本發(fā)明涉及一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖胺聚糖(glycosaminoglycan，gag)是重復(fù)二糖單位組成的直鏈線性多糖。二糖單位由己糖胺(n-乙酰氨葡萄糖胺/n-乙酰半乳糖胺)和己糖醛酸(d-葡萄糖醛酸/l-艾杜糖醛酸)或d-半乳糖通過糖苷鍵連接組成。gag早期又稱粘多糖，結(jié)構(gòu)中含有硫酸基和(或)羧基，帶負電荷，具有聚陰離子特性。

根據(jù)是否發(fā)生硫酸化，糖胺聚糖可分為硫酸化和非硫酸化兩大類。非硫酸化gag，主要指透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，ha)；硫酸化gag，包括硫酸軟骨素/硫酸皮膚素(chondroitinsulfate/dermatansulfate，cs/ds)，肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/heparansulfate，hep/hs)，硫酸角質(zhì)素(keratansulfate，ks)三大類。其中硫酸角質(zhì)素不含己糖醛酸，重復(fù)二糖單位由d-半乳糖和己糖胺組成，而其它gag的重復(fù)二糖單位均由己糖醛酸和己糖胺組成。透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)相對簡單，由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺組成的二糖單位經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接而成；其它糖胺聚糖則由于各種修飾酶的作用使糖鏈變得異常復(fù)雜，主要表現(xiàn)在糖鏈中不同部位羥基(-oh)和氨基(-nh2)的硫酸化，d-葡萄糖醛酸在c5-差向異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閘-艾杜糖醛酸以及己糖胺二位氨基的乙?；取Ｌ前肪厶翘擎溄Y(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性不是隨機發(fā)生的，而是具有高度的時空特異性，是各種糖鏈合成相關(guān)酶在不同細胞組織和器官的不同發(fā)育階段表達調(diào)控水平所致，不同的結(jié)構(gòu)使其具有不同的功能，結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性賦予其功能的多樣性。

gag是蛋白聚糖(proteoglycan，pg)的多糖側(cè)鏈，廣泛分布于動物組織的細胞外基質(zhì)和細胞表面，通過與一系列蛋白相互作用參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，傷口修復(fù)，病毒侵染，組織形態(tài)發(fā)生，信號傳導(dǎo)，細胞分裂等多種生理和病理過程[1-3]。糖胺聚糖所具有的一系列重要的生物學(xué)功能使其成為重要的生物活性分子，在醫(yī)藥及功能食品中得到廣泛應(yīng)用，如肝素、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸等[4,5]。但由于糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的不均一性，特別是硫酸化糖胺聚糖結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性，使不同來源和不同批次的同一種糖胺聚糖在活性上存在很大差異[6]。近年來的大量研究表明，糖胺聚糖的生物功能是通過多糖鏈中具有特殊結(jié)構(gòu)的功能區(qū)與特定蛋白的特異相互作用來實現(xiàn)的，同一多糖鏈中存在不同結(jié)構(gòu)的功能區(qū)，與不同的蛋白相互作用可以行使不同的功能，因此可以通過選擇性部分降解糖胺聚糖多糖鏈，制備結(jié)構(gòu)均一或相對均一的特定功能區(qū)寡糖用于醫(yī)藥及功能食品，該類產(chǎn)品不但結(jié)構(gòu)和活性確定，而且還由于分子量小利于吸收而大大提高了利用率。

糖胺聚糖降解酶是研究糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系和制備生物活性寡糖的重要工具酶，主要包括微生物來源的裂解酶系和動物來源的水解酶系。根據(jù)底物的不同可分為透明質(zhì)酸酶、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素降解酶、肝素/硫酸乙酰肝素降解酶、硫酸角質(zhì)素降解酶四大類。在動物體內(nèi)一直未發(fā)現(xiàn)專一的硫酸軟骨素/硫酸皮膚素降解酶家族，越來越多的研究顯示哺乳動物體內(nèi)硫酸軟骨素/硫酸皮素的降解主要是由透明質(zhì)酸酶家族的一些酶來完成的，最近透明質(zhì)酸酶家族成員hyal4被鑒定為一個硫酸軟骨素水解酶[7]。微生物來源的糖胺聚糖降解酶，由于活力高，性質(zhì)穩(wěn)定，易于重組表達，適合大規(guī)模制備等特點，具有重要的應(yīng)用價值。

