本發(fā)明屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

β-葡萄糖苷酶是廣泛存在于自然界中的一類水解酶，它能夠水解糖苷和寡糖中非還原性末端的β-糖苷殘基從而釋放葡萄糖和相應(yīng)的配基。另外，β-葡萄糖苷酶可催化逆水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，并合成相應(yīng)的糖苷類化合物。隨著糖苷類化合物在醫(yī)藥、食品、日用化工工業(yè)上有著重要的應(yīng)用和經(jīng)濟價值，以及與化學(xué)法相比酶法合成糖苷具有高選擇性、條件溫和、反應(yīng)過程簡單以及環(huán)保等眾多優(yōu)點。因此，利用β-葡萄糖苷酶催化各類糖苷的合成和應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。但是β-葡萄糖苷酶催化各類糖苷的合成反應(yīng)大多數(shù)需要在非水相體系和較高溫度環(huán)境中進(jìn)行，然而，天然β-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性較差、易失活，導(dǎo)致催化效率低，限制了其工業(yè)化應(yīng)用，因而增強β-葡萄糖苷酶的穩(wěn)定性是當(dāng)前急需解決的問題。

交聯(lián)酶聚集體是近些年發(fā)展起來的一種無載體固定化酶技術(shù)。它的制備通常分為沉淀和交聯(lián)兩步，首先利用蛋白沉淀劑(如中性鹽、水溶性有機溶劑、非離子型高聚物等)將溶解狀態(tài)的酶進(jìn)行物理沉淀得到酶沉淀聚集體，隨后利用交聯(lián)劑(例如戊二醛)與酶聚集體分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而得到不溶性固定化酶顆粒。該方法獲得的固定化酶制備過程簡單、酶活保留率高、具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)操作性，但是多次重復(fù)利用后聚集體表面結(jié)構(gòu)容易被破壞而造成酶活損失，在非水相催化過程中酶的穩(wěn)定性也不夠。酶的包埋技術(shù)是借助化學(xué)或者物理的方法將酶固定在某種載體中的過程，載體的形成可以通過化學(xué)的方法(如交聯(lián)、聚合)、物理的方法(物理的凝膠化)或這兩種方法的結(jié)合。酶分子可以通過聚合物形成的凝膠載體而被包埋于其中，從而獲得固定化酶。該方法制備過程簡單、酶活保留率高，但是該方法固定的酶往往穩(wěn)定性不夠而且酶容易滲漏、重復(fù)回收利用率低。

單一的固定化方法常常存在一些缺陷，如上述交聯(lián)聚集體在非水相催化過程中穩(wěn)定性不夠，包埋法中易發(fā)生酶的泄漏和難以回收等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提出一種組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒及其制備方法，通過交聯(lián)-包埋組合式固定化方法制備出一種組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。本發(fā)明首先在油包水乳化體系中制備出顆粒大小均勻的交聯(lián)酶聚集體，然后對交聯(lián)酶聚集體表面進(jìn)行化學(xué)修飾引入碳碳雙鍵基團，最后以乙烯基單體為原料，通過自由基原位聚合制備出一種回收率高且穩(wěn)定性強的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：本發(fā)明提出一種組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒，包括核心與外殼，所述核心為交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體，所述外殼為交聯(lián)的高分子聚合物，所述核心位于外殼內(nèi)部,所述核心與外殼之間通過化學(xué)鍵鏈接。

本發(fā)明還提出一種組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的制備方法，包括以下步驟：

(1)將沉淀劑加入到蛋白濃度為10～50g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩攪拌得到混合液；

(2)向步驟(1)所得混合液中依次加入油相和乳化劑，磁力攪拌乳化1～3min，形成油包水體系后，在4～25℃下沉淀反應(yīng)0.5～1h；

(3)向步驟(2)所得產(chǎn)物中加入交聯(lián)劑，磁力攪拌乳化1～3min，在4～25℃下交聯(lián)反應(yīng)1～3h，將反應(yīng)得到的產(chǎn)物在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10～15min，收集沉淀，用去離子水重復(fù)清洗2～3次，即得交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體；

(4)將步驟(3)得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體和能與β-葡萄糖苷酶表面氨基發(fā)生反應(yīng)的且含有碳碳不飽和雙鍵的酶修飾劑依次加入到ph值為4.0～7.0的緩沖溶液中，振蕩攪拌，形成聚集體懸液，在4～25℃下反應(yīng)0.5～6h后，置于截留分子量為12kda的透析袋中透析12～24h；

