本發(fā)明具體涉及一種用于高通量測序檢測的腫瘤brca1/2基因變異文庫的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乳腺癌、卵巢癌是威脅女性健康的最常見的惡性腫瘤。不同國家女性乳腺癌的發(fā)病率顯著不同，以美國和北歐發(fā)病率最高。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果。brca1、brca2是breastcancersusceptibilitygene1、2的縮寫，即乳腺癌易感基因1/2。其中，brca1基因定位于人類染色體17q21，由23個(gè)外顯子構(gòu)成；brca2基因定位于人類染色體13q12.3，由27個(gè)外顯子構(gòu)成。brca1、brca2基因同為抑癌基因，在dna損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄激活、染色質(zhì)穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用。數(shù)據(jù)表明，約2％的女性乳腺癌患者和10％-15％的卵巢癌患者存在brca1、brca2基因突變。brca1、brca2基因突變狀態(tài)與家族性乳腺癌發(fā)病關(guān)系十分密切，基因突變表型往往具有誘發(fā)乳腺癌和卵巢癌的趨向。研究顯示，brca1和brca2基因突變攜帶者是發(fā)生乳腺癌、卵巢癌的高危人群，其終生乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加：突變攜帶者罹患乳腺癌的概率為40-80％，罹患卵巢癌的概率為16-60％(一般人群患癌風(fēng)險(xiǎn)分別為12％和1％)。brca2基因突變亦會(huì)造成男性乳癌(發(fā)生率6％)。據(jù)乳腺癌信息中心(breastcancerinformationcore,bic)報(bào)道，brca1、brca2基因突變已達(dá)到3000多種，這些突變分布于整個(gè)編碼區(qū)，最常見的致病性突變?yōu)橐拼a突變、無義突變等，沒有明顯的突變熱點(diǎn)。大多突變導(dǎo)致截短蛋白的形成，使brca1、brca2蛋白質(zhì)功能喪失，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。brca1、brca2基因突變不存在高頻率的突變熱點(diǎn)，這意味著，基因測序不能只檢測brca1、brca2基因某幾個(gè)固定的位點(diǎn)，而是要進(jìn)行全基因測序。本試劑盒對brca1/2基因全外顯子進(jìn)行擴(kuò)增文庫制備，于高通量測序儀上進(jìn)行測序反應(yīng)，可以快速地檢測brca1/2基因編碼區(qū)外顯子的共計(jì)193個(gè)突變位點(diǎn)(點(diǎn)突變，小片段插入、缺少、重復(fù))，具體信息參見表1。通過檢測brca1、brca2基因突變，可以反映乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，也可篩檢出乳腺癌、卵巢癌及其他相關(guān)惡性腫瘤的高危人群；通過對攜帶brca1、brca2基因突變的高危人群進(jìn)行嚴(yán)密的隨訪和監(jiān)測，有助于乳腺癌的及早發(fā)現(xiàn)、及早診斷和及早治療，從而獲得更好的治療效果。有報(bào)道指出，尚未患乳腺癌的女性brca基因突變攜帶者可通過干預(yù)措施(比如預(yù)防性乳腺切除術(shù)或服用他莫昔芬)、篩查或二者結(jié)合進(jìn)行預(yù)防、以及輔助指導(dǎo)個(gè)體化用藥?，F(xiàn)有的腫瘤基因檢測主要采用熒光定量pcr法，檢測通量低，對于brca1和brca2基因全外顯子檢測時(shí)，費(fèi)用高及樣本量需求大，導(dǎo)致臨床收費(fèi)高及樣本量不足。而目前行業(yè)公認(rèn)的基因突變檢測金標(biāo)準(zhǔn)是sanger測序法，這類技術(shù)操作復(fù)雜，通量較低，靈敏度低，具有一定的漏檢風(fēng)險(xiǎn)，難以滿足大量腫瘤患者的檢測需求。因此，發(fā)展一種準(zhǔn)確率高、通量大、安全的腫瘤brca1和brca2基因全外顯子檢測方法，是對現(xiàn)有腫瘤個(gè)體化診療的有效補(bǔ)充和完善。高通量測序(high-throughputsequencing)又名下一代測序(nextgenerationsequencing，ngs)，能夠?qū)崿F(xiàn)一次并行對幾十萬到幾百萬條目標(biāo)核酸分子進(jìn)行序列測定，具有高輸出量與高解析度的特性，不僅提供了豐富的序列變異信息，而且使得測序的費(fèi)用和時(shí)間大大縮短，迅速獲得認(rèn)可。在癌癥多通路多靶標(biāo)研究中發(fā)揮顯著作用，凸顯出這一全新技術(shù)手段的臨床重要性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種用于高通量測序檢測的腫瘤brca1/2基因變異文庫的構(gòu)建方法。