目前，可以利用的商品化糖胺聚糖降解酶極為有限，就硫酸軟骨素降解酶(csase)而言，主要包括proteusvulgaris來源的csaseabc，其具有廣泛的底物降解活性，既可以降解ha又可以降解cs和ds[8]，進一步研究表明商品化csaseabc包含兩種酶，內(nèi)切型csaseabci和外切型csaseabcii；csaseac對gag鏈中g(shù)lcua殘基c5位的差向異構(gòu)化非常敏感，故只能降解ha和cs，目前商品化的csaseac主要包括flavobacteriumheparinulm來源的內(nèi)切型csaseaci[9]和arthrobacteraurescens來源的外切型csaseacii[10]；而flavobacteriumheparinum來源的csaseb是高度專一性硫酸皮膚素降解酶，對硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸均無降解活性[11]。利用各種糖胺聚糖降解酶所具有的不同底物選擇性和降解產(chǎn)物多樣性，可以對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖胺聚糖進行組成結(jié)構(gòu)和功能研究，結(jié)合各種分離分析手段對多糖鏈中與靶蛋白結(jié)合的特定功能區(qū)進行鑒定，并最終用于高活性藥用及功能寡糖的酶法制備，但是目前所鑒定的為數(shù)不多的糖胺聚糖降解酶還遠遠不能滿足復(fù)雜糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系研究和結(jié)構(gòu)特異活性寡糖制備的需要。

來自魷魚軟骨的cs-e是富含eunit(4glcuaβ1-3galnac(4s,6s))的硫酸軟骨素，其多糖鏈中eunit的含量達到40-60％，eunit的n-乙酰-d-氨基半乳糖的4位和6位發(fā)生硫酸化，帶有高負電荷，使其具有特定的分子結(jié)構(gòu)。這種富含高硫酸化二糖的cs可以與生長因子結(jié)合促進神經(jīng)突生長[12,13]；同時這種特性更利于與細胞因子、趨化因子等特異性結(jié)合，以調(diào)節(jié)各種生理和病理過程[14]。硫酸軟骨素e多糖，擁有其它種類硫酸軟骨素所不具備的獨特藥理活性。當用于抗單皰疹病毒時，其引起過敏的可能性比激素類藥物低[15]；高硫酸化的cs-e可抑制神經(jīng)元細胞死亡[16]、促進神經(jīng)突增生、抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移、抑制雌激素缺乏誘發(fā)的骨質(zhì)疏松[17,18]；這些研究表明cs-e可以作為新型糖胺聚糖類藥物研發(fā)的前體。通過選擇性酶解作用，去除cs-e中的非硫酸化和低硫酸化片段，制備富含eunit的寡糖，更有利于增強cs對癌癥、病毒感染、神經(jīng)痛等相關(guān)疾病的預(yù)防、治療效果。因此制備結(jié)構(gòu)均一或相對均一，活性確定，富含eunit的cs-e寡糖對于醫(yī)藥研發(fā)尤為重要。可是，長期以來始終缺乏在降解過程中可以選擇性保留富含eunit寡糖片段的糖胺聚糖降解酶。

中國專利文獻cn103923857a(申請?zhí)?01410159983.3)公開了一株弧菌fc509菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。該菌株于2014年03月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號cgmccno.8913，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。該發(fā)明首次分離得到的弧菌(vibriosp.)fc509菌株，可以制備糖胺聚糖裂解酶，該酶對透明質(zhì)酸的比活為110,000u/mg、對硫酸軟骨素的比活為45,000u/mg；酶活力是已知商品化糖胺聚糖裂解酶的幾十到上百倍，可應(yīng)用于醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用。

