本發(fā)明涉及生物學(xué)和腫瘤學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種肺癌細(xì)胞系及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前，肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，而非小細(xì)胞肺癌(nsclc)占所有肺癌的約85％。根據(jù)中國的癌癥數(shù)據(jù)預(yù)測，在2015年將會有73.33萬新發(fā)肺癌病例，會有61.02萬人死于肺癌，因此，肺癌已經(jīng)成為威脅群眾健康的重要因素。

肺癌的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，癥狀和體征的有無、輕重以及出現(xiàn)的早晚，取決于腫瘤發(fā)生部位、病理類型、有無轉(zhuǎn)移及有無并發(fā)癥，以及患者的反應(yīng)程度和耐受性的差異。肺癌早期癥狀常較輕微，甚至可無任何不適。中央型肺癌癥狀出現(xiàn)早且重，周圍型肺癌癥狀出現(xiàn)晚且較輕，甚至無癥狀，常在體檢時(shí)被發(fā)現(xiàn)。早期非小細(xì)胞肺癌(i、ii期)主要經(jīng)手術(shù)，約25％的手術(shù)病例接受化療和/或放射治療，大多數(shù)iii期和iv期的nsclc患者一般會接受化療、放射治療。目前，早期肺癌的5年生存率可達(dá)到55％，但晚期肺癌的5年生存率卻只有4％。由于早期肺癌并未出現(xiàn)臨床癥狀，大多數(shù)肺癌(57％)確診時(shí)已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

隨著一些關(guān)于肺癌分子生物學(xué)研究的開展，一些癌基因和抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，這些發(fā)現(xiàn)從根本上改變了非小細(xì)胞肺癌患者的治療方案。因此，靶向治療藥物，如血管生成抑制劑，表皮生長因子受體(egfr)抑制劑和間變性淋巴瘤激酶(alk)抑制劑也成為了nsclc治療的重要部分。此外，免疫治療通過靶向程序性細(xì)胞死亡作用的藥物受體在t細(xì)胞上已被批準(zhǔn)用于治療某些類型的nsclc。

為深入了解非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)理及靶向治療和化療的抗癌藥物研究，必須建立合適的研究模型。然而，目前已經(jīng)建立的nsclc患者細(xì)胞系大多都來源于西方國家，但一些流行病學(xué)、分子研究和臨床表現(xiàn)發(fā)現(xiàn)黃種人和白種人在非小細(xì)胞肺癌的各個(gè)方面存在相當(dāng)大的差異，包括不吸煙的女性比例，egfr突變情況與酪氨酸激酶抑制劑(tki)藥物臨床反應(yīng)等。而且，隨著腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的治療理念的深入臨床實(shí)踐，提供更多的肺癌細(xì)胞株有助于靶向藥物的研發(fā)和應(yīng)用。建立中國人來源的肺癌細(xì)胞株，為肺癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的模型，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對目前國內(nèi)缺乏中國人來源的肺癌細(xì)胞株，而提供了一種來源于中國人的肺癌細(xì)胞系。

本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001從一例肺癌患者(患者為44歲中國女性，腫瘤位于右肺中、下葉，胸腔鏡胸壁內(nèi)膜活檢病理提示(右側(cè)壁胸膜)腺癌，臨床分期4期。)的胸水，離心后取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)原代培養(yǎng)并建系成功后，命名為人肺癌細(xì)胞系zlc-001，于2017年5月31日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：cctccno：c201754。

本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞在倒置光學(xué)相差顯微鏡下觀察呈扁平不規(guī)則多角形，細(xì)胞體積大，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，貼壁生長，符合腺上皮樣細(xì)胞的特點(diǎn)。貼壁后生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴(kuò)增性。染色體數(shù)目大多分布在60～69之間，眾數(shù)為61，符合惡性腫瘤的特征。

本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001的str測序結(jié)果與atcc、dsmz等細(xì)胞保存庫的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同str檢測結(jié)果，證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞呈ck7陽性，ck5/6陰性，nse陰性，p63陰性，ttf1陰性和vimentin陽性。

克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞的克隆形成率與接種密度有關(guān)，接種密度為4500個(gè)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞克隆形成能力較強(qiáng)。

裸鼠(裸小鼠)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人肺癌細(xì)胞系zlc-001具有較強(qiáng)的成瘤性。

本發(fā)明又提供了所述的肺癌細(xì)胞系的子代細(xì)胞。所述子代細(xì)胞基本或全部保留了親代細(xì)胞的特性。

本發(fā)明又提供了所述的肺癌細(xì)胞系在作為肺癌發(fā)生機(jī)理研究的細(xì)胞模型中的應(yīng)用。由于本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001是從中國人來源建立的，且建系時(shí)間較短，性狀穩(wěn)定，以該肺癌細(xì)胞系作為研究模型，對于了解中國人的原發(fā)性肺癌發(fā)生機(jī)理有很大幫助。

