本發(fā)明涉及免疫磁珠法的細(xì)胞分選技術(shù)，具體涉及一種免疫磁珠法分離胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
：滋養(yǎng)層細(xì)胞是在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞開始出現(xiàn)分化并沿透明帶內(nèi)壁擴(kuò)展和排列的較小個體細(xì)胞，將來發(fā)育成胎膜和胎盤。早期就有研究表明，孕婦宮頸脫落細(xì)胞中存在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，貫穿整個孕期。因此，對滋養(yǎng)層細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有效分離并獲取胎兒dna，對于最早期的產(chǎn)前篩查和診斷具有重大意義。許多研究表明，在早孕期包蛻膜和真蛻膜尚未融合時，一定比例的滋養(yǎng)細(xì)胞會穿過包蛻膜到達(dá)子宮腔，部分脫落到子宮下段，或者通過絨毛退化并脫落至子宮下段或?qū)m頸處，并逐漸積聚，所以若使用一種微創(chuàng)或無創(chuàng)的方法采集宮頸處細(xì)胞，就可以精確地進(jìn)行胎兒的產(chǎn)前診斷，這無疑是一種極具吸引力的方法。免疫磁珠法細(xì)胞分選技術(shù)是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。細(xì)胞分選的方法包括直接法和間接法，直接法即抗體直接與細(xì)胞表面抗原結(jié)合，間接法即抗體(二抗)通過其本身的抗原(一抗)與細(xì)胞表面的抗原結(jié)合。人白細(xì)胞抗原-g(hla-g)基因是位于6號染色體短臂的一類免疫耐受分子，具有選擇性組織分布的特點(diǎn)，hla-g分子主要在人胎盤組織中轉(zhuǎn)錄，表達(dá)于孕卵著床期母體子宮內(nèi)膜的胎盤組織中，通常情況下，hla-g可作為孕期胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。當(dāng)前胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離純化方案主要有以下幾類：1)組織塊培養(yǎng)法，根據(jù)不同類型細(xì)胞的培養(yǎng)懸浮/貼壁狀態(tài)不同實(shí)現(xiàn)對滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離。取樣后制備成單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，血細(xì)胞和hofbauer細(xì)胞為非貼壁，換液過程容易去除；成纖維細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞為貼壁，但成纖維細(xì)胞貼壁速度較快且對胰蛋白酶敏感，可在消化過程中分離。此方法得到的滋養(yǎng)層細(xì)胞純度約為80％，成功率在90％左右。2)密度梯度離心法，采用不連續(xù)或連續(xù)的溶液梯度對細(xì)胞進(jìn)行分離，確定滋養(yǎng)層細(xì)胞所處的密度層從而完成分離。可分為percoll法、淋巴細(xì)胞分層液法、ficoll法。此方法分離的細(xì)胞形態(tài)完整、活性較好，純度可從80％～90％以上，與分層液的類型關(guān)系較大。然而，這些方案雖然能夠取得較好的分離效果，但這些方法均存在操作過于繁瑣，分離時間過長等缺點(diǎn)，嚴(yán)重限制滋養(yǎng)層細(xì)胞在胎兒產(chǎn)前篩查領(lǐng)域的應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種免疫磁珠法分離胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，該方法基于免疫磁珠法細(xì)胞分選技術(shù)，利用抗體偶聯(lián)磁珠實(shí)現(xiàn)對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性捕獲，簡單的幾步孵育便能輕松、快速的實(shí)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離，且易于實(shí)現(xiàn)自動化，有效解決了傳統(tǒng)方法存在的繁瑣、低效和時間過長等問題。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的主要技術(shù)解決手段是提供一種免疫磁珠法分離胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法，包括以下步驟：(1)免疫磁珠偶聯(lián)特異性抗體的制備，向免疫磁珠中加偶聯(lián)劑和能夠特異性捕獲胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的抗體進(jìn)行孵育；(2)洗滌(1)中孵育完成的偶聯(lián)抗體的免疫磁珠2次，將偶聯(lián)抗體的免疫磁珠保存在保存液中備用；(3)收集胎盤滋養(yǎng)層樣本，采用酶解法將該樣本制備為樣本細(xì)胞懸液；(4)把(3)中的樣本細(xì)胞懸液洗滌2次；(5)向(4)洗滌后的樣本細(xì)胞懸液中加入(2)中的偶聯(lián)有特異性抗體的免疫磁珠進(jìn)行孵育；(6)洗滌孵育完成的(5)中的免疫磁珠2次，棄上清，即可得到純化的胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞；優(yōu)選的，所述免疫磁珠為羧基磁珠、環(huán)氧基磁珠、甲苯磺?