一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶，氨基酸序列如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如seqidno.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或一個以上氨基酸且具有糖胺聚糖裂解酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述氨基酸序列(b)如seqidno.3或seqidno.4所示。

一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶的編碼基因，核苷酸序列如(i)或(ii)所示：

(i)核苷酸序列如seqidno.1所示；

(ii)在嚴格條件下與(i)限定的dna序列雜交且編碼具有糖胺聚糖裂解酶活性的蛋白質(zhì)的dna分子。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述核苷酸序列(ii)中所述嚴格條件下，是指：

在含質(zhì)量濃度0.5％sds的6×ssc緩沖液中，在65℃下雜交，然后用含質(zhì)量濃度0.1％sds的2×ssc緩沖液和含質(zhì)量濃度0.1％sds的1×ssc緩沖液各洗膜一次。

根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述核苷酸序列(ii)如seqidno.5或seqidno.6所示。

一種重組表達載體，在表達載體中插入了上述難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。

上述表達載體選自大腸桿菌表達載體、酵母表達載體、枯草桿菌表達載體、乳酸菌表達載體、鏈霉菌表達載體、噬菌體載體、絲狀真菌表達載體、植物表達載體、昆蟲表達載體或哺乳動物細胞表達載體。

一種重組細胞，在細胞中插入了上述難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶的編碼基因。

上述細胞選自大腸桿菌宿主細胞、酵母菌宿主細胞、枯草桿菌宿主細胞、乳酸菌宿主細胞、放線菌宿主細胞、絲狀真菌宿主細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

用于重組表達糖胺聚糖裂解酶hclaseei的重組細胞，選自大腸桿菌宿主細胞(如escherichiacolibl21、escherichiacolijm109、escherichiacolidh5α等)、酵母菌宿主細胞(如saccharomycescerevisiae、pichiapastoris、kluyveromycesiactis等)、枯草桿菌宿主細胞(如bacillussubtilisr25、bacillussubtilis9920等)、乳酸菌宿主細胞(如lacticacidbacteriac0cc101等)、放線菌宿主細胞(如streptomycesspp.等)、絲狀真菌宿主細胞(如trichodermaviride,trichodermareesei,aspergillusniger、aspergillusnidulans等)、昆蟲細胞(如bombyxmori,antharaeaeucalypti等)或哺乳動物細胞(如中國倉鼠卵巢細胞cho，幼小倉鼠腎臟細胞bhk、中國倉鼠肺細胞chl等)。

上述難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶做為增強藥物的吸收或遞送成分在制備藥物中的應(yīng)用。

一種利用難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei降解魷魚來源的硫酸軟骨素cs-e制備結(jié)構(gòu)相對均一的不同聚合度寡糖中的應(yīng)用。

上述結(jié)構(gòu)相對均一的不同聚合度寡糖在制備抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。

有益效果

1、本發(fā)明從海洋微生物基因組中發(fā)現(xiàn)和鑒定了一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶(hclaseei)，該酶可以降解ha、牛軟骨來源的cs-a、鯊魚軟骨來源的cs-c和cs-d產(chǎn)生二糖終產(chǎn)物，但只能部分降解cs-e產(chǎn)生大量富含eunit的高分子量寡糖；經(jīng)檢測，該酶對透明質(zhì)酸的比活為13.8u/mg、對cs-a、cs-c、cs-d、cs-e的比活分別是7.2、6.7、5.9、5.3u/mg。

2、本發(fā)明首次利用難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶(hclaseei)以低硫酸化的cs-e多糖為底物制備出系列結(jié)構(gòu)相對均一的不同聚合度寡糖，其eunit含量遠遠高于cs-e多糖，且其中的高聚合度寡糖可以顯著抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，可應(yīng)用于醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景；且為酶解制備富含eunit的cs-e活性寡糖提供了重要工具酶。

附圖說明

圖1、糖胺聚糖裂解酶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型；

圖2、難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei表達及純化情況的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(sds-page)；