本發(fā)明的另一目的在于提供基于上述構(gòu)建方法的試劑盒。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種用于高通量測序檢測的腫瘤brca1/2基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類brca1/2基因全部外顯子區(qū)域突變，具體包括如下步驟：(1)針對目的基因brca1/2設(shè)計(jì)第一基本擴(kuò)增引物組和第二基本擴(kuò)增引物組，該第一基本擴(kuò)增引物組和第二基本擴(kuò)增引物組的所有正向引物和反向引物的5’端均設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該第一基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃，該第二基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；(2)設(shè)計(jì)一不對稱連接探針組與一不與人類基因組形成互補(bǔ)的通用引物，不對稱連接探針組含有多對不同的不對稱連接探針，每對不對稱連接探針均包括可自身形成環(huán)狀的一正向探針和一反向探針，該正向探針和反向探針從3’端至5’端均依次包括一能夠與不對稱連接探針的5’端若干連續(xù)堿基配對的互補(bǔ)序列、一與所述通用引物互補(bǔ)配對的擴(kuò)增序列和一與上述2～5個(gè)t相對應(yīng)的粘性末端識別序列，同時(shí)各正向探針和反向探針均具有相應(yīng)的標(biāo)簽序列，上述每對不對稱連接探針的正向探針和反向探針的tm值相差不超過1℃；(3)將模板、上述第一基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第一pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；將模板、上述第二基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第二pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第二擴(kuò)增引物；(4)將第一擴(kuò)增產(chǎn)物、第二擴(kuò)增產(chǎn)物、不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得所述用于高通量測序的腫瘤brca1/2基因變異文庫；上述ringcap-taq酶由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一擴(kuò)增引物組包括ba2-001-f、ba2-001-r、ba1-001-f、ba1-001-r、ba2-002-f、ba2-002-r、ba1-002-f、ba1-002-r、ba2-003-f、ba2-003-r、ba2-004-f、ba2-004-r、ba1-003-f、ba1-003-r、ba1-004-f、ba1-004-r、ba1-005-f、ba1-005-r、ba1-006-f、ba1-006-r、ba1-007-f、ba1-007-r、ba1-008-f、ba1-008-r、ba1-009-f、ba1-009-r、ba1-010-f、ba1-010-r、ba1-011-f、ba1-011-r、ba1-012-f、ba1-012-r、ba2-005-f、ba2-005-r、ba2-006-f、ba2-006-r、ba2-007-f、ba2-007-r、ba2-008-f、ba2-008-r、ba2-009-f、ba2-009-r、ba1-013-f、ba1-013-r、ba2-010-f、ba2-010-r、ba2-011-f、ba2-011-r、ba2-012-f、ba2-012-r、ba2-013-f、ba2-013-r、ba2-014-f、ba2-014-r、ba2-015-f、ba2-015-r、ba2-016-f、ba2-016-r、ba2-017-f、ba2-017-r、ba2-018-f、ba2-018-r、ba2-019-f、ba2-019-r、ba2-020-f、ba2-020-r、ba2-021-f、ba2-021-r、ba2-022-f、ba2-022-r、ba2-023-f、ba2-023-r、ba2-024-f、ba2-024-r、ba2-025-f、ba2-025-r、ba2-026-f、ba2-026-r、ba2-027-f、ba2-027-r、ba2-028-f、ba2-028-r、ba2-029-f、ba2-029-r、ba2-030-f、ba2-030-r、ba2-031-f、ba2-031-r、ba2-032-f、ba2-032-r、ba2-033-f、ba2-033-r、ba2-034-f、ba2-034-r、