本公開涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，涉及一種n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其藥物。
背景技術(shù)：
：銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，且是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。銅綠假單胞菌可以引起傷口、眼睛和肺部等一系列器官的感染，尤其是非特異性免疫力較低的人群更易感染。銅綠假單胞菌對抗生素具有高度的多重耐藥性，往往引起難以治愈的嚴重感染，對于患者生命造成巨大威脅。銅綠桿菌產(chǎn)生綠膿菌素、分泌胞外蛋白酶和形成生物膜受到群感效應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，引起復(fù)雜的生物膜相關(guān)的銅綠假單胞菌感染和抗藥性。因此抑制群感效應(yīng)能夠抑制銅綠假單胞菌的致病性。通過亟需利用信號分子類似物或者信號分子降解酶對銅綠假單胞菌的群感效應(yīng)進行干擾和破壞，為銅綠假單胞菌的感染提供新的藥物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本公開的目的是提供一種具有群感猝滅作用的信號分子降解酶及其藥物，從而抑制銅綠假單胞菌的致病性。為了實現(xiàn)上述目的，本公開提供一種n-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶，所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶氨基酸序列與seqidno.1所示的序列至少90％同源并且具有n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶。本公開還提供了一種編碼上述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的核苷酸序列。本公開還提供了一種包含如上所述核苷酸序列的表達載體。本公開還提供了一種表達如上所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的菌株，所述菌株中具有如上所述的表達載體。本公開還提供了一種含有所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的藥物，其特征在于，所述藥物能夠治療銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)感染。通過上述技術(shù)方案，本公開所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶來源于保藏號為accc06121的華癸庫特氏菌(kurthiahuakuiilam0618)，發(fā)明人將所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶命名為aiik。所述aiik是首次在kurthia屬中發(fā)現(xiàn)，aiik可以通過催化n-酰基高絲氨酸內(nèi)酯的內(nèi)酯鍵水解使銅綠假單胞菌之間的信號分子猝滅從而干擾和抑制群感效應(yīng)。aiik與其他n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比具有更廣泛的底物適應(yīng)性和更高效的降解活性，使其在作為藥物治療銅綠假單胞菌感染的過程中具有更好的效果。本公開的其他特征和優(yōu)點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明附圖是用來提供對本公開的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實施方式一起用于解釋本公開，但并不構(gòu)成對本公開的限制。在附圖中：圖1是aiik蛋白純化效果分析圖；其中m為蛋白質(zhì)marker，1為對照組超聲破碎后上清，2為aiik組超聲破碎后沉淀，3為aiik組超聲破碎后上清，4為超濾后的aiik蛋白。圖2是生物膜的吖啶橙染色后熒光顯微鏡觀察圖；其中左上角為加入0μg/ml的aiik后生物膜的生長情況圖，右上角為加入5μg/ml的aiik后生物膜的生長情況圖，下方為加入10μg/ml的aiik后生物膜的生長情況圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。本公開第一方面提供了一種n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶，所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶氨基酸序列與seqidno.1所示的序列至少90％同源并且具有n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性。通過上述技術(shù)方案，本公開所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶來源于保藏號為accc06121的華癸庫特氏菌(kurthiahuakuiilam0618)，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。發(fā)明人將所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶命名為aiik。所述aiik是首次在kurthia屬中發(fā)現(xiàn)，aiik可以通過催化n-?；呓z氨酸內(nèi)酯的內(nèi)酯鍵水解使銅綠假單胞菌之間的信號分子猝滅從而干擾和抑制群感效應(yīng)。aiik與其他n-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶相比具有更廣泛的底物適應(yīng)性和更高效的降解活性，使其在作為藥物治療銅綠假單胞菌感染的過程中具有更好的效果。