其中：m、蛋白質(zhì)分子量標準，條帶自上至下大小為116kd，66.2kd，45kd，35kd，25kd，18.4kd，14.4kd；泳道1、對照菌株破壁前菌體，上樣量6μl，泳道2、重組菌破壁后菌液，上樣量6μl，泳道3、重組菌破壁后上清，上樣量6μl，泳道4、經(jīng)鎳柱純化的hclaseei，上樣量6μl。

圖3、pη值對難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei的活性影響曲線；

圖4、溫度對難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei的活性影響曲線；

圖5、溫度對難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei的穩(wěn)定性影響曲線；

圖6、金屬離子對難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei活性的影響柱形圖；

圖7、難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei降解商品化ha(a)和cs-a(b)、cs-c(c)、cs-d(d)、cs-e(e)終產(chǎn)物的hplc分析圖；

圖中：1：二硫酸化二糖，2：單硫酸化二糖，3：非硫酸化二糖；

圖8、難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei不同時間降解cs-a所得產(chǎn)物的hplc分析圖；

圖中：1：四糖，2：單硫酸化二糖，3：非硫酸化二糖；

圖9、難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei降解低硫酸化cs-e所得終產(chǎn)物的hplc分析圖；

圖10、難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶hclaseei降解cs-e制備的寡糖抗腫瘤效果分析；

圖11、三個酶降解商品化cs-e的比較曲線圖；

圖中：1：二硫酸化二糖，2：單硫酸化二糖。

具體實施方式

以下實施例的闡述，是為了全面公開本發(fā)明如何實施的一些常用技術(shù)，而不是為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。發(fā)明人已經(jīng)盡最大努力確保實施例中個參數(shù)的準確性(例如量，溫度，等等)，但是一些實驗誤差和偏差也應(yīng)該予以考慮。除非另有說明，本發(fā)明中分子量是指重均分子量，溫度是攝氏度。

生物材料來源

弧菌(vibriosp.)fc509為現(xiàn)有已知菌株，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號cgmccno.8913。

實施例1、弧菌(vibriosp.)fc509菌株基因組dna的提取

將弧菌(vibriosp.)fc509菌株接種至液體培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm的條件下，振蕩培養(yǎng)至od600＝0.8；取培養(yǎng)菌液40ml，在12,000rmp條件下離心25min，收集菌體沉淀，用20ml的溶菌酶緩沖液(10mmtris-hclph8.0)洗滌，在12,000rmp條件下離心25min，收集菌體沉淀。

上述菌體沉淀中，每管加入溶菌酶緩沖液12.0ml，得到約14.0ml的菌液，分別加入濃度為20mg/ml的溶菌酶各560μl，其終濃度約800μg/ml；冰浴1.0h后，37℃溫浴2h，至溶液粘稠；加入10wt％的sds0.82ml，100mg/ml的蛋白酶k溶液60μl，52℃水浴1.0h；加入tris-平衡過的酚/氯仿/異戊醇(體積比25：24：1)15ml，輕輕顛倒混勻，至充分乳化；10,000g、4℃條件下離心10min，轉(zhuǎn)移上清，加入2.0ml的naac-hac(ph5.2，3.0m)緩沖液，以及17.0ml的無水乙醇，混勻；用1.0ml的槍頭挑出絲狀dna，轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep離心管中，以體積百分比70％乙醇溶液(貯于-20℃)，洗滌2次，微離心后棄上清；10,000g、4℃條件下離心3min，徹底棄掉上清；樣品于無菌工作臺中，酒精燈下風吹干燥；用無菌去離子水重懸溶解dna樣品，4℃過夜，得到大分子量基因組dna。

上述液體培養(yǎng)基每升組分如下：

胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、nacl30g、kh2po43g、k2hpo47g、(nh4)2so42g、mgso4·7h205mg、feso4·7h202mg，ph值為7.2。