(5)向步驟(4)透析后的反應(yīng)液中依次加入乙烯基單體和引發(fā)劑，在4～25℃下反應(yīng)3～10h后，置于截留分子量為12kda的透析袋中透析12～24h，在5000r/min轉(zhuǎn)速下離心10～15min，收集沉淀，即得組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒，將該酶顆粒置于4℃冰箱中保存或冷凍干燥24h后置于4℃冰箱中保存。

上述步驟(1)中沉淀劑為(nh4)2so4、peg400、peg1000、peg6000、peg8000中的一種；所述(nh4)2so4的加入量為30～80％(w/v)，所述peg400、peg1000、peg6000、peg8000的加入量分別為10～30％(w/v)。

上述步驟(2)中油相為大豆油、橄欖油、花生油、液體石蠟、菜籽油、色拉油、蓖麻油、丁酸乙酯、辛癸酸甘油酯、月桂酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯、油酸聚乙二醇甘油酯中的一種；所述步驟(2)中的油相與步驟(1)制備出的混合液的體積比為5～50:1。

作為優(yōu)選，上述油相與混合液的體積比為10:1。

上述步驟(2)中的乳化劑為tween60、tween80、span40、span60、span80、aot、sds中的一種；所述乳化劑的加入量為0.2～3％(w/v)。

上述步驟(3)中交聯(lián)劑為戊二醛或葡聚糖聚醛；所述交聯(lián)劑的加入量為0.5～5％(v/v)。

上述步驟(4)中酶修飾劑為n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺與二甲基亞砜組成的混合物a、丙烯酰氯與二甲基亞砜組成的混合物b、甲基丙烯酸縮水甘油酯與二甲基亞砜組成的混合物c中的一種或幾種，所述酶修飾劑的加入量為0.2～1％(w/v)。

上述步驟(4)中緩沖溶液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液、磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中的一種。

上述步驟(5)中乙烯基單體可以通過自由基聚合反應(yīng)形成聚合物的單烯烴單體和多烯烴單體中的一種或多種，具體為丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基炳烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、n-異丙基丙烯酰胺、n,n'-甲叉雙丙烯酰胺、順丁二烯中的一種或幾種，所述乙烯基單體的加入量為2～5％(w/v)。

上述步驟(5)中引發(fā)劑為a和b組成的混合物，所述a為過硫酸銨、過硫酸鉀、過氧化氫、過氧化苯二甲酰中的一種或幾種，所述b為n,n'-二甲基苯胺、氨水、n,n,n',n'-四甲基乙二胺、n-甲基嗎啉和哌啶中的一種或幾種。

作為優(yōu)選，上述步驟(5)中引發(fā)劑為1份過硫酸銨和1份n,n,n',n'-四甲基乙二胺組成的混合物，且加入量為0.5～1.5％(w/v)。

本發(fā)明的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的粒徑大小為10～60μm。

本發(fā)明有益效果是:本發(fā)明首先在油包水乳化體系中制備了顆粒大小均勻的交聯(lián)酶聚集體，然后對交聯(lián)酶聚集體表面進(jìn)行化學(xué)修飾引入碳碳雙鍵基團，最后以乙烯基單體為原料，通過自由基原位聚合得到了該組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。該組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒為核殼結(jié)構(gòu)，其核心為交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體，外殼層為交聯(lián)的高分子聚合物，核殼之間通過化學(xué)鍵鏈接，而且具有生物催化活性、穩(wěn)定性高。本發(fā)明操作簡單、成本低、酶活回收率高、酶顆粒大小均勻、酶的穩(wěn)定性強，而且酶能夠方便回收重復(fù)利用，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

下面對本說明書附圖所表達(dá)的內(nèi)容及圖中的標(biāo)記作簡要說明：

圖1是本發(fā)明的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒制備過程示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例一的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒重復(fù)利用穩(wěn)定性變化圖。

圖中1、游離狀β-葡萄糖苷酶，2、交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體，3、組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒，4、沉淀劑，5、交聯(lián)劑，6、酶修飾劑，7、聚合單體，8、引發(fā)劑。

具體實施方式

通過對實施例的描述，以幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思、技術(shù)方案有更完整、準(zhǔn)確和深入的理解。

實施例1

本實施例的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的制備方法，包括交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段和酶的組合固定化階段。

