技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及胚胎工程領(lǐng)域，特別涉及輔助生殖領(lǐng)域中一種卵母細胞激活的物理方法，以及一種評價精子或人工輔助方法激活卵母細胞時其受精潛能的評價指標(biāo)。

技術(shù)背景

如今，全球約有10％-16％的夫婦面臨著不孕不育的問題。盡管輔助生殖技術(shù)的誕生已經(jīng)幫助了許多不孕不育的患者，但是受精失敗的現(xiàn)象依然普遍存在。在輔助生殖領(lǐng)域中，卵母細胞單精子顯微注射技術(shù)(intracytoplasmicsperminjection,icsi)的應(yīng)用最為廣泛，它借助顯微鏡操作系統(tǒng)，人工地將單一的精子注射到卵母細胞內(nèi)使其受精，可以使受精率明顯提高到70％。但是任然有相當(dāng)一部分患者在進行icsi后無法受精，研究發(fā)現(xiàn)由于精子自身存在缺陷而導(dǎo)致的卵母細胞激活不足是icsi受精失敗的主要原因。

所謂的卵母細胞激活，就是指在成熟促進因子(m-phasepromotingfactor,mpf)保持穩(wěn)定的作用下，哺乳動物成熟的卵母細胞會發(fā)育并停留在減數(shù)第二次分裂中期，既mii期，只有在精子或人工方式的刺激下，卵母細胞才能恢復(fù)并完成減數(shù)分裂，這個過程被稱為卵母細胞的激活。

精子刺激卵母細胞后，會引起卵母細胞發(fā)生一系列形態(tài)上和生理上的反應(yīng)，主要包括細胞內(nèi)鈣濃度短暫性的升高以及隨后發(fā)生的鈣振蕩、第二極體釋放、形成雌、雄雙原核等等。其中，細胞內(nèi)鈣離子濃度的升高和鈣振蕩的形成，不僅被認(rèn)為是誘導(dǎo)激活后一系列反應(yīng)的必要因素，更是接下來胚胎發(fā)育的重要環(huán)節(jié)。并且鈣振蕩的頻率、振幅、持續(xù)時間等，都會影響著細胞周期的進程以及早期胚胎發(fā)育過程中蛋白質(zhì)的表達

為了解決icsi受精失敗的問題，現(xiàn)在通常會采用人工激活的方式來幫助精子刺激卵母細胞，從而誘導(dǎo)卵母細胞內(nèi)ca2+濃度脈沖式的升高或者ca2+振蕩來實現(xiàn)激活。其中，卵母細胞激活率、囊胚率和能否誘導(dǎo)鈣離子振蕩是人們主要關(guān)注的問題。目前人工激活卵母細胞的方法主要有：化學(xué)激活法、電學(xué)激活法、機械激活法，在化學(xué)法中最常用的激活試劑包括乙醇、鈣離子載體a23187、離子霉素、鍶離子等等。

這些方法能在一定程度上提高卵母細胞的激活效率，但其中化學(xué)法和機械法的操作復(fù)雜、重復(fù)性差、且激活效率和胚胎發(fā)育潛能還有待提高。而傳統(tǒng)的電學(xué)激活方法能量過大，容易對細胞產(chǎn)生損傷。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、高效可控的卵母細胞激活方法，可提高卵母細胞的激活效率和胚胎發(fā)育潛能，以及提供一種評價精子或人工方式刺激卵母細胞后其受精潛能的評價指標(biāo)，為輔助生殖中胚胎移植提供理論依據(jù)。

為實現(xiàn)以上技術(shù)效果，本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案：

本發(fā)明是基于納秒級脈寬的脈沖電場能誘導(dǎo)卵母細胞出現(xiàn)鈣離子振蕩的現(xiàn)象，用胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化所形成的鈣振蕩的特征作為卵母細胞受精潛能的評價指標(biāo)。

上述的卵母細胞激活方法，首先將卵母細胞及卵母細胞培養(yǎng)液htf置于電極杯后施加電脈沖序列進行處理，將處理后的卵母細胞經(jīng)培養(yǎng)液洗滌2-4次，移入36-37℃、5-10％co2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7-8天。

優(yōu)選地，先用電場強度為35kv/cm-50kv/cm，脈沖頻率為0.5hz-1.5hz，脈沖寬度為30ns-300ns的脈沖作用3-10秒，緊接著用電場強度為5kv/cm-35kv/cm，脈沖頻率為0.5hz-1.5hz，脈沖寬度為10ns-30ns的脈沖作用3-5秒。