實施例2、弧菌(vibriosp.)fc509菌株基因組掃描及其序列分析。

將實施例1制得的大分子量基因組dna進行測序(美吉生物公司)。用ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上的軟件對測序結(jié)果進行分析。所用到的ncbi分析軟件是openreadingframefinder(orffinder,http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和basiclocalalignmentsearchtool(blast,http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)。

ncbi分析結(jié)果顯示vibriosp.fc509菌株基因組上攜帶一個糖胺聚糖裂解酶基因hclaseei，該基因編碼區(qū)長2973bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示。與vibriovulnificus的全基因組序列中chondroitinase基因(ncbi序列號：wp039547743.1)的238個氨基酸有36％的同源性。

hclaseei由990個氨基酸組成，其氨基酸序列如seqidno.2所示，蛋白質(zhì)的理論分子量約為107kd。用simplemodulararchitectureresearchtool(smart,http://smart.embl_heidelberg.de/)分析糖胺聚糖裂解酶hclaseei的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果顯示n端第1至第21個氨基酸是信號肽序列，第23-702位氨基酸序列屬于糖胺聚糖裂解酶超家族。用swiss-model同源建模服務(wù)器(http://swissmodel.expasy.org)對糖胺聚糖裂解酶hclaseei的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行同源建模，最終得到的hclaseei蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示。

實施例3、rhclaseei的基因在大腸桿菌中的重組表達

以實施例1制得的大分子量基因組dna為模板，進行pcr擴增。

引物如下：

正向引物hclaseei-f：gggaattccatatgataatcaaagaagtcgaaaatc；

反向引物hclaseei-r：ccgctcgagtttcaccggctcttgcaac；

正向引物下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶ndei，反向引物下劃線標注的是限制性內(nèi)切酶xhoi位點。primerstarhsdna聚合酶購自寶生物公司，pcr反應(yīng)體系按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。

pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性10s，68℃退火2.5min，30個循環(huán)；72℃延伸10min。

將pcr產(chǎn)物用ndei和xhoi雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的pcr產(chǎn)物。將購于美國novagen公司的產(chǎn)物pet-30a載體用ndei和xhoi雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切載體大片段。ndei和xhoi均購于寶生物公司，酶與底物反應(yīng)的體系、溫度和時間均按照公司提供的產(chǎn)品說明操作。

將經(jīng)過雙酶切的pcr產(chǎn)物與同樣經(jīng)過雙酶切pet-30a載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α菌株后涂布于含有50μg/ml卡那青霉素的luria-bertani培養(yǎng)基固體平板(按常規(guī)技術(shù)配制)上，37℃培養(yǎng)14h，挑取單克??；將單克隆接入含有50μg/ml卡那青霉素的液體luria-bertani培養(yǎng)基(按常規(guī)技術(shù)配制)中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；將質(zhì)粒用正向引物hclaseei-f和反向引物hclaseei-r進行菌液pcr驗證，結(jié)果得到大小正確的擴增產(chǎn)物，初步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確；重組質(zhì)粒測序結(jié)果表明，在pet-30a的ndei和xhoi酶切位點之間插入seqidno.1所示的hclaseei基因，且插入方向正確，所以進一步證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒正確，將該重組質(zhì)粒命名為pet30a-hclaseei。

將pet30a-hclaseei轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株bl21(de3)(購自美國novagen公司)，然后按照該公司提供的操作步驟進行重組糖胺聚糖裂解酶hclaseei誘導(dǎo)表達。并用nisepharose6fastflow(ge)凝膠對hclaseei進行純化，純化條件按照ge公司的產(chǎn)品手冊操作。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測重組糖胺聚糖裂解酶hclaseei的純化情況，結(jié)果如圖2所示，純化后的重組糖胺聚糖裂解酶hclaseei在電泳膠上呈單一條帶，且位置與預(yù)測的分子量相吻合。