根據(jù)本公開第一方面，為了使所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶保持更好的活性與底物適應(yīng)性，所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶氨基酸序列與seqidno.1所示的序列至少95％同源并且具有n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶活性；優(yōu)選地，所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶氨基酸序列與seqidno.1所示的序列至少98％同源并且具有n-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶活性。本公開第二方面提供了一種編碼如上所述n-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶的核苷酸序列。根據(jù)本公開第二方面，為了獲得更高的表達效率，所述核苷酸序列如seqidno.2所示。本公開第三方面提供了一種包含如上所述核苷酸序列的表達載體。所述表達載體可以用于轉(zhuǎn)入基因工程菌株中以便獲得更高的aiik表達量，使其可以被工業(yè)化生產(chǎn)與利用。根據(jù)本公開第三方面，為了使所述表達載體具有較高的表達效率，所述核苷酸序列如seqidno.2所示，所述載體為pet32a。本公開第四方面提供了一種表達如上所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的菌株，所述菌株中具有如上所述的表達載體。所述菌株可以本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的各種適用于表達異源蛋白的菌株，例如釀酒酵母、大腸桿菌，本公開對此沒有特別的限制。根據(jù)本公開第四方面，為了使所述aiik具有較高的表達效率，在使用seqidno.2所示的核苷酸序列與pet32a載體進行轉(zhuǎn)化獲得較好的表達效果時，所述菌株可以為大腸桿菌bl21(escherichiacolibl21)菌株。本公開第五方面提供了一種含有如上所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶的藥物，所述藥物能夠治療銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)感染。根據(jù)本公開第五方面，所述n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶對于銅綠假單胞菌的群感猝滅具有良好的效果；所述藥物用于治療銅綠假單胞菌時需將所述藥物與銅綠假單胞菌直接接觸。以下通過實施例進一步詳細說明本發(fā)明。實施例1本實施例用于說明aiik蛋白的純化過程。以保藏號為accc06121的華癸庫特氏菌dna為擴增模板，使用如seqidno.3和seqidno.4的引物對進行擴增得到擴增產(chǎn)物；使用ecori和hindⅲ內(nèi)切酶對擴增產(chǎn)物進行酶切并克隆至表達載體pet32a中，得到pet32a-aiik原核表達質(zhì)粒；將上述pet32a-aiik原核表達質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌bl21細胞中，得到e.colibl21/pet32a-aiik原核表達菌株。將所述e.colibl21/pet32a-aiik原核表達菌株于lb培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中37℃、180r/min條件下振蕩培養(yǎng)至od600≈0.6，加入終濃度為0.5mm的iptg，25℃、120r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h獲得培養(yǎng)產(chǎn)物。對照組為e.colibl21/pet32a原核表達菌株同樣條件下培養(yǎng)12h獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物；非變性條件下純化所述培養(yǎng)產(chǎn)物獲得aiik蛋白。非變性條件下6×his標簽重組aiik蛋白的純化方法參考qiaexpressni-ntafaststarthandbook手冊操作，利用ni-nta柱親和純化蛋白，洗脫液經(jīng)10mmpbs(ph7.5)緩沖液反復(fù)超濾，脫鹽和除去咪唑。sds-page電泳分析aiik蛋白純化結(jié)果。經(jīng)圖1中對照組超聲破碎后的上清液、aiik組超聲破碎后沉淀、aiik組超聲破碎后的上清液與純化后的aiik酶液比較可以看出目的蛋白aiik已經(jīng)純化成功。實施例2本實施例測定25℃時aiik的酶活力。本實施例中以n-癸?；呓z氨酸內(nèi)酯(c10-hsl)為底物測定酶活力。按反應(yīng)體系(n-hsl2.5μl，aiik的終濃度4μg/ml，加10mmpbs到總體積500μl)將各成分加入2ml離心管混勻，于25℃反應(yīng)10min，空白對照組以10mmpbs代替aiik蛋白，反應(yīng)完后向所述離心管中立即加入體積55.5μl濃度為20％的sds(終濃度為2％)終止反應(yīng)；向所述離心管中加乙酸乙酯漩渦萃取反應(yīng)產(chǎn)物，萃取的反應(yīng)產(chǎn)物在流氮下濃縮吹干，再復(fù)溶于甲醇，過0.22μm的濾膜后hplc測定c10-hsl的含量并計算酶活力。酶活力單位(u)為每分鐘降解1μmolc10-hsl所需的酶量。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)25℃時，經(jīng)純化的aiik蛋白的比酶活為0.35u/mg。實施例3本實施例測定以及溫度和其他酶對于aiik酶活力的影響。按照實施例2中所述的方法分別測定aiik在37℃和45℃保溫2h、4h、6h、12h、24h、36h后的酶活(以0h時的酶活為100％計)，具體結(jié)果見表1。按照實施例2中所述的方法分別測定糜蛋白酶、胰蛋白酶或蛋白酶k分別處理aiik蛋白30min、60min時對于aiik酶活力的影響。