亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

可促進人肺腺癌細胞分化的cDNA及其真核表達載體及應用的制作方法

文檔序號:449742閱讀:239來源:國知局
專利名稱:可促進人肺腺癌細胞分化的cDNA及其真核表達載體及應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種能促進人肺腺癌細胞分化的cDNA,包含該cDNA的真核表達載體以及該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應用。所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細胞系中分離得到。
肺癌對人類生命、健康的威脅日趨嚴重,在工業(yè)發(fā)達國家和地區(qū),男性肺癌發(fā)病率高居各類腫瘤之首,女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌而居第二位。在我國,肺癌發(fā)病率有超過胃癌而躍居第一位的趨勢。肺癌患者預后很差。其五年生存率僅為10-15%,其中小細胞肺癌五年生存率低于5%。20余年來,盡管對某些腫瘤的治療取得了成功或取得重大進展,但傳統(tǒng)的手術、放療和化療三大療法并未能改善大多數(shù)肺癌患者的預后,降低死亡率。近20年來,腫瘤分子生物學研究取得了重大進展?,F(xiàn)已明確,癌的發(fā)生是細胞增殖失控和分化障礙的結果,細胞癌基因的激活和抑癌基因的失活是造成細胞生長與分化調(diào)控紊亂的根本原因。因此,應用各種方法分離腫瘤抑制基因或促分化基因,對于闡明腫瘤發(fā)生的內(nèi)在機制和設計有效防治措施都具有重要意義。
維甲酸(Retinoic Acid.,RA)是維生素A的代謝產(chǎn)物,對人體的正常形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和細胞分化起重要調(diào)節(jié)作用。近10多年的研究結果表明,RA對某些完全轉化的、具有轉移性的腫瘤細胞產(chǎn)生增生抑制或誘導終末分化作用,能夠使某些腫瘤的惡性程度降低或去惡性化。盡管并不是各種腫瘤都對RA有這樣的反應,然而,這些發(fā)現(xiàn)無疑對腫瘤治療提供了一個新線索。在很多情況下,惡性腫瘤是一種細胞異常分化的疾病,對于那些具有侵襲性的細胞可以通過調(diào)節(jié)其細胞分化而不是應用細胞毒藥物殺死細胞的方法得到控制。由此為RA的腫瘤分化治療作用提供了理論依據(jù)。
由于RA對多種腫瘤的增殖抑制和/或分化誘導作用,使其成為某些惡性腫瘤的分化誘導劑和化學預防劑。中國醫(yī)學科學院腫瘤研究所林培中等(中華腫瘤雜志10(3)161-166,1988;中國醫(yī)學科學院學報12(4)235-245,1990)從80年代初即開始用我國新研制的維甲類化合物在食管癌高發(fā)區(qū)進行食管癌的阻斷性研究,使有食管粘膜重度增生者的癌變率明顯降低;黃萌茸等(Huang ME,Ye YuChen et al,Blood 73567-572,1988)在國際上首次用全反式維甲酸治療急性早幼粒白血病患者取得成功。但RA對細胞增殖分化調(diào)節(jié)的分子機制一直是個謎。近10年來,隨著維甲酸受體基因的克隆,對這個問題的認識發(fā)生了質(zhì)的飛躍。目前認為,維甲酸作用的機制是維甲酸與細胞核內(nèi)的維甲酸受體結合后作為轉錄因子與特異性順式作用DNA序列結合,調(diào)節(jié)靶基因的轉錄活。雖然受調(diào)控基因的具體數(shù)量和順序尚未弄清,但一般認為維甲酸是啟動了級聯(lián)(Cascade)式的轉錄調(diào)節(jié),導致一系列分化基因的激活和增殖基因的受抑。至今已有越來越多的RA靶基因得到認識,也分離、克隆出了一些引起細胞分化的新基因。這不僅使腫瘤細胞分化治療的理論認識深化了一步,也有可能成為一類惡性腫瘤基因治療的目的基因。80年代末,本室在發(fā)現(xiàn)RA可引起食管癌細胞系生長的抑制及終末分化的基礎上,應用cDNA消減雜交技術,已從誘導分化的食管癌細胞系中分離出一個具有抑癌作用的cDNA片段(見中國專利申請95101293.2)。