實施例4、重組糖胺聚糖裂解酶hclaseei的酶學(xué)性質(zhì)分析

ph和溫度對酶活性的影響

將質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、hclaseei酶液、不同ph值的150mmhac-naac、nah2po4-na2hpo4、tris-hcl緩沖液以及水(ph范圍為5.0～10.0)，按2：1：3：4(體積比)的比例混合后，在30℃反應(yīng)60min，按前述的紫外法測酶活力。結(jié)果顯示hclaseei在ph8.0時達到最大活力，表明hclaseei的最適反應(yīng)ph為8.0(如圖3)。

在最適ph下，將質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、hclaseei酶液、150mmtris-hcl緩沖液和水(ph8.0)按2：1：3：4(體積比)的比例混合，分別在不同溫度(0℃～90℃)反應(yīng)10min，按前述的紫外法測酶活力。結(jié)果顯示hclaseei在30℃時達到最大活力，表明hclaseei的最適反應(yīng)溫度為30℃(如圖4)。

溫度對酶穩(wěn)定性的影響

將在30℃下熱處理不同時間后的hclaseei酶液與質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物溶液按2：3(體積比)的比例混合，然后在最適溫度和最適ph下測定剩余酶活，以不經(jīng)過熱處理的酶液酶活定義為100％相對活力(relativieactivity)，結(jié)果顯示hclaseei在30℃的溫度下，12h后仍具有大于60％活性(如圖5)。

金屬離子對hclsaeei活性的影響

將質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、hclaseei酶液、150mmtris-hcl緩沖液以及水按2：1：3：4(體積比)的比例混合后，接著向反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子，添加的離子終濃度為5mm，然后在30℃反應(yīng)60min，按前述的紫外法測酶活力。對照組為不加任何金屬離子時hclaseei的活性(設(shè)定為100％)，結(jié)果圖7所示。實驗結(jié)果顯示，li⁺、edta，na⁺k⁺、ca²⁺、mg²⁺對hclaseei活性基本無影響，ag⁺、cu²⁺、co²⁺、ni²⁺、cr³⁺、fe³⁺、fe²⁺、hg²⁺、pb²⁺、zn²⁺等其他離子對酶活呈現(xiàn)抑制作用(圖6)。

實施例5、hclaseei的酶活測定

將質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、hclaseei酶液、150mmtris-hcl緩沖液以及水按2：1：3：4(體積比)的比例混合后，在最適溫度和最適ph下反應(yīng)1～10min，按前述的紫外法測酶活力，同時用購于康為世紀公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒測定hclaseei酶液的蛋白含量，結(jié)果表明重組hclaseei對透明質(zhì)酸的比活為13.8u/mg、對cs-a、cs-c、cs-d、cs-e的比活分別是7.2、6.7、5.9、5.3u/mg。其中底物ha和牛軟骨來源cs-a來自sigma-aldrich、鯊魚軟骨來源cs-c和cs-d購自seikagaku公司，魷魚軟骨來源低硫酸化cs-e根據(jù)中國專利文獻cn105924544a(申請?zhí)?01610323540.2)說明書實施例1的方法制備cs-e(eunit含量為39.3％)。

按上述方法檢測seqidno.3所示的蛋白和seqidno.4所示的蛋白：

seqidno.3所示的蛋白對透明質(zhì)酸的比活為0.09u/mg、對硫酸軟骨素a的比活為0.1u/mg；

seqidno.4所示的蛋白對透明質(zhì)酸的比活為0.07u/mg、對硫酸軟骨素a的比活為0.09u/mg；

酶活力單位定義：每分鐘催化糖胺聚糖產(chǎn)生1μmol不飽和雙鍵所需要的酶量。根據(jù)紫外法測糖胺聚糖裂酶酶活的方法[8]。

實施例6、hclaseei降解糖胺聚糖降解產(chǎn)物的高效液相(hplc)分析

將質(zhì)量濃度為1％透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素底物、hclaseei酶液、150mmtris-hcl緩沖液以及水按2：1：3：4(體積比)的比例混合后，在ph8.0，30℃條件下反應(yīng)，選取不同酶解時間(0、1、2、8、12、24、72h)的產(chǎn)物進行hplc分析。hplc分析條件為凝膠柱：superdexpeptide10/300gl(ge)；流動相：0.2m碳酸氫銨；流速：0.4ml/min；檢測條件：uv232nm。

