaattgctggtagtcgaaga-3’(seqidno：8)，反向引物為：5’-tcagtcgccttcctccggat-3’(seqidno：9)。pcr擴增體系為：基因組dna模板100ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至總體積50μl；pcr反應(yīng)條件為：94℃熱變性10分鐘，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行35個循環(huán)。pcr擴增產(chǎn)物回收，用于ascpf1(s589q/p711t)和野生型ascpf1(wt)體外切割實驗。

(2)切割活性對比

取1μg回收的copr產(chǎn)物、1μl純化的ascpf1突變體蛋白或者ascpf1(wt)、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbuffer，配制成20μl體外切割反應(yīng)體系，37℃水浴30min后，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測切割；其中10*reactionbuffer的組成為：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃。

其中crrna委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，其序列為：

5’-cgcgggccagcagttcggcaaaggatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc-3’(seqidno：10)

體外切割實驗結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明ascpf1突變體蛋白相較于野生型ascpf1(wt)，切割活性明顯提高。

實施例5：ascpf1突變體蛋白編輯原代t細胞pd-1

(1)pd-1基因部分序列擴增

采用常規(guī)方法從人外周血中分離原代t細胞，并以提取的原代t細胞基因組dna為模板，pcr擴增并回收擴增片段，pcr擴增所用正向引物為：5’-actccccagacaggccctg-3’(seqidno：11)，反向引物為：5’-caggggctggccggtgcg-3’(seqidno：12)。pcr擴增體系：基因組dna模板100ng，正向引物(20μm)1μl，反向引物(20μm)1μl，2xultrapfumix25μl，加ddh2o至總體積50μl；pcr反應(yīng)條件為：94℃熱變性5分鐘，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共進行30個循環(huán)。pcr擴增產(chǎn)物回收，用于ascpf1(s589q/p711t)體外切割實驗。

(2)ascpf1(s589q/p711t)體外切割pd-1

取1μg回收的pd-1產(chǎn)物、1μl純化的ascpf1(s589q/p711t)、1μg合成的crrna、2μl10*reactionbμffer，配制成20μl體外切割反應(yīng)體系，37℃水浴30min后，2％瓊脂糖凝膠電泳檢測切割。其中10*reactionbμffer的組成為：500mmkac、200mmtris-醋酸、100mmmg(ac)2、1mg/mlbsaph7.9@25℃。

根據(jù)pd-1基因序列設(shè)計了3條靶向不同位點的crrna，委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成：

crrna1：aauuucuacucuuguagaugcacgaagcucuccgauguguugg(seqidno：13)；

crrna2：aauuucuacucuuguagauaucugcgccuugggggccagggag(seqidno：14)；

crrna3：aauuucuacucuuguagaugaacuggccggcuggccuggguga(seqidno：15)；

使用純化的ascpf1突變體蛋白對pd-1進行體外切割實驗，實驗結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明3條crrna均可介導(dǎo)ascpf1(s589q/p711t)對pd-1進行切割，說明ascpf1(s589q/p711t)識別并切割pd-1效率高。

(3)westernblotting檢測ascpf1突變體蛋白處理原代t細胞后，pd-1表達水平變化

取1×10⁶個原代t細胞pd-1，加入20μg純化的ascpf1突變體蛋白，10μg合成的crrna混勻冰浴，電轉(zhuǎn)化儀(bio-radmicropilser^tm)點擊轉(zhuǎn)化后鋪6孔板，72h后提取蛋白westernblotting檢測pd-1蛋白表達水平變化。

用設(shè)計合成的3條crrna分別對原代t細胞進行處理，westernblotting檢測結(jié)果如圖7所示，crrna2和crrna3處理原代t細胞后，pd-1蛋白表達水平明顯降低，表明ascpf1突變體蛋白及設(shè)計的兩條針對pd-1基因的靶向crrna能有效敲降原代t細胞pd-1的表達。

<110>江蘇溥博生物科技有限公司

<120>一種ascpf1突變體蛋白、編碼基因、重組表達載體及其制備方法與應(yīng)用

<160>15

<210>1

<211>1342

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

mettyrglyarglyslysargargglnargargargthrglnpheglu

151015

glyphethrasnleutyrglnvalserlysthrleuargphegluleu

202530

ileproglnglylysthrleulyshisileglngluglnglypheile

354045

glugluasplysalaargasnasphistyrlysgluleulysproile

505560

ileaspargiletyrlysthrtyralaaspglncysleuglnleuval

65707580

glnleuasptrpgluasnleuseralaalaileaspsertyrarglys

859095

glulysthrglugluthrargasnalaleuileglugluglnalathr

100105110

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115120125

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130135140

lysalagluleupheasnglylysvalleulysglnleuglythrval

145150155160

thrthrthrgluhisgluasnalaleuleuargserpheasplysphe

165170175

thrthrtyrpheserglyphetyrgluasnarglysasnvalpheser

180185190

alagluaspileserthralaileprohisargilevalglnaspasn

195200205

pheprolysphelysgluasncyshisilephethrargleuilethr

210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

asngluvalleuasnleualaileglnlysasnaspgluthralahis

290295300

ileilealaserleuprohisargpheileproleuphelysglnile

305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

glnleuaspserleuleuglyleutyrhisleuleuasptrppheala

485490495

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