因此,本發(fā)明的第一個目的在于提供一種可促進入肺腺癌細胞分化的cDNA,所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細胞系中分離得到,其對人肺腺癌細胞等腫瘤細胞具有明顯的生長抑制作用。
本發(fā)明的第二個目的在于提供包含所述的cDNA的真核表達載體。
本發(fā)明的第三個目的在于該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應用。
相應地,根據(jù)本發(fā)明的一個方面,本發(fā)明涉及一種可促進入肺腺癌細胞分化的cDNA,其全長為1475bp,核苷酸序列見序列表(SEQ ID NO1)。所述的cDNA是通過用全反式維甲酸誘導入肺腺癌細胞系GLC-82使其發(fā)生分化,從其cDNA文庫中利用cDNA消減雜交分離得到。
cDNA消減雜交是在mRNA水平分離兩種狀態(tài)下特異表達或抑制表達基因的策略。在正常細胞或腫瘤細胞分化過程中,涉及一些分化相關基因的表達,本發(fā)明人所在科室已用該方法從RA誘導分化的食管癌細胞系中分離出具有抑癌活性的cDNA-RA538,開辟了一條從誘導分化的腫瘤細胞中分離促分化基因的新途徑(中國專利申請95101293.2)。Steinman等(Steinman RA,et al,Oncogene,93389-3396)對黑色素瘤細胞進行誘導分化,用消減雜交方法也得到一些差異表達的cDNA,稱為黑色素瘤分化相關基因(mda),而其中的一個cDNA恰巧是p21,WAF/CIPI(野生型p53激活因子),該基因在RA,DMSO誘導分化的HL-60細胞中呈即刻快速表達。Schraml等(Schraml P,et al,Cancer Res.,545236-5240,1994)用正常肺組織與非小細胞肺癌組織的cDNA作消減雜交,分離出17個差異表達的cDNA克隆,其中六個在非小細胞肺癌中表達缺失,表明它們可能與非小細胞肺癌的發(fā)生有關。
基于RA作用的分子機制,根據(jù)cDNA消減雜交原理,本發(fā)明人采用肺腺癌細胞誘導分化與cDNA-cDNA消減雜交相結合的策略,首先構建了未經(jīng)RA誘導及RA誘導不同時間細胞的cDNA文庫,通過cDNA文庫消減雜交,獲取分化啟動階段和分化早期細胞基因表達變化的信息。其次,采用cDNA文庫間直接比較(cDNA文庫消減雜交)的策略,通過按比例加大靶DNA、即RA誘導文庫單鏈DNA的投入量,增加了獲取由低豐度mRNA轉錄的cDNA的機率,因而可望發(fā)現(xiàn)在RA誘導不同時間,即細胞分化的不同階段被激活而特異表達的基因。RA特異性cDNA消減文庫的建立,使細胞分化過程中基因表達變化的信息得到富集,使反映細胞分化過程中基因表達的動態(tài)變化特征成為可能,這為進一步篩選分化相關基因提供了方便。
經(jīng)一系列篩選,本發(fā)明人從RA誘導表達的cDNA消減文庫中分離到一個在RA誘導后呈早期表達的cDNA克隆(命名為RA28)。經(jīng)查詢美國國家生物信息中心(NCBI)的最新(1995.8)核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(Nucleotide Sequence Database),未見同源序列,表明RA28是新發(fā)現(xiàn)的cDNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面,本發(fā)明還涉及包含所述的cDNA的真核表達載體,在本發(fā)明的實施例中采用的真核表達載體為pMSG(7.6kb,購自Pharmacia),將RA28克隆cDNA兩端各加銜接頭(adaptor),使其兩端均為SalI位點,直接與經(jīng)SalI酶切的pMSG連接,利用限制酶切反應鑒定插入片段的正反向,并將正向重組質(zhì)粒命名為pMSG-RA28,即GLC-ada-RA28,根據(jù)布達佩斯條約,該質(zhì)粒已于1996年4月5日在中國典型培養(yǎng)物中心保藏(CCTCC,中國武漢),保藏號為CCTCC M96004。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面,本發(fā)明還涉及所述的cDNA序列在制備基因治療人肺腺癌的制劑中的應用。