ba2-035-f、ba2-035-r、ba2-036-f、ba2-036-r、ba2-037-f、ba2-037-r、ba2-038-f、ba2-038-r、ba2-039-f、ba2-039-r、ba2-040-f、ba2-040-r、ba2-041-f、ba2-041-r、ba2-042-f、ba2-042-r、ba2-043-f、ba2-043-r、ba2-044-f、ba2-044-r、ba2-045-f、ba2-045-r、ba2-046-f、ba2-046-r、ba2-047-f、ba2-047-r、ba2-048-f、ba2-048-r、ba2-049-f、ba2-049-r、ba2-050-f、ba2-050-r、ba2-051-f、ba2-051-r、ba2-052-f、ba2-052-r、ba2-053-f、ba2-053-r、ba2-054-f、ba2-054-r、ba2-055-f、ba2-055-r、ba2-056-f、ba2-056-r、ba2-057-f、ba2-057-r、ba2-058-f、ba2-058-r、ba2-059-f、ba2-059-r、ba1-014-f、ba1-014-r、ba1-015-f、ba1-015-r、ba1-016-f、ba1-016-r、ba1-017-f、ba1-017-r、ba1-018-f、ba1-018-r、ba1-019-f、ba1-019-r、ba1-020-f、ba1-020-r、ba1-021-f、ba1-021-r、ba1-022-f、ba1-022-r、ba1-023-f、ba1-023-r、ba1-024-f、ba1-024-r、ba1-025-f、ba1-025-r、ba1-026-f、ba1-026-r、ba1-027-f、ba1-027-r、ba1-028-f、ba1-028-r、ba1-029-f、ba1-029-r、ba1-030-f、ba1-030-r、ba1-031-f、ba1-031-r、ba1-032-f、ba1-032-r、ba1-033-f、ba1-033-r、ba1-034-f、ba1-034-r、ba1-035-f、ba1-035-r、ba1-036-f、ba1-036-r、ba2-060-f、ba2-060-r、ba2-061-f、ba2-061-r、ba1-037-f、ba1-037-r、2-ba2-062-f、2-ba2-062-r、2-ba1-038-f和2-ba1-038-r、，其序列依次如seqid01～seqid200所示。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二擴(kuò)增引物組包括2-ba2-063-f、2-ba2-063-r、2-ba2-064-f、2-ba2-064-r、2-ba2-065-f、2-ba2-065-r、2-ba2-066-f、2-ba2-066-r、2-ba2-067-f、2-ba2-067-r、2-ba2-068-f、2-ba2-068-r、2-ba2-069-f、2-ba2-069-r、2-ba2-070-f、2-ba2-070-r、2-ba1-039-f、2-ba1-039-r、2-ba1-040-f、2-ba1-040-r、2-ba1-041-f、2-ba1-041-r、2-ba1-042-f、2-ba1-042-r、2-ba1-043-f、2-ba1-043-r、2-ba1-044-f、2-ba1-044-r、2-ba1-045-f、2-ba1-045-r、2-ba1-046-f、2-ba1-046-r、2-ba2-071-f、2-ba2-071-r、2-ba2-072-f、2-ba2-072-r、2-ba2-073-f、2-ba2-073-r、2-ba2-074-f、2-ba2-074-r、2-ba2-075-f、2-ba2-075-r、2-ba1-047-f、2-ba1-047-r、2-ba2-076-f、2-ba2-076-r、2-ba1-048-f、2-ba1-048-r、2-ba2-077-f、2-ba2-077-r、2-ba2-078-f、2-ba2-078-r、2-ba2-079-f、2-ba2-079-r、2-ba2-080-f、2-ba2-080-r、2-ba2-081-f、2-ba2-081-r、2-ba2-082-f、2-ba2-082-r、2-ba2-083-f、2-ba2-083-r、2-ba2-084-f、2-ba2-084-r、2-ba2-085-f、2-ba2-085-r、2-ba2-086-f、2-ba2-086-r、2-ba2-087-f、2-ba2-087-r、2-ba2-088-f、2-ba2-088-r、2-ba2-089-f、2-ba2-089-r、2-ba2-090-f、2-ba2-090-r、2-ba2-091-f、2-ba2-091-r、2-ba2-092-f、2-ba2-092-r、2-ba2-093-f、2-ba2-093-r、2-ba2-094-f、2-ba2-094-r、2-ba2-095-f、2-ba2-095-r、2-ba2-096-f、2-ba2-096-r、2-ba2-097