對照組使用以10mmpbs代替糜蛋白酶并將酶活力計為100％。具體結(jié)果見表2。表10h1h2h4h6h12h24h36h48h37℃100.0％95.0％89.6％84.8％54.6％52.4％20.4％15.4％8.9％45℃100.0％93.4％86.0％83.8％52.9％40.4％14.9％10.5％10.1％表2pbs糜蛋白酶胰蛋白酶蛋白酶k30min100.0％87.3％103.3％102.4％60min100.0％101.3％109.1％108.1％表1中aiik蛋白于37℃和45℃條件下保溫2h時，酶活都保持在86％以上，6h時酶活保持在52％以上，24h時酶活保持在14％以上；表2中，aiik在糜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶k的作用下酶活力穩(wěn)定性良好，只有在在糜蛋白酶處理30min時，aiik活性下降了13％，其他條件下aiik活性都有升高，同時在同一蛋白酶處理60min后的aiik活性比處理30min的高。本公開中所述的n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶在所測試的溫度與所測試的其他酶的影響下具有良好的穩(wěn)定性。實施例4本實施例用于測定aiik對于銅綠假單胞菌生物膜形成的影響。先將銅綠假單胞菌菌株pao1預(yù)培養(yǎng)于tsb培養(yǎng)基并在37℃、150rpm條件下過夜培養(yǎng)，然后離心收集菌體并用無菌10mmpbs漂洗3次，接著將菌體懸浮于m9培養(yǎng)基使菌體密度達到od600≈0.2；將懸浮物分別與0μg/ml、5μg/ml或10μg/mlaiik混合得到pao1細胞/aiik混合培養(yǎng)物。取200μlpao1細胞/aiik混合培養(yǎng)物加入96孔板中于37℃靜置培養(yǎng)24h。培養(yǎng)完全后吸取懸浮細胞測定od600(游離細胞數(shù)量)，同時將96孔板底部中的細胞用20μl濃度為0.2％的結(jié)晶紫染色15min，后用無菌水清洗細胞3次，觀察pao1生物膜的完整程度。最后加入100μl濃度為95％的乙醇萃取剩余結(jié)晶紫并測定od590(形成生物膜的細胞數(shù)量)，具體結(jié)果見表3。另取2mlpao1細胞/aiik混合培養(yǎng)物加入無菌pa瓶中，并在pa瓶中放入無菌的5×5mm載玻片，后將pa瓶置于37℃靜置培養(yǎng)24h。最后取出載玻片用濃度為0.1％吖啶橙染色2.5min后置于熒光顯微鏡(激發(fā)光490nm，發(fā)射光525nm)下觀察生物膜細胞的緊密程度，具體結(jié)果見圖1。表30μg/mlaiik5μg/mlaiik10μg/mlaiik游離細胞數(shù)量(od600)0.530.480.54生物膜細胞數(shù)量(od590)0.910.620.54經(jīng)表3中各濃度aiik下生物膜細胞數(shù)量的比較可以看出，隨著aiik使用量的增多對于pao1生物膜的形成越來越差，添加10μg/mlaiik對于pao1生物膜形成的抑制率達到40％左右，并且經(jīng)圖1中各生物膜比較可以看出添加10μg/mlaiik使pao1的生物膜細胞的數(shù)量和緊致程度都明顯降低，并且生物膜的完整度下降。aiik具有使銅綠假單胞菌之間的信號分子猝滅從而干擾和抑制群感效應(yīng)，最終導(dǎo)致pao1致病性和生物膜抗藥性降低。實施例5本實施例用于測定aiik對pao1胞外蛋白酶水解活性的影響。將pao1菌株分別接種于含有分別與0μg/ml、5μg/ml或10μg/mlaiik的pb培養(yǎng)基中，并于37℃、150rpm條件下培養(yǎng)24h；測定培養(yǎng)物在590nm處的吸光值。離心培養(yǎng)物獲得上清液檢測pao1胞外蛋白酶水解活性；所述檢測pao1胞外蛋白酶水解活性的反應(yīng)體系包含150μl上清液、250μl濃度為2％偶氮酪蛋白溶液，將所述反應(yīng)體系于37℃反應(yīng)30min，然后加1.2ml濃度為10％三氯乙酸終止反應(yīng)；離心反應(yīng)產(chǎn)物獲得的1.2ml上清液，將所述上清液和1.2ml濃度為1m的naoh混勻后測定440nm處吸光值。以od415/od590表示pao1胞外蛋白酶水解活性。以加入0μg/mlaiik的組為對照組，其pao1胞外蛋白水解酶的活性計為100％，加入5μg/mlaiik的組pao1胞外蛋白水解酶的活性為79％，加入5μg/mlaiik的組pao1胞外蛋白水解酶的活性為52.7％。胞外蛋白水解酶持續(xù)作用造成患處的潰爛、阻止患處的愈合，aiik可以顯著抑制pao1胞外蛋白水解酶的活性，使其生物膜的形成受阻，抑制pao1的致病性。實施例6本實施例用于測定aiik對pao1綠膿菌素產(chǎn)生的影響。分別接種pao1在加入0μg/ml、5μg/ml或10μg/mlaiik的pb培養(yǎng)基中，并在37℃、150rpm條件下培養(yǎng)18h。離心所述培養(yǎng)產(chǎn)物得到上清液，將5ml的上清液與3ml氯仿混勻后再加入1ml濃度為0.2m的hcl反萃取得到萃取產(chǎn)物。測定萃取產(chǎn)物在520nm處的吸光值，綠膿菌素的濃度表示為od520×17.072，具體結(jié)果見表4。表4aiik使用量(μg/ml)od520綠膿菌素產(chǎn)量(μg/ml)00.223±0.0133.807±0.22250.207±0.0113.534±0.188100.064±0.0071.092±0.120經(jīng)表4中各組比較可以看出，aiik能夠抑制綠膿菌素的合成顯示aiik抑制了pao1的群感效應(yīng)，使其綠膿菌素的表達量下降。aiik可以使銅綠假單胞菌之間的信號分子猝滅從而干擾和抑制群感效應(yīng)。aiik與其他n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶相比具有更廣泛的底物適應(yīng)性和更高效的降解活性，使其在作為藥物治療銅綠假單胞菌感染的過程中能夠有更好的效果。