；胖?，更優(yōu)選的，所述免疫磁珠為甲苯磺?；胖?，優(yōu)選供應(yīng)商為thermofisherm-270epoxy(貨號14301)，所述偶聯(lián)劑為與免疫磁珠類型相對應(yīng)的偶聯(lián)劑，偶聯(lián)方法與所購免疫磁珠類型相一致。優(yōu)選的，能夠特異性捕獲胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的抗體為hla-g抗體，所述步驟(1)孵育的條件和時間與所購免疫磁珠類型相一致，優(yōu)選的，孵育條件為37℃偶聯(lián)16-24h，更優(yōu)選的，孵育條件為37℃偶聯(lián)24h。所述步驟(2)、(4)和(6)的洗滌液均為細(xì)胞培養(yǎng)用pbs，優(yōu)選的，pbs構(gòu)成組分為1.35mnacl，47mmkcl，100mmna2hpo4，20mmnah2po4，且pbs的ph值為7.4。所述步驟(3)的胎盤滋養(yǎng)層樣本為5-8周孕婦宮頸脫落細(xì)胞，其中包含胎兒滋養(yǎng)層細(xì)胞和母體細(xì)胞，所述細(xì)胞懸液為懸浮細(xì)胞的pbs，所述酶解法是利用酶混合物消化胎盤滋養(yǎng)層，具體地，酶混合物為0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i。所述步驟(2)的保存液為去離子水或5％(m/v)bsa。優(yōu)選的，樣本為25-500μl，更優(yōu)選的，樣本為50-150μl。優(yōu)選的，步驟(5)中的細(xì)胞懸液與添加的免疫磁珠的體積比為2:1-1:4，所述步驟(5)的孵育條件為4℃-42℃，30min-24h，優(yōu)選的，孵育條件為37℃，2h。本發(fā)明所述的免疫磁珠法分離胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的方法的具體步驟如下：(1)甲苯磺?；胖榕悸?lián)hla-g抗體的制備：甲苯磺酰基磁珠為thermofisherm-270epoxy(貨號14301)，偶聯(lián)方法參照其產(chǎn)品說明書提供的方法，取磁珠5mg，用pbs溶液洗滌2次(每次1ml)，懸于100μlpbs溶液中，加入100μlhla-g抗體，100μl3m(nh4)2so4溶液，渦旋混勻，37℃傾斜搖動孵育24h，避免磁珠沉降，用0.1％bsa/pbs溶液洗滌磁珠4次(每次1ml)，磁珠懸浮于1ml0.1％bsa/pbs溶液中備用。(2)含胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的單細(xì)胞懸液制備：取5-8周孕婦宮頸脫落細(xì)胞樣本，用預(yù)冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min收集細(xì)胞，加入由0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i組成的酶混合物于37℃孵育30min消化組織和粘液，用預(yù)冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min吸除上清，加入100ul預(yù)冷pbs重懸細(xì)胞。(3)胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分離與純化：向(2)中制備好的含胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞懸液中加入0.2ml(1)中制備的hla-g抗體偶聯(lián)磁珠，置于37℃傾斜搖動孵育2h，用pbs溶液洗滌磁珠2次，每次1ml，在磁力架上聚集磁珠并吸除上清，即分離得到純化的滋養(yǎng)層細(xì)胞樣本。本發(fā)明有益效果是：1、hla-g抗體對胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性選擇完成捕獲，特異性較高；2、利用免疫磁珠偶聯(lián)的抗體進(jìn)行捕獲，捕獲效率極高且操作方便；3、僅需一次抗體的偶聯(lián)，與通常的二抗兩次偶聯(lián)相比，使整個操作簡便易行；4、能短期快速完成低濃度細(xì)胞樣本的富集，并且避免細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)的不便利，對于早期胎兒的無創(chuàng)產(chǎn)前篩查和診斷具有重大意義。附圖說明圖1是磁珠捕獲jeg-3細(xì)胞的結(jié)合體狀態(tài)效果圖，圖2是hek293ft細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果示意圖，圖3是免疫磁珠分離hek293ft和jeg-3混合細(xì)胞后，利用熒光顯微鏡觀察對兩種細(xì)胞的回收數(shù)量圖示，圖4是免疫磁珠分離hek293ft和jeg-3混合細(xì)胞后，利用普通顯微鏡觀察對兩種細(xì)胞的回收數(shù)量圖示，圖5是免疫磁珠分離得到滋養(yǎng)層細(xì)胞的圖示；圖中：具有hla-g抗原的細(xì)胞(jeg-3細(xì)胞、宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞)1、被hla-g抗體偶聯(lián)的磁珠2。具體實(shí)施方式為便于理解，更好地對本發(fā)明進(jìn)行解釋，此處結(jié)合實(shí)驗(yàn)對