本發(fā)明還提供了所述的肺癌細(xì)胞系在建立哺乳動物肺癌模型中的應(yīng)用。所述的哺乳動物為裸小鼠或裸大鼠。通過將一定細(xì)胞數(shù)量的所述人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞接種于裸小鼠或裸大鼠的皮下、肝臟、腹腔或者尾靜脈等部位，獲得肺癌的動物模型。

本發(fā)明還提供了所述的肺癌細(xì)胞系在提取肺癌特異性腫瘤標(biāo)志物中的應(yīng)用。通過與正常的肺細(xì)胞及其他種類的癌癥細(xì)胞進(jìn)行比較研究，可以發(fā)現(xiàn)肺癌的分子標(biāo)記，針對該分子標(biāo)記可以進(jìn)行后續(xù)的疾病檢測及藥物開發(fā)等方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的肺癌細(xì)胞系在篩選或評估治療肺癌藥物中的應(yīng)用。首先，通過向所述人肺癌細(xì)胞系zlc-001培養(yǎng)基中添加不同藥物，觀察細(xì)胞狀態(tài)變化，獲得初步有效的候選藥物。然后，將候選藥物施藥于上述肺癌的動物模型，觀察與未施藥組動物的存活期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況等，篩選獲得潛在治療肺癌的藥物。

本發(fā)明還提供了所述的肺癌細(xì)胞系在開發(fā)肺癌檢測試劑盒中的應(yīng)用。發(fā)現(xiàn)肺癌特異性的腫瘤標(biāo)志物后，可根據(jù)該腫瘤標(biāo)志物開發(fā)出檢測肺癌發(fā)生或發(fā)展情況的檢測試劑盒。

本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001來自于一例中國的肺癌患者胸水，str檢測結(jié)果證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染，克隆形成與成瘤性強(qiáng)，可以作為肺癌研究及肺癌檢測試劑盒開發(fā)、藥物篩選等方面應(yīng)用的理想細(xì)胞系。

附圖說明

圖1為本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞的形態(tài)檢測圖；

圖2為本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001的細(xì)胞生長曲線圖；

圖3為本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞的染色體核型分布圖；

圖4為str分析結(jié)果圖，其中，圖a～f分別是不同等位基因的結(jié)果圖；

圖5為人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞免疫組織化學(xué)分析結(jié)果圖，其中，圖a～f分別為ck7、ck5/6、nse、p63、ttf1、vimentin；

圖6為本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，其中，圖a、b和c接種細(xì)胞數(shù)分別為500、1500和4500個(gè)；

圖7為裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

從一例肺癌患者(患者為44歲中國女性，腫瘤位于右肺中、下葉，胸腔鏡胸壁內(nèi)膜活檢病理提示(右側(cè)壁胸膜)腺癌，臨床分期4期。)的胸水。將胸水低速離心，1000rpm，5分鐘。棄去上清，加入適量pbs緩沖液，反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞，使其重懸，再次離心，1000rpm，5分鐘。棄去上清，加入10ml的含10％fbs(gibco公司)，1％雙抗，1％非必需氨基酸(gibco公司)，dmem/f12細(xì)胞培養(yǎng)基(gibco公司)的原代細(xì)胞培養(yǎng)基，輕柔吹打混勻，將懸液轉(zhuǎn)移至10cm培養(yǎng)皿中，放入5％co2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，5～7天后更換新鮮培養(yǎng)基。傳代過程中，利用成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的消化能力存在差異，不斷去除成纖維細(xì)胞，直至培養(yǎng)皿中已無法到肉眼可見的成纖維細(xì)胞，并能持續(xù)傳代生長。建系成功后，命名為人肺癌細(xì)胞系zlc-001，于2017年5月31日保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為：cctccno：c201754。

實(shí)施例2

取傳代培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下(日本olympusimt-2倒置顯微鏡)觀察活細(xì)胞生長情況。如圖1所示，細(xì)胞光學(xué)形態(tài)圖片，可見細(xì)胞生長旺盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，細(xì)胞體積大，核大，胞漿豐富，細(xì)胞間連接緊密，貼壁生長，符合腺上皮樣細(xì)胞的特點(diǎn)。

實(shí)施例3

cellcountingkit簡稱cck試劑盒，為mtt法的替代方法，是一種基于wst(水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑單鈉鹽)的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

取生長狀態(tài)良好的人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。在96孔板中接種細(xì)胞懸液(100μl/孔)。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5％co2的條件下)。分別在6小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)進(jìn)行檢測。檢測時(shí)向每孔加入5μl的cck溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。如圖2所示，本發(fā)明人肺癌細(xì)胞系zlc-001貼壁后生長較快，具有良好的體外培養(yǎng)擴(kuò)增性。