交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段，包括以下具體步驟：

(1)將70％的沉淀劑(nh4)2so4加入到5ml蛋白濃度為30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩搖勻，即得混合液；

(2)將上述混合液按油水體積比為10:1的比例加入到包含1％(w/v)的tween80的大豆油中，磁力攪拌乳化3min，形成油包水體系，在25℃條件下沉淀反應(yīng)1h；

(3)向步驟(2)中再加入2％(v/v)的交聯(lián)劑戊二醛，磁力攪拌乳化3min，在25℃條件下交聯(lián)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后將得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體在5000r/min下離心10min，收集沉淀，用去離子水清洗3次，得到交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體。

酶的組合固定化階段，包括以下步驟：

步驟一、將交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體加入到5mlph＝6.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中，振蕩混勻，形成聚集體懸液，再加入0.5％(w/v)的酶修飾劑n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺，在25℃條件下反應(yīng)3h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h；

步驟二、向步驟一透析后的反應(yīng)液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺單體和0.5％(w/v)的過硫酸銨與n,n,n',n'-四甲基乙二胺組成的復(fù)合引發(fā)劑，在25℃條件下聚合反應(yīng)6h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下離心10min，收集沉淀，即得組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。

β-葡萄糖苷酶的酶活力測定過程中，以未處理的游離酶酶液的酶活力為100％，計算交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率。以酶的組合固定化階段前的β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活力為100％，計算酶的組合固定化階段得到的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的酶活回收率。

β-葡萄糖苷酶的酶活力的測定方法為：取1ml適當(dāng)稀釋的β-葡萄糖苷酶(或β-葡萄糖苷酶聚集體或組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒)酶液，在50℃下預(yù)熱5min，加入1ml已預(yù)熱5min的10mmol/lpnpg溶液，置于50℃水浴鍋中反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束后立即加入2ml濃度為1mol/l的na2co3溶液終止反應(yīng)，并將反應(yīng)液置于室溫下靜置5min。取1ml反應(yīng)液適當(dāng)稀釋后測定其在405nm處吸光度，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出反應(yīng)生成的對硝基苯酚(pnp)的量，計算酶活力。酶活定義為：在ph7.0、50℃條件下，每分鐘水解pnpg產(chǎn)生1μmolpnp所需要的酶量定義為一個酶活力單位(u)。

本實施例中交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段產(chǎn)生的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率為85.6％；本實施例中酶的組合固定化階段產(chǎn)生的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的酶活回收率為91.3％；如圖2所示，本實施的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒在連續(xù)使用5次后，組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的殘余相對酶活力仍然保持在85％以上。

實施例2

本實施例的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的制備方法，包括交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段和酶的組合固定化階段。

交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段，包括以下具體步驟：

(1)將60％的沉淀劑(nh4)2so4加入到5ml蛋白濃度為30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩搖勻,得到混合液；

(2)將上述混合液按油水體積比為10:1的比例加入到包含1％(w/v)的tween80的橄欖油中，磁力攪拌乳化3min，形成油包水體系，在4℃條件下沉淀反應(yīng)1h；

(3)向步驟(2)中再加入2.5％(v/v)的交聯(lián)劑戊二醛，磁力攪拌乳化3min，在4℃條件下交聯(lián)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后將得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體在5000r/min下離心10min，收集沉淀，用去離子水清洗3次，即得交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體。

酶的組合固定化階段，包括以下具體步驟：

步驟一、將交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體加入到5mlph＝6.0的磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖溶液中，振蕩混勻，形成聚集體懸液，再加入0.5％(w/v)的酶修飾劑n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺，在4℃條件下反應(yīng)3h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h；

步驟二、向步驟一透析后的反應(yīng)液中加入4％(w/v)的丙烯酰胺單體和0.5％(w/v)的過硫酸銨與n,n,n',n'-四甲基乙二胺組成的復(fù)合引發(fā)劑，在4℃條件下聚合反應(yīng)6h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下離心10min，收集沉淀，即得組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。

本實施例交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率為82.7％；本實施例酶的組合固定化階段制備出的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的酶活回收率為88.4％。

實施例3

本實施例的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的制備方法，包括交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段和酶的組合固定化階段。

交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段，包括以下具體步驟：

(1)將70％的沉淀劑(nh4)2so4加入到5ml蛋白濃度為30g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩搖勻,得到混合液；