發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步描述，此處需要說明的是，hla-g為人類白細(xì)胞抗原-g，屬于非經(jīng)典人類白細(xì)胞抗原i類分子，主要選擇性分布在母體胎兒界面絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層。jeg-3為人絨毛膜癌細(xì)胞株，能夠高度表達(dá)hla-g表面抗原，本發(fā)明利用jeg-3細(xì)胞通過以下實(shí)施例對本分離的特異性和效率進(jìn)行具體描述。以下實(shí)施例僅為說明性驗(yàn)證，并非限制性條件。實(shí)施例1hla-g偶聯(lián)免疫磁珠的合成與偶聯(lián)效率檢測(1)取5mg甲苯磺?；胖?thermofisherm-270epoxy(貨號14301))，用pbs溶液洗滌2次(每次1ml)，懸于100μlpbs溶液中。(2)在(1)含有磁珠的pbs溶液中加入100μlhla-g抗體和100μl3m(nh4)2so4溶液，渦旋混勻，置于37℃傾斜搖動孵育24h，避免磁珠沉降。(3)用0.1％bsa/pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠4次(每次1ml)，磁珠懸浮于1ml0.1％bsa/pbs溶液中備用。(4)取偶聯(lián)前后含hla-g抗體的溶液各10ul，利用quibt3.0fluorometer(lifetechnologies)測定反應(yīng)前后的蛋白含量，根據(jù)差量法計算偶聯(lián)成功的hla-g抗體含量，結(jié)果如下表所示。偶聯(lián)前后的蛋白含量測定結(jié)果蛋白濃度偶聯(lián)前289.5μg/ml偶聯(lián)后204.9μg/ml偶聯(lián)成功的hla-g量25.4μg/(1ml磁珠)實(shí)施例2jeg-3細(xì)胞樣本的培養(yǎng)與計數(shù)(1)jeg-3細(xì)胞在dmem(含10％fbs、1％青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中培養(yǎng)與傳代，jeg-3細(xì)胞快速生長期取樣用于實(shí)驗(yàn)；(2)取一皿(1)中的jeg-3細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化液消化jeg-3細(xì)胞，并用pbs洗滌jeg-3細(xì)胞兩次，2500g離心5min收集jeg-3細(xì)胞，將jeg-3細(xì)胞懸浮于1mlpbs溶液中；(3)取10μl(2)中收集到的jeg-3細(xì)胞懸液，稀釋1000倍，用血細(xì)胞計數(shù)板準(zhǔn)確對jeg-3細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，3次計數(shù)結(jié)果統(tǒng)計如下表所示。jeg-3細(xì)胞計數(shù)結(jié)果計數(shù)結(jié)果第1次8.62x105個/ml第2次8.68x105個/ml第3次8.63x105個/ml平均值8.64x105個/ml實(shí)施例3免疫磁珠法分離效率測試(1)取jeg-3細(xì)胞懸液1.16μl(1000個細(xì)胞)，加入pbs溶液補(bǔ)足至總體積100μl；(2)加入實(shí)施例1所制備hla-g偶聯(lián)磁珠懸液200μl，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(3)用pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠-細(xì)胞結(jié)合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細(xì)胞結(jié)合體；(4)在顯微鏡下觀察并分辨磁珠中的細(xì)胞，用血細(xì)胞計數(shù)板統(tǒng)計細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如下表所示，并拍照，磁珠-細(xì)胞結(jié)合體狀態(tài)如附圖1所示：免疫磁珠法回收jeg-3細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果實(shí)施例4hek293ft細(xì)胞樣品的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染(1)hek293ft細(xì)胞在dmem(含10％fbs、1％青霉素-鏈霉素雙抗溶液)中培養(yǎng)與傳代，細(xì)胞快速生長期取樣用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；(2)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒購自碧云天生物pcmv-c-egfp(參考網(wǎng)站：http://www.beyotime.com/d2626.htm)，轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物lipo6000tm轉(zhuǎn)染試劑(參考網(wǎng)站http://www.beyotime.com/product/c0526.htm)；(3)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h更換溶液，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照，轉(zhuǎn)染效果如附圖2所示；(4)細(xì)胞數(shù)量的統(tǒng)計方法參照實(shí)施例2的方法，統(tǒng)計結(jié)果如下表所示：hek293ft細(xì)胞計數(shù)結(jié)果計數(shù)結(jié)果第1次5.29x105個/ml第2次5.24x105個/ml第3次5.17x105個/ml平均值5.23x105個/ml實(shí)施例5免疫磁珠法分離特異性測試(1)取實(shí)施例2所制備細(xì)胞懸液1.16μl(1000個細(xì)胞)，混入實(shí)施例4所制備細(xì)胞懸液17.21μl(9000個細(xì)胞)，加入pbs溶液補(bǔ)足至總體積100μl；(2)在(1)中制備的100μl細(xì)胞懸液中加入實(shí)施例1所制備hla-g偶聯(lián)磁珠懸液200μl，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(3)用pbs溶液洗滌(2)中孵育完成的磁珠-細(xì)胞結(jié)合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細(xì)胞結(jié)合體；(4)在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染磁珠-細(xì)胞結(jié)合體熒光信號狀況(即通過反向法檢驗(yàn)免疫磁珠對hek293ft細(xì)胞的非特異性捕獲)如圖3所示，在明場顯微鏡下觀察磁珠-細(xì)胞結(jié)合體狀態(tài)如附圖4所示。實(shí)施例6宮頸脫落樣本單細(xì)胞懸液制備(1)取孕齡為5周的孕婦宮頸脫落細(xì)胞樣本，用預(yù)冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min收集細(xì)胞；(2)在步驟(1)收集的細(xì)胞中加入由0.25％胰蛋白酶，20u/mldnasei，0.5mg/ml膠原酶i組成的酶混合物，并置于37℃孵育30min消化組織和粘液；(3)用預(yù)冷的pbs洗滌2次，2500g離心5min吸除上清，加入100ul預(yù)冷pbs重懸細(xì)胞。實(shí)施例7免疫磁珠法分離胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞效果測試(1)向?qū)嵤├?的步驟(1)中所述的100ul細(xì)胞懸液中加入200ul實(shí)施例1所制備hla-g偶聯(lián)磁珠，置于37℃傾斜搖動孵育2h；(2)用pbs溶液洗滌(1)中的磁珠-細(xì)胞結(jié)合體2次，每次0.5mlpbs溶液，在磁力架上聚集磁珠吸除上清，加入100ulpbs溶液重懸磁珠-細(xì)胞結(jié)合體。(3)在顯微鏡下觀察并分辨磁珠中的細(xì)胞并拍照，捕獲的滋養(yǎng)層細(xì)胞-磁珠結(jié)合體狀態(tài)如附圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說明：圖1、圖4、圖5所示具有表面hla-g抗原的細(xì)胞1(jeg-3細(xì)胞、宮頸滋養(yǎng)層細(xì)胞)，被hla-g抗體偶聯(lián)的磁珠2特異性性偶聯(lián)，顯微鏡下觀察顯示，磁珠結(jié)合在細(xì)胞周邊形成細(xì)胞-磁珠結(jié)合體。利用綠色熒光蛋白(egfp)轉(zhuǎn)染的hek293ft細(xì)胞(圖2所示)混入jeg-3細(xì)胞，經(jīng)hla-g磁珠分離后，未檢出熒光信號(圖3所示)，即磁珠未結(jié)合到hek293ft細(xì)胞，但明場顯微鏡下觀察到磁珠結(jié)合的細(xì)胞，圖4所示即為特異性結(jié)合的jeg-3細(xì)胞。圖5所示磁珠富集得到的細(xì)胞即為從宮頸脫落細(xì)胞樣品中特異性結(jié)合到的滋養(yǎng)層細(xì)胞。本發(fā)明不局限于上述最佳實(shí)施方式，任何人在本發(fā)明的啟示下都可得出其他各種形式的產(chǎn)品，但不論在其形狀或結(jié)構(gòu)上作任何變化，凡是具有與本申請相同或相近似的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12