結(jié)果如圖7和圖8所示，圖7結(jié)果表明hclaseei可以將ha，cs-a，cs-c和cs-d徹底降解為不同硫酸化度二糖，但難于降解魷魚軟骨來源富含eunit的cs-e，預(yù)示著eunit的存在抑制了該酶的活性。對cs-a的時間梯度降解試驗表明，隨著降解時間的延長，產(chǎn)物聚合度逐漸降低，最終轉(zhuǎn)變成二糖(圖8)。該結(jié)果表明hclaseei屬于內(nèi)切糖胺聚糖裂解酶且難于降解富含eunit的cs-e，因此，可被用于糖胺聚糖寡糖特別是富含eunit寡糖的制備以及糖胺聚糖構(gòu)效關(guān)系研究。

實施例7、hclaseei降解cs-e多糖后的高效液相(hplc)及各個組分的二糖分析

將質(zhì)量濃度為1％粗品cs-e、hclaseei酶液、150mmtris-hcl緩沖液以及水按2：1：3：4(體積比)的比例混合后，在ph8.0，30℃條件下反應(yīng)，選取不同酶解時間(0、4、8、12、24、72h)的產(chǎn)物進行hplc分析。hplc分析條件為凝膠柱：superdexpeptide10/300gl(ge)；流動相：0.2m碳酸氫銨；流速：0.4ml/min；檢測條件：uv232nm。

收集組分1～6，脫鹽后用商品化csaseabc降解，降解條件參照說明書，產(chǎn)物進行hplc分析。hplc分析條件為：hplc條件：色譜柱：ymc-packpa-gcolumn，流動相：nah2po4線性洗脫，nah2po4濃度在60min內(nèi)從16mm升到460mm。流速：1ml/min，檢測條件：ex330nm，em420nm。結(jié)果如圖9和表1所示，表1為糖胺聚糖裂解酶hclaseei降解cs-e制備的大于等于四糖的大分子量組分的二糖組成分析：

表1

由表1可以看出hclaseei通過降解cs-e制備的各個組分的寡糖其eunit含量明顯提高，遠遠高于cs-e多糖。

實施例8、不同聚合度寡糖的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的效果

(1)培養(yǎng)腫瘤細胞：乳腺癌細胞株4t1在含10％胎牛血清，100u/ml青霉素、鏈霉素雙抗的dmem培養(yǎng)液中，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)；

(2)收集細胞：離心收集腫瘤細胞用pbs稀釋到2×10⁶個/ml待用；

(3)對balb/c小鼠(8周左右)分別注射pbs、20μgcs-e8糖、20μgcs-e10糖、20μgcs-e12糖，30min后注入200μl腫瘤細胞，3周后解剖小鼠病變部位，統(tǒng)計小鼠體內(nèi)腫瘤個數(shù)，檢驗抗腫瘤效果。結(jié)果如圖10所示，cs-e10糖及更高分子量寡糖具有顯著的抗腫瘤轉(zhuǎn)移效果，并且cs-e10糖效果優(yōu)于cs-e12糖。

實施例9、糖胺聚糖裂解酶hclaseei在藥物中的應(yīng)用

糖胺聚糖裂解酶hclaseei可以用于增強藥物的吸收或/和遞送，包括但不限于經(jīng)過皮膚途徑輔助藥物滲透。示例性的藥物包括皮質(zhì)類固醇如氫化可的松、潑尼松龍、倍氯米松丙酸酯、氟米松、去炎松、氯倍他索丙酸酯等；鎮(zhèn)痛藥和/或抗炎劑如對乙酰氨基酚、甲滅酸、氟芬那酸、雙氯芬酸、雙氯芬酸鈉、阿氯芬酸、羥布宗、保泰松、布洛芬、氟比洛芬、水楊酸、薄荷醇、樟腦、萘普生等；抗高血壓藥如吲哚洛爾、茚諾洛爾、心痛定等；抗生素如青霉素、四環(huán)素、土霉素、新霉素、紅霉素、氯霉素等；麻醉劑如利多卡因、苯佐卡因等以及其他藥物。