附圖的簡要說明

圖1為本發(fā)明采用的cDNA定向克隆技術的示意圖。
圖2示出用菌落原位雜交/加-減法差異篩選cDNA消減克隆,圖中(a)為消減克隆與RA誘導文庫總cDNA探針雜交的結果,(b)為消減克隆與未誘導文庫總cDNA探針雜交的結果。
圖3為Northern雜交分析,示出本發(fā)明的RA28克隆在RA誘導1天的GLC-82細胞中特異表達。
圖4為pMSG-RA28與pDOR-neo共轉染的GLC-82細胞用地米塞松(10-6M/L)處理后的RNA原位雜交的照片,圖中細胞漿中的藍色顆粒為RA28表達的mRNA產(chǎn)物。
以下結合附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步的描述。實施例1用全反式維甲酸處理人肺腺癌細胞系GLC-82A.材料來源人肺腺癌細胞系GLC-82得自昆明醫(yī)學院,其是一株來自終末小支氣管的肺腺癌細胞,1982年建株。供體為云南個舊一48歲女性,該細胞倍增時間為48小時,體外培養(yǎng)呈堆疊性生長,細胞在雙層軟瓊脂中形成集落的能力強,接種裸鼠第8天便有形成,呈結節(jié)狀浸潤生長,是一株惡性程度很高的瘤細胞。
全反式維甲酸(RA)、二甲亞砜(DMSO)為Sigma公司產(chǎn)品。
RPMI 1640培養(yǎng)基、異硫氰酸胍購自GIBCO-BRL公司。
克隆載體pSPORT1購自BRL公司。
B.方法細胞培養(yǎng)及RA誘導于80ml培養(yǎng)瓶中接種5×104細胞,加入8ml RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清,100u/ml青、鏈霉素)于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)傳代。于使用前溶于少量DMSO,用小牛血清稀釋至10-3mol/L,細胞培養(yǎng)液中RA終濃度為10-5mol/L,每日換液,未處理細胞培養(yǎng)液中僅含相應量(0.02%)的DMSO。實施例2 GLC-82細胞的cDNA文庫的建立及消減雜交在用10-5mol/L全反式維甲酸(RA)誘導入肺腺癌細胞系分化的基礎上,應用定向克隆方法分別構建了未經(jīng)RA誘導和RA誘導1天及4天細胞的3個cDNA文庫。通過cDNA文庫消減雜交,建立了RA特異性cDNA消減文庫,進而篩選到細胞分化過程中由RA激活而特異表達的cDNA序列。
cDNA定向克隆和細菌轉化
用異硫氰酸胍-鹽酸胍分級沉淀法(Instructio n manualmRNAisolation system,BRL life technologies Inc.USA,1990)提取細胞RNA,進而用Oligo-dT纖維素柱分離mRNA。以未經(jīng)RA誘導及RA誘導1天和4天的GLC-82細胞mRNA為模版,采用銜接頭-引物(adaptor-primer)法合成具有不同粘末端的cDNA,定向克隆進噬菌粒載體pSPORT1(GIBCO-BRL,美國),TFB法制備高轉化率的DH5αF′IQ感受態(tài)菌并進行轉化和作cDNA插入片段的限制性內(nèi)切酶分析。
cDNA文庫消減雜交用M13K07輔助噬菌體(Pharmacia,瑞士)感染RA誘導文庫提取單鏈重組DNA(Shweinfst CW,et al,Genet.Annal.Tech.Appl.764-70,1990),經(jīng)羥基磷灰石柱層析(Sambrook J.etal,Molecular Cloning,A LaboratoryManual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory,19 89,ColdSpring Harbor,New York,USA)和限制性內(nèi)切酶消化純化后,取10μg與經(jīng)Southern轉印共價結合于APT膜(Sigma,美國)上的80μg未誘導文庫cDNA進行雜交。