實(shí)施例4

取人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，種植在六孔板中，培養(yǎng)48小時(shí)后，用0.01mg/ml的秋水仙素處理16h，當(dāng)鏡檢觀察到m期細(xì)胞比例為50％以上時(shí)，收集m期細(xì)胞。使用kcl低滲液低滲處理m期細(xì)胞15～20min，用甲醇/冰醋酸(體積比3∶1)作為固定液在室溫下固定細(xì)胞，玻片上制片。將玻片置于0.02％胰酶溶液中消化30～60s，經(jīng)pbs漂洗，giemsa染色，晾干，完成制片。于顯微鏡下觀察，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中染色體數(shù)目，隨機(jī)選取20個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)算。如圖3所示，染色體數(shù)目大多分布在60～69之間，眾數(shù)為61，符合惡性腫瘤的特征。

實(shí)施例5

短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，str)又稱為微衛(wèi)星dna。一般由一個(gè)長2～6bp的核心序列經(jīng)多次串聯(lián)重復(fù)排列而成，重復(fù)次數(shù)大多在10～60次之間。個(gè)體間核心序列的重復(fù)次數(shù)呈高度變異性，因而一組str序列的重復(fù)次數(shù)在不同個(gè)體中幾乎是唯一的，是細(xì)胞生物學(xué)對細(xì)胞身份和來源進(jìn)行鑒定的主要方法。收集新鮮培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，用qiagen基因組dna小量提取試劑盒(購自qiagen公司，貨名qiaampdnaminikit，貨號為51304)提取細(xì)胞基因組dna，用5'端熒光標(biāo)記的str引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對所得產(chǎn)物進(jìn)行測序。其中str位點(diǎn)的引物序列及拷貝數(shù)如表1和圖4所示。上述序列和atcc，dsmz等細(xì)胞保存庫的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢對比，未發(fā)現(xiàn)相同str檢測結(jié)果，由此可以證明其是唯一的，且在原代培養(yǎng)過程中未發(fā)生和其他細(xì)胞的交叉污染。

表1str位點(diǎn)的拷貝數(shù)。

實(shí)施例6

免疫組化檢測人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞標(biāo)記蛋白。采用s-p法進(jìn)行免疫組化染色，相關(guān)試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的抗體為ck5/6(貨號mab-0276，福州邁新公司)，p63(貨號zm-04-06，北京中衫金橋公司)，ck7(貨號ir619，dako公司)，ttf1(貨號mab-0599，福州邁新公司)，nse(貨號zm-0203，北京中衫金橋公司)，vimentin(ir630，dako公司)。

腫瘤細(xì)胞免疫組化：待檢測細(xì)胞(人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞)提前24小時(shí)爬片于消毒載玻片上，24小時(shí)后，用pbs緩沖液沖洗2次，冰多聚甲醛固定15分鐘，用pbs緩沖液沖洗3次，各2分鐘，浸泡于pbs中備用。取所需玻片加0.5％tritonx-100(dpbs配)孵育20分鐘，pbs緩沖液沖洗3次，各2分鐘，再加50μl過氧化物酶阻斷溶液(試劑a)的室溫下孵育10分鐘，pbs緩沖液沖洗3次，每次3分鐘，除去pbs液，滴加50μl正常非免疫動物血清(試劑b)，室溫下孵育10分鐘；除去血清，滴加50μl一抗，室溫下孵育60分鐘，pbs沖洗三次，每次3～5分鐘；滴加二抗，室溫下孵育10分鐘，pbs沖洗三次，每次3分鐘。滴加polyperoxidase-anti-mouse/rabbitigg，室溫下孵育30分鐘，pbs緩沖液沖洗3次，每次2分鐘。稀釋配制dab溶液，顯色5～10分鐘，鏡下觀察。清水沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明、封片。

結(jié)果如圖5所示，人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞呈ck7陽性，ck5/6陰性，nse陰性，p63陰性，ttf1陰性和vimentin陽性。細(xì)胞的免疫組織化學(xué)結(jié)果提示人肺癌細(xì)胞系zlc-001是腺癌來源的。

實(shí)施例7

取生長狀態(tài)良好的人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液以500，1500，4500個(gè)細(xì)胞每孔接種于6孔板中。將6孔板置于培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)2周，每周換液2次。2周后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用pbs漂洗后，無水甲醇固定10min，然后用0.1％結(jié)晶紫染色10min，洗去染色液，室溫干燥，并拍照記錄。如圖6所示，人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞的克隆形成率與接種密度有關(guān)系，接種密度為4500個(gè)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞克隆形成能力較強(qiáng)。

實(shí)施例8

取生長狀態(tài)良好的人肺癌細(xì)胞系zlc-001細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。將細(xì)胞懸液以1000萬個(gè)細(xì)胞分別接種到5只裸鼠(裸小鼠)腋下，連續(xù)觀察。試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，接種后2周后可觸及到腫塊，隨時(shí)間的增加，腫塊增大。