上述的卵母細胞受精潛能的評價指標(biāo)，其特征在于：用卵母細胞胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化所形成鈣振蕩的特征作為評價卵母細胞受精潛能的指標(biāo)。

上述的卵母細胞受精潛能的評價指標(biāo)，其特征在于：將經(jīng)過前處理激活后的卵母細胞用鈣離子探針染色，置于共聚焦顯微鏡下，檢測胞漿內(nèi)鈣離子濃度隨時間的變化。

上述的卵母細胞受精潛能度的評價指標(biāo)，其特征在于：將鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作為卵母細胞受精潛能的指標(biāo)；鈣振蕩衰減因子如下，用于反映有效囊胚率：

其中：n為超過閾值的鈣峰個數(shù)，閾值為最大鈣離子濃度的70％，t為共聚焦顯微鏡的掃描時間；定義鈣峰個數(shù)大于等于10時，有效囊胚率為100％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例披露如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案作出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。

附圖說明：

圖1為兔卵母細胞激活的操作流程圖

圖2為電脈沖序列刺激后，小鼠卵母細胞內(nèi)鈣離子振蕩圖

圖3為鈣離子載體a23187刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

圖4為7％乙醇刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

圖5為正常精子刺激小鼠卵母細胞后引起的鈣離子濃度變化圖

具體實施方法

以下通過實施例對本發(fā)明進行進一步說明，當(dāng)然本發(fā)明的實施范圍并不僅限于下述的范圍。

實施例一：激活兔卵母細胞

1.實驗動物

6-15月齡，體重為2.5-3.5kg的性成熟期雌性日本大耳兔，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質(zhì)酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

3.卵母細胞準(zhǔn)備和培養(yǎng)

先用碘酒棉球消毒母兔頸部皮膚，于頸部皮下一次注射pmsg(150iu/只)。48h后，用酒精棉球消毒耳朵邊緣，從耳靜脈注射hcg(75iu/只)進行超促排卵。注射hcg24h后，采用耳靜脈注射10ml空氣處死母兔。

將兔子背部朝下固定在手術(shù)臺上，刮掉腹部中線兔毛并消毒后，用手術(shù)刀在腹部中線處皮膚切開2-3cm長的術(shù)口，打開腹腔后沿著子宮輕輕引出輸卵管及卵巢。在卵巢附近找到輸卵管傘，從傘部插入導(dǎo)卵管并固定，導(dǎo)卵管的另一端接培養(yǎng)皿。用10ml的注射器吸入含5％sss的mhtf培養(yǎng)液作為沖卵液，注射器針頭伸入輸卵管后慢慢推動注射器，將沖卵液注入輸卵管內(nèi)，并由傘部的導(dǎo)卵管收集到培養(yǎng)皿中。

在顯微鏡下觀察沖卵液中的卵母細胞，并采用80iu/ml透明質(zhì)酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，最后移入htf培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37℃，飽和濕度，5％co2)，以待激活處理。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞及適量的htf培養(yǎng)液移入電極杯中，電極杯置于電脈沖序列發(fā)生器中。打開發(fā)生器的電源，此時脈沖電場會對電極杯內(nèi)的卵母細胞施加電脈沖刺激。

在本實施例中，先用電場強度為50kv/cm，脈沖頻率為1.5hz，脈沖寬度為300ns的脈沖作用3秒，再用電場強度為30kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為10ns的脈沖作用3秒。電極杯中兩電極的間距為4mm。

將電場處理過的卵母細胞及htf培養(yǎng)液從電極杯中吸出，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，飽和濕度，5％co2)。15-24h后統(tǒng)計卵母細胞激活率，之后連續(xù)7-8天記錄胚胎發(fā)育狀況

在本實施例中，兔卵母細胞激活率可達到80％，囊胚率可達到37.5％。

實施例二：誘導(dǎo)小鼠卵母細胞內(nèi)鈣離子振蕩

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質(zhì)酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

3.卵母細胞準(zhǔn)備和培養(yǎng)

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養(yǎng)液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復(fù)合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質(zhì)酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，移入htf培養(yǎng)液中。再按1：1的比例加入fluo4-am鈣離子探針后，培養(yǎng)15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)，以待激活處理

4.鈣離子振蕩檢測

將卵母細胞及適量的htf與fluo4-am混合液(1：1)移入電極杯中，電極杯置于電脈沖序列發(fā)生器中。打開發(fā)生器的電源，此時脈沖電場會對電極杯內(nèi)的卵母細胞施加電脈沖刺激。