通過敷布，紗布，或其它皮膚涂抹途徑施用糖胺聚糖裂解酶。糖胺聚糖裂解酶溶液可以涂敷到合適的敷貼上(如5-6層紗布)。敷貼應(yīng)覆蓋受損區(qū)域，且敷貼本身用蠟紙或繃帶固定。應(yīng)用的制劑的量取決于損傷的面積，通常為5～100iu/cm²。敷貼應(yīng)每天使用12～24小時，連續(xù)使用10～100天。

對于局部使用，溶液，懸浮液，凝膠劑，糊劑，軟膏，乳膏或糖胺聚糖裂解酶的其他配方(有或沒有另外的活性劑，都可以使用)。溶液等配方中包含制藥和化妝品領(lǐng)域用于局部使用可接受的稀釋劑，輔助劑和賦形劑的，這些其它配方主要包括緩沖劑如磷酸鹽，檸檬酸鹽，醋酸鹽和其它有機酸鹽、抗氧化劑如抗壞血酸、肽、蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮，天然的或合成的油；氨基酸如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物，葡萄糖，乳糖，甘露糖或糊精；螯合劑如edta；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；無機鹽，如氯化鈉，和非離子表面活性劑如吐溫、聚乙二醇。

一種優(yōu)選的，糖胺聚糖裂解酶制劑是糖胺聚糖裂解酶hclaseei的凍干粉末懸浮或溶解在含有0.1％～10％蔗糖、1％～20％甘油的溶劑中，溶液的ph保持在6.5～8.5范圍內(nèi)。

糖胺聚糖裂解酶組合物可以通過口服給藥或腸胃外給藥，并且糖胺聚糖裂解酶組合物可以與合適的遞送載體結(jié)合后給藥。

可通過活性化合物與固體賦形劑的組合獲得用于口服使用的糖胺聚糖裂解酶藥物制劑。選擇上述的混合物加入合適的附助劑混合使用。如果需要的話，合適的賦形劑是碳水化合物或蛋白質(zhì)，例如糖、纖維素、牛血清白蛋白等。

糖胺聚糖裂解酶酶與藥物(如氫化可的松，抗生素，維生素)組合。以口服凝膠劑，膏劑，或懸浮液的形式通過靜脈內(nèi)，皮下或肌內(nèi)注射給藥；或以軟膏劑，乳膏劑，面罩局部給藥；以及用作化妝品輔助劑，用于增強皮膚的吸收。

實驗例10

利用中國專利文獻cn103923857a(申請?zhí)?01410159983.3)中制備的糖胺聚糖裂解酶-hclase及商品化購買的csaseabc，以及本發(fā)明實施例制備的hclaseei在各自最優(yōu)的條件下充分降解商品化cs-e(eunit含量為61％)，利用hplc根據(jù)紫外吸收檢測反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果如圖11所示，通過結(jié)果可以看出，hclase和商品化csaseabc均可以完全降解cs-e產(chǎn)生二糖。

由上可以看出，本申請中所述hclaseei難以降解商品化cs-e，卻可以一定程度地降解低硫酸化的cs-e(圖9)，說明eunit可能抑制hclaseei活力，難以降解cs-e，尤其富含eunit的cs-e。因此在降解低硫酸化cs-e時聚集了富含eunit的寡糖，這與表1的結(jié)果相符。hclase和商品化csaseabc可完全降解cs-e，雖然可以制備不同分子量的寡糖，卻不能制備富含eunit的寡糖。

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sequencelisting

<110>山東大學(xué)

<120>一種難以降解cs-e的糖胺聚糖裂解酶及其編碼基因與應(yīng)用

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