以上結(jié)合附圖詳細描述了本公開的優(yōu)選實施方式，但是，本公開并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本公開的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本公開的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本公開的保護范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本公開對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本公開的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本公開的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本公開所公開的內(nèi)容。sequencelisting<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所<120>一種n-?；呓z氨酸內(nèi)酯酶及其藥物<130>1537caas<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>278<212>prt<213>kurthiahuakuii<400>1metcysglnasnlyslysleutyrvalleuaspthrglythrmetlys151015metasplysasntyrmetilealamethisasnproalathrileasp202530alaprothrlysproalagluphevalglupheprovaltyralaval354045leuileasphisprogluglylysileleupheaspthrglycysasn505560proaspsermetasngluaspglyprotrpprogluglyileargarg65707580alapheprothrphealathrgluglucystyrleuileasnargleu859095gluglnleulysvalargprogluaspilelystyrvalvalalaser100105110hisleuhisleuasphisalaglycysleugluleuphethrasnala115120125gluileilevalhisaspalagluleualaservalmetlysserphe130135140alametthrargaspmetglyalatyriletrpalaaspvalmetser145150155160trpvalglnlysglnleuargtrpargthrvallysvaltrpglnlys165170175gluleuglnleuvalgluglyilelysileileasnpheglyprogly180185190hisalatyrglymetleuglyleuhisvalgluleuproglytyrgly195200205asnvalleuleualaseraspalavaltyrthrlysglusertyrgly210215220proproilelysproproglyileleutyraspservalglytyrasn225230235240glnthrvalgluargilehisglnphealahisgluhislysserglu245250255valtrppheglyhisaspalagluglnphelysserphearglysser260265270thrgluglytyrtyrglu275<210>2<211>837<212>dna<213>kurthiahuakuii<400>2atgtgtcaaaataaaaagttgtacgtattagatacagggacgatgaaaatggacaaaaat60tacatgattgcgatgcataatccagcaacaattgatgcacctacaaagccagcagaattt120gtagaatttccggtttacgctgtactaatcgatcatccagaagggaaaattttgtttgat180acagggtgtaatcccgacagtatgaatgaggatggaccatggccagaggggatacgacgt240gcgtttccgacatttgcgacagaggaatgttatttaattaatcgtttagaacaactaaag300gtgcggccagaggatattaagtatgtcgtagcatcgcatttgcatttggaccatgcgggt360tgtttagagttatttacgaatgctgaaattatcgtccatgacgcagaacttgcgagtgtg420atgaaatcttttgcgatgacgcgagatatgggggcgtatatttgggcagacgtcatgagt480tgggtacaaaaacaattgcgctggcgcacggttaaggtgtggcaaaaagaactacagctt540gtcgaaggcattaaaattattaactttggaccgggccacgcgtatggtatgttagggctg600catgtagagttaccgggatatggtaacgtgctcctcgcgtccgatgcggtttacacaaaa660gagtcgtatggaccgccaattaagccgccgggtattttgtatgactcggttggttacaat720caaacggttgaacgtattcatcaatttgcacacgagcataagagtgaagtttggtttggg780cacgatgctgagcaatttaaatcgtttagaaaatcaacggaagggtattacgaataa837<210>3<211>33<212>dna<213>artificialseqence<220><223>thissequenceissynthesizedinlab.<400>3ccggaattcatgtgtcaaaataaaaagttgtac33<210>4<211>33<212>dna<213>artificialsequence<220><223>thissequenceissynthesizedinlab.<400>4cccaagcttttattcgtaatacccttccgttga33當(dāng)前第1頁12