回收經(jīng)6輪雜交后仍未被結合的RA誘導文庫的單鏈DNA,純化后將25μl模板/引物反應液(10μl消減雜交富集的單鏈DNA,5μl 5×Taq DNA聚合酶緩沖液和25ng經(jīng)Not1/Sall酶切的線性載體pSPORT1 DNA)于92℃變性7min,55℃退火40分鐘,加入5μl預熱的5×Taq DNA聚合酶緩沖液,5μl(2mmol/L)dNTP混合液,0.5μl(2u/ml)Taq DNA聚合酶,14.5μl去離子滅菌水,55℃繼續(xù)反應2分鐘后,于70℃延伸40分鐘。反應產(chǎn)物純化后作細菌轉化,用含X-gal/IPTG/AMP的LB培養(yǎng)基篩選陽性克隆。
菌落原位雜交-加/減法差異篩選取RA誘導前后細胞的mRNA各10μg,隨機引物法合成[α-32P]-dCTP標記的總cDNA探針,分別與消減雜交后得到的克隆作菌落原位雜交。
應用cDNA定向克隆技術(圖1),分別構建了未經(jīng)RA誘導及RA誘導1天和4天細胞的3個cDNA文庫,主要技術參數(shù)如下表。
3個cDNA文庫的主要技術參數(shù)
RA特異性cDNA消減文庫的建立和鑒定將經(jīng)消減雜交富集的RA特異性單鏈DNA回復為雙鏈后轉化感受態(tài)菌,得到143個克隆。與RA誘導前后細胞的總cDNA探針作加/減(plus-minus)法雜交差異篩選,見143個克隆全都與RA誘導后細胞的總cDNA探針結合,出現(xiàn)很強的雜交信號(圖2a),而與未誘導細胞的總cDNA探針雜交,也有19個克隆出現(xiàn)較強的雜交信號(圖2b),說明這19個克隆為RA誘導前后文庫共有,而其余124個克隆應為RA特異性cDNA消減克隆。
根據(jù)同源性分析結果并按cDNA大小對消減克隆分組后,依次與文庫總cDNA作Southern印跡雜交,以判斷消減克隆的存在狀態(tài),去除共存于RA誘導前后三個文庫中的非特異性序列,選取僅存在于RA誘導文庫中的克隆作進一步分析。
經(jīng)過文庫總cDNA的Southern印跡雜交篩選,選取僅存在于RA誘導文庫中的cDNA克隆作RNA Northern印跡雜交,見28號克隆cDNA在RA誘導1天的細胞中特異表達(圖3),而在未誘導細胞中無表達,將該克隆命名為RA28克隆。酶切RA28克隆的質(zhì)粒DNA,分出約1.5kb的cDNA插入片段,對該片段(序列1)進行進一步的分析。實施例3 序列1的核苷酸序列測定按T7測序試劑盒(Pharmacia)說明用雙脫氧終止法測序,序列1的核苷酸序列如序列表所述。實驗例1 cDNA序列1的生物學功能鑒定材料和方法細胞系肺腺癌細胞系GLC-82由昆明醫(yī)學院梁明達教授惠贈。培養(yǎng)條件為RPMI1640培養(yǎng)基,15%小牛血清,37℃,5%CO2。真核表達載體的構建用SalI及NotI雙酶切從克隆載體中得到RA28的全長cDNA約1.5kb,選擇的表達載體為pMSG(7.6kb,Pharmacia),其適于表達插入鼠乳腺瘤病毒LTR啟動子下游多克隆位點的cDNA序列。在激素效應細胞中可以用糖皮質(zhì)激素對上述啟動子進行誘導。將RA28克隆cDNA兩端各加銜接頭(adaptor),使其兩端均為SalI位點,直接與經(jīng)SalI酶切的pMSG連接,利用限制酶切反應鑒定插入片段的正反向,并將正向重組質(zhì)粒命名為pMSG-RA28,根據(jù)布達佩斯條約,該質(zhì)粒已于1996年4月5日在中國典型培養(yǎng)物中心保藏(CCTCC,中國武漢),保藏號為CCTCCM96004。Lipofectin介導的DNA轉染GLC-82細胞接種于50ml培養(yǎng)瓶中(約5×104個細胞),37℃培養(yǎng)至50%的覆蓋率。將10μg pMSG、pMSG-RA28分別與40μg Lipofectin混合,加入3ml培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2孵育12小時后,換等體積含20%胎牛血清的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48小時,1∶5傳代,加入篩選培養(yǎng)基(含霉酚酸25μg/ml,次黃嘌呤5μg/ml,黃嘌呤5μg/ml,胸腺嘧啶10μg/ml,氨基喋呤2μg/ml,谷氨酰胺29.2μg/ml)。