-f、2-ba2-097-r、2-ba2-098-f、2-ba2-098-r、2-ba2-099-f、2-ba2-099-r、2-ba2-100-f、2-ba2-100-r、2-ba2-101-f、2-ba2-101-r、2-ba2-102-f、2-ba2-102-r、2-ba2-103-f、2-ba2-103-r、2-ba2-104-f、2-ba2-104-r、2-ba2-105-f、2-ba2-105-r、2-ba2-106-f、2-ba2-106-r、2-ba2-107-f、2-ba2-107-r、2-ba2-108-f、2-ba2-108-r、2-ba2-109-f、2-ba2-109-r、2-ba2-110-f、2-ba2-110-r、2-ba2-111-f、2-ba2-111-r、2-ba2-112-f、2-ba2-112-r、2-ba2-113-f、2-ba2-113-r、2-ba2-114-f、2-ba2-114-r、2-ba2-115-f、2-ba2-115-r、2-ba2-116-f、2-ba2-116-r、2-ba2-117-f、2-ba2-117-r、2-ba2-118-f、2-ba2-118-r、2-ba2-119-f、2-ba2-119-r、2-ba2-120-f、2-ba2-120-r、2-ba2-121-f、2-ba2-121-r、2-ba1-049-f、2-ba1-049-r、2-ba1-050-f、2-ba1-050-r、2-ba1-051-f、2-ba1-051-r、2-ba1-052-f、2-ba1-052-r、2-ba1-053-f、2-ba1-053-r、2-ba1-054-f、2-ba1-054-r、2-ba1-055-f、2-ba1-055-r、2-ba1-056-f、2-ba1-056-r、2-ba1-057-f、2-ba1-057-r、2-ba1-058-f、2-ba1-058-r、2-ba1-059-f、2-ba1-059-r、2-ba1-060-f、2-ba1-060-r、2-ba1-061-f、2-ba1-061-r、2-ba1-062-f、2-ba1-062-r、2-ba1-063-f、2-ba1-063-r、2-ba1-064-f、2-ba1-064-r、2-ba1-065-f、2-ba1-065-r、2-ba1-066-f、2-ba1-066-r、2-ba1-067-f、2-ba1-067-r、2-ba1-068-f、2-ba1-068-r、2-ba1-069-f、2-ba1-069-r、2-ba1-070-f、2-ba1-070-r、2-ba1-071-f、2-ba1-071-r、2-ba1-072-f、2-ba1-072-r、2-ba1-073-f、2-ba1-073-r、2-ba1-074-f和2-ba1-074-r，其序列依次如seqid201～seqid390所示。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述不對稱連接探針組包括ion-bc1-ff、ion-bc1-fr、ion-bc1-rf、ion-bc1-rr、ion-bc2-ff、ion-bc2-fr、ion-bc2-rf、ion-bc2-rr、ion-bc3-ff、ion-bc3-fr、ion-bc3-rf、ion-bc3-rr、ion-bc4-ff、ion-bc4-fr、ion-bc4-rf、ion-bc4-rr、ion-bc5-ff、ion-bc5-fr、ion-bc5-rf、ion-bc5-rr、ion-bc6-ff、ion-bc6-fr、ion-bc6-rf、ion-bc6-rr、ion-bc7-ff、ion-bc7-fr、ion-bc7-rf、ion-bc7-rr、ion-bc8-ff、ion-bc8-fr、ion-bc8-rf、ion-bc8-rr、ion-bc9-ff、ion-bc9-fr、ion-bc9-rf、ion-bc9-rr、ion-bc10-ff、ion-bc10-fr、ion-bc10-rf、ion-bc10-rr、ion-bc11-ff、ion-bc11-fr、ion-bc11-rf、ion-bc11-rr、ion-bc12-ff、ion-bc12-fr、ion-bc12-rf、ion-bc12-rr、ion-bc13-ff、ion-bc13-fr、ion-bc13-rf、ion-bc13-rr、ion-bc14-ff、ion-bc14-fr、ion-bc14-rf、ion-bc14-rr、ion-bc15-ff、ion-bc15-fr、ion-bc15-rf、ion-bc15-rr、ion-bc16-ff、ion-bc16-fr、ion-bc16-rf和ion-bc16-rr，其序列依次如seqid391～seqid454所示，上述bc1～16分別表示八種不同的標(biāo)簽序列。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述通用引物為c-primer，其序列如seqid455所示。一種基于上述構(gòu)建方法的試劑盒，包括：一第一dna富集反應(yīng)組件，包括第一擴(kuò