(2)將上述混合液按油水體積比為10:1的比例加入到包含1％(w/v)的span60的大豆油中，磁力攪拌乳化3min，形成油包水體系，在4℃條件下沉淀反應(yīng)0.5h；

(3)向步驟(2)中再加入2％(v/v)的交聯(lián)劑戊二醛，磁力攪拌乳化3min，在4℃條件下交聯(lián)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后將得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體在5000r/min下離心10min，收集沉淀，用去離子水清洗3次，即得交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體。

酶的組合固定化階段，包括以下具體步驟：

步驟一、將交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體加入到5mlph＝7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中，振蕩混勻，形成聚集體懸液，再加入0.5％(w/v)的酶修飾劑n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺，在4℃條件下反應(yīng)3h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h；

步驟二、向步驟一透析后的反應(yīng)液中加入0.5％(w/v)的n,n'-甲叉雙丙烯酰胺單體與2.5％(w/v)的丙烯酰胺單體和0.5％(w/v)的過硫酸銨與n,n,n',n'-四甲基乙二胺組成的復(fù)合引發(fā)劑，在4℃條件下聚合反應(yīng)6h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下離心10min，收集沉淀，即得組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。

本實施例交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率為83.5％；本實施例酶的組合固定化階段制備出的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的酶活回收率為85.9％。

實施例4

本實施例的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的制備方法，包括交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段和酶的組合固定化階段。

交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段，包括以下具體步驟：

(1)將加入20％(w/v)的沉淀劑peg1000加入到5ml蛋白濃度為20g/l的β-葡萄糖苷酶溶液中，振蕩搖勻,得到混合液；

(2)將上述混合液按油水體積比為10:1的比例加入到包含0.5％(w/v)的span60的大豆油中，磁力攪拌乳化3min，形成油包水體系，在4℃條件下沉淀反應(yīng)1h；

(3)向步驟(2)中再加入2％(v/v)的交聯(lián)劑戊二醛，磁力攪拌乳化3min，在4℃條件下交聯(lián)反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后將得到的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體在5000r/min下離心10min，收集沉淀，用去離子水清洗3次，即得交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體。

酶的組合固定化階段，包括以下具體步驟：

步驟一、將交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體加入到5mlph＝5.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖溶液中，振蕩混勻，形成聚集體懸液，再加入0.8％(w/v)的酶修飾劑n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺，在4℃條件下反應(yīng)4h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h；

步驟二、向步驟一透析后的反應(yīng)液中加入3％(w/v)的丙烯酰胺單體和0.6％(w/v)的過硫酸銨與n,n,n',n'-四甲基乙二胺組成的復(fù)合引發(fā)劑，在4℃條件下聚合反應(yīng)6h，結(jié)束后置于截留分子量為12kda的透析袋中透析24h，在5000r/min下離心10min，收集沉淀，即得組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒。

本實施例交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段制備出的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率為79.9％；本實施例酶的組合固定化階段制備出的組合固定化β-葡萄糖苷酶顆粒的酶活回收率為86.5％。

實施例5

本實施例保持實施例1中的酶的組合固定化階段制備條件不變，將交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段的油水體積比改為20:1，油相改為液體石蠟，其他條件與實施例1相同，測得交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率為75.7％，最終制備的組合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率87.2％。

本實施例與實施例1相比，制備的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的酶活回收率和制備的組合固定化β-葡萄糖苷酶的酶活回收率都較低。實施例5中油水比例的增大，使得體系形成的乳滴較小，造成制備的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體粒徑較小，小乳滴內(nèi)的酶易受油水界面的作用而失活，而且交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體粒徑較小，易造成回收不完全而導(dǎo)致酶活的損失。另外，本實施例中的油相為液體石蠟，由于液體石蠟比重較小，形成的交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體難以與油滴分離，影響酶活回收率。

實施例6

本實施例保持實施例1中交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備階段條件不變，將實施例1中酶的組合固定化階段加入酶修飾劑n-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺改為不加酶的修飾劑，直接進(jìn)行聚合反應(yīng)。實驗發(fā)現(xiàn)本實施例與實施例1相比，不加酶修飾劑制備的組合固定化β-葡萄糖苷酶其酶表面形成的聚丙烯酰胺層結(jié)構(gòu)較為松散，導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶容易脫落，不適合多次重復(fù)回收利用。

上面對本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種非實質(zhì)性的改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護范圍為準(zhǔn)。