一般在篩選14-20天出現(xiàn)明顯的轉化集落。RNA原位雜交檢測外源cDNA片段的表達用地塞米松(DM,1mg/ml,華北制藥廠出品,作用終濃度為10-6M/L)處理轉染后細胞,將胰酶消化的細胞懸液滴于載玻片上,使細胞貼附于玻片,用生物素標記的RA28探針進行細胞原位雜交,親和素偶聯(lián)堿性磷酸酶,NBT/BCIP為底物顯色,細胞內(nèi)出現(xiàn)藍色顆粒為表達的mRNA產(chǎn)物。RT-PCR反應檢測轉染細胞中谷氨酰胺轉移酶(TGase)基因的表達變化提取經(jīng)DM處理的轉染細胞的總RNA,取1μgRNA,在20μl反應體積內(nèi),用M-MLVH-RT(Gibco,BRL)合成第一鏈cDNA。TGase引物為跨第6、7外顯子片段,長度為180bp;用于內(nèi)對照的管蛋白(α-tubulin)引物跨第1、2外顯子,擴增長度410bp。 PCR反應為50μl體積內(nèi),取逆轉錄產(chǎn)物5μl,引物各50pmol,2.5mM dNTP 2μl,10×緩沖液5μl,Taq酶(中科院遺傳所)1單位。94℃40秒,50℃40秒,72℃2分鐘,循環(huán)35次,1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果GLC-82細胞的形態(tài)學變化轉染pMSG-RA28的GLC-82細胞,經(jīng)篩選培養(yǎng)基篩選出抗性集落后,用DM誘導RA28的表達。結果表明,DM誘導后細胞生長速度明顯減慢,5-6天后,集落周邊細胞體積增大,細胞扁平,形狀不規(guī)則。這些變化逐漸累及集落內(nèi)部細胞,至2周左右,大多數(shù)細胞的細胞連接被破壞,細胞成片脫落、死亡,只見一些殘留的網(wǎng)絡狀支架。而空載體pMSG的轉化集落經(jīng)DM作用后無明顯變化,培養(yǎng)8周以后,集落從內(nèi)部細胞開始自然死亡脫落。
用細胞原位雜交檢測RA28在GLC-82細胞中的表達,在DM處理后的轉化細胞的胞漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RA28的mRNA轉錄產(chǎn)物(圖4),說明RA28的確整合進入GLC-82細胞并表達。RA28對GLC-82細胞中TGase基因表達的影響RA28在GLC-82細胞中表達1天后,即出現(xiàn)TGase基因的表達并持續(xù)至第6天。
因此,由上述實驗可以看出RA28克隆是肺腺癌細胞分化過程中由維甲酸激活而特異表達的基因。將其亞克隆進真核表達載體pMSG,轉導進親本細胞誘導表達后,在分化標志基因-TGase被激活并持續(xù)表達的同時,細胞生長受到明顯抑制,表明這個克隆是人肺腺癌細胞分化相關基因的cDNA序列。這個基因的cDNA可用于肺癌的分化治療和基因治療研究,并有可能作為肺癌基因治療的目的基因在肺癌的臨床治療研究中加以應用。
序列表序列1序列長度1475bp鏈型單鏈分子型cDNA特征有明顯的閱讀框來源人性質(zhì)具有促進人肺腺癌細胞分化功能的cDNAGTTCTCCACA ACTGCCAGCA ATCCTTCCAC CAGGCAAAAC ACATCATCTA AGGAAAAGAA60GTGACGTTTG CTTAGGGCGT GGCAGCTTCG GATAAACGCA GGACTCCGCC TGGCAGCCCG 120ATTTCTCCCG GAACCTCTGC TCAGCCTGGT GAACCACACA GGCCCGAGTT TCACCCAGTC 180CCCACTCCAC GGTGCAGCTG CGGCTTATCT CTCAGCCCAG CGAGATGCCA GCCTTCCTGT 240CCCGGGCCAG CGCTCTGACA TGCAGAAGGT GACCCTGGGC CTGCTTGTGT TCCTGGCAGG 300CTTTCTTGTC CTGGACGCCA ATGACCTAGA AGATAAAAAC AGTCCTTTCT ACTATGACTG 360GCACCAGGTT GGCGGGCTCA TCTGCGCTGG GGTTCTGTGC GCCATGGGCA TCATCATCGT 420CATGATTGAG TGGAGGAGCT CGGGGGAGCA GGCGGGCCGG GGCTGGGGCT CCCCTCCCCT 480GACACCTCAG CTCTCCCCAA CAGGTGCAAA ATGCAAATGC AAGTTTGGCC AGAAGTCCGG 540TCACCATCCA GGGGAGACTC CACCTCTCAT GACCCCCGGC TCAGCCCAAA GCTGATGAGG 600ACAGACCAGC TGAAATTGGG TGGAGGACCG TTCTCTGTCC CCAGGTCCTG TCTCTGCACA 660GAAACTTGAA CTCCAGGATG GAATTCTTCC TCCTCTGTTG CGACTCCTTT GCATGGCAGG 720GCCTCATCTC ACCTCTCGCA AGAGGGTCTC TTTGTTCAAT TTTTTTTTAT CTAAAATGAT 780TGTGCCTCTG CCCAAGCAGC CTGGAGACGT CCTATGTGTG CATTGGGGTG GGGCTTGGGG 840CACCATGAGA AGGTTGGCGT GCCCTGGAGG CTGACACAGA GGCTGGCACT GAGCCTGCTT 900GTTGGGAAAA GCCCACAGGG CTGTTCCCTT TGGGCTTGGG ACATGGCACA GGCCCGCCCT 960CTGCCTCCTC AGCCATGGGA CCTCATATGC AATTTGGGAT TTACTAGTAG CCAAAAGGAA 1020TGAAAGAGAG CTCTAACCAG ATGGAACACT GGAACATTCC AGTGGACCCT GGACCATTCC 1080AGGAAAACTG GGACATAGGA TCGTCCCGCA ATGAGGGAAG TGTTCAGACA GTTTATAATA 1140GTAAGCCCCT GTGACCCTCT CACTTACCCC GAGACCTCAC TTTATTACAA GATGTTTGCA 1200AATACCCAAA TGTCCCTGGA AGCCCGTTAA ATAATTCCCT ATGCTACCCT TAATAACAGA 1260CAATGACCAC ATATTGTGAG AACTTCCAAC AAGCCTCAAA GTCCCTTGAG ACTCCCCAAT 1320ACCTAATAAG GCATGCGAAA TGTTCTCATG AACTACCCCA CAACACCCCT AAAACTCAAA 1380ACACCCAAAA ATATCTCCTC CAATGTCCTG CGACATGAAC CCAAAAAGAG ACCCACAATA 1440AACTCGTGAC TTGTCCCCTC AAAAAAAAAA AAAAA 147權利要求
1.一種促進人肺腺癌細胞分化的cDNA,其特征是所述的cDNA的序列為GTTCTCCACA ACTGCCAGCA ATCCTTCCAC CAGGCAAAAC ACATCATCTA AGGAAAAGAA60GTGACGTTTG CTTAGGGCGT GGCAGCTTGG GATAAACGCA GGACTCCGCC TGGCAGCCCG 120ATTTCTCCCG GAACCTCTGC TCAGCCTGGT GAACCACACA GGCCCGAGTT TCACCCAGTC 180CCCACTCCAC GGTGCAGCTG CGGCTTATCT CTCAGCCCAG CGAGATGCCA GCCTTCCTGT 240CCCGGGCCAG CGCTCTGACA TGCAGAAGGT GACCCTGGGG CTGCTTGTGT TCCTGGCAGG 300CTTTCTTGTC CTGGACGCCA ATGACCTAGA AGATAAAAAC AGTCCTTTCT ACTATGACTG 360GCACCAGGTT GGCGGGCTCA TCTGCGCTGG GGTTCTGTGC GCCATGGGCA TCATCATCGT 420CATGATTGAG TGGAGGAGCT CGGGGGAGCA GGCGGGCCGG GGCTGGGGCT CCCCTCCCCT 480GACACCTCAG CTCTCCCCAA CAGGTGCAAA ATGCAAATGC AAGTTTGGCC AGAAGTCCGG 540TCACCATCCA GGGGAGACTC CACCTCTCAT GACCCCCGGC TCAGCCCAAA GCTGATGAGG 600ACAGACCAGC TGAAATTGGG TGGAGGACCG TTCTCTGTCC CCAGGTCCTG TCTCTGCACA 660GAAACTTGAA CTCCAGGATG GAATTCTTCC TCCTCTGTTG CGACTCCTTT GCATGGCAGG 720GCCTCATCTC ACCTCTCGCA AGAGGGTCTC TTTGTTCAAT TTTTTTTTAT CTAAAATGAT 780TGTGCCTCTG CCCAAGCAGC CTGGAGACGT CCTATGTGTG CATTGGGGTG GGGCTTGGGG 840CACCATGAGA AGGTTGGCGT GCCCTGGAGG CTGACACAGA GGCTGGCACT GAGCCTGCTT 900GTTGGGAAAA GCCCACAGGG CTGTTCCCTT TGGGCTTGGG ACATGGCACA GGCCCGCCCT 960CTGCCTCCTC AGCCATGGGA CCTCATATGC AATTTGGGAT TTACTAGTAG CCAAAAGGAA 1020TGAAAGAGAG CTCTAACCAG ATGGAACACT GGAACATTCC AGTGGACCCT GGACCATTCC 1080AGGAAAACTG GGACATAGGA TCGTCCCGCA ATGAGGGAAG TGTTCAGACA GTTTATAATA 1140GTAAGCCCCT GTGACCCTCT CACTTACCCC GAGACCTCAC TTTATTACAA GATGTTTCCA 1200AATACCCAAA TGTCCCTGCA AGCCCGTTAA ATAATTCCCT ATGCTACCCT TAATAACAGA 1260CAATGACCAC ATATTGTGAG AACTTCCAAC AAGCCTCAAA GTCCCTTGAG ACTCCCCAAT 1320ACCTAATAAG GCATGCGAAA TGTTCTCATG AACTACCCCA CAACACCCCT AAAACTCAAA 1380ACACCCAAAA ATATCTCCTC CAATGTCCTG CGACATGAAC CCAAAAAGAG ACCCACAATA 1440AACTCGTGAC TTGTCCCCTC AAAAAAAAAA AAAAA 1475
2.如權利要求1所述的cDNA,其特征是所述的序列是從全反式維甲酸誘導的人肺腺癌細胞系GLC-82中分離得到。
3.一種含有如權利要求1所述的cDNA的真核表達載體。
4.如權利要求3所述的真核表達載體,其為含所述的cDNA的質(zhì)粒GLC-ada-RA28,該質(zhì)粒已根據(jù)布達佩斯條約,于1996年4月5日在中國典型培養(yǎng)物中心保藏,保藏號為CCTCC M96004。
5.如權利要求1所述的cDNA在制備基因治療人肺腺癌的制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能促進人肺腺癌細胞分化的cDNA,包含該cDNA的真核表達載體以及該cDNA在制備治療腫瘤的制劑中的應用。所述的cDNA是從維甲酸處理的人肺腺癌細胞系中分離得到。
文檔編號C12N15/79GK1172163SQ9610921
公開日1998年2月4日 申請日期1996年7月26日 優(yōu)先權日1996年7月26日
發(fā)明者黎伯銓, 王秀琴, 吳旻 申請人:中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1