在本實施例中，先用電場強度為40kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為80ns的脈沖作用10秒，再用電場強度為15kv/cm，脈沖頻率為1.0hz，脈沖寬度為10ns的脈沖作用5秒。電極杯中兩電極的間距為4mm。

將電場處理過的卵母細胞及與fluo4-am混合液從電極杯中吸出，轉(zhuǎn)移至共聚焦培養(yǎng)皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續(xù)掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內(nèi)的變化。

實施例三：評價a23187激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質(zhì)酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

鈣離子載體a23187(a23187sigma)

3.卵母細胞準(zhǔn)備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養(yǎng)液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復(fù)合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質(zhì)酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，移入htf培養(yǎng)液中。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞置于含10μma23187的mhtf液中，37℃避光處理5min，經(jīng)mhtf洗滌5次后，再置于含10％sss的htf液中繼續(xù)培養(yǎng)4h。

5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養(yǎng)15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至共聚焦培養(yǎng)皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續(xù)掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內(nèi)的變化。

當(dāng)鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認(rèn)為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.54，有效囊胚率為0％。因此a23187激活卵母細胞效果良好，但激活后的卵母細胞很大程度上無法發(fā)育成囊胚。

實施例四：評價乙醇激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質(zhì)酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

7％乙醇(用htf培養(yǎng)液將無水乙醇稀釋到7％)

3.卵母細胞準(zhǔn)備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養(yǎng)液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復(fù)合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質(zhì)酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，移入htf培養(yǎng)液中。

4.卵母細胞激活

將卵母細胞置于含7％乙醇的mhtf液，37℃處理5min，經(jīng)mhtf洗滌5次后，再置于含10％sss的htf液中繼續(xù)培養(yǎng)4h

5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養(yǎng)15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至共聚焦培養(yǎng)皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續(xù)掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內(nèi)的變化。

當(dāng)鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認(rèn)為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.11，有效囊胚率為0％。因此7％乙醇雖然可以激活卵母細胞，但激活效果不好，且卵母細胞激活后無法發(fā)育成囊胚。

實施例五：評價正常精子激活小鼠卵母細胞的受精潛能

1.實驗動物

6-8周齡的性成熟期雌性與雄性昆明小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

2.實驗試劑

孕馬血清(pmsgsigma)

人絨毛膜促性腺激素(hcgsigma)

血漿替代品(sssirvinescientific)

透明質(zhì)酸酶(sigma)

改良的人類輸卵管液(mhtfirvinescientific)

人類輸卵管液(htfirvinescientific)

fluo-4am/鈣離子熒光探針(dojindolaboratories)

3.卵母細胞準(zhǔn)備

對雌性小鼠腹腔注射pmsg(10iu/只小鼠)，48h后腹腔注射hcg(10iu/只)進行超促排卵。注射hcg15-19h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸卵管。在含5％sss的mhtf培養(yǎng)液中劃破輸卵管壺腹部膨大部位，將卵丘-卵母細胞復(fù)合體輕輕擠出。采用80iu/ml透明質(zhì)酸霉消化卵母細胞周圍的顆粒細胞，將卵母細胞分散后再經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，移入htf培養(yǎng)液中。

4.精子準(zhǔn)備

采用頸椎脫臼法處死雄性小鼠，在無菌條件下暴露、取出輸精管。在含5％sss的mhtf培養(yǎng)液中劃破輸精管，將精子輕輕擠出。經(jīng)含10％sss的htf培養(yǎng)液洗滌5次，移入含有卵母細胞的htf培養(yǎng)液中5.檢測鈣離子濃度變化

按1：1的比例在含有卵母細胞和精子的10％sss的htf液中加入fluo4-am鈣離子探針，培養(yǎng)15分鐘(37℃，飽和濕度，5％co2)。之后將卵母細胞轉(zhuǎn)移至共聚焦培養(yǎng)皿中，放置于共聚焦顯微鏡(nikona1)下連續(xù)掃描2h，檢測鈣離子濃度在細胞內(nèi)的變化。

當(dāng)鈣離子濃度峰值30％處上升到峰值所需要的時間與從峰值下降到峰值30％處所需時間之比作大于0.50時，認(rèn)為激活效果良好，且上升時間與下降時間之比越接近于1則激活效果越好。

在本實施例中，上升時間與下降時間之比約為0.92，有效囊胚率為66.7％。因此認(rèn)為正常精子激活卵母細胞的效果很好，且卵母細胞激活后很大程度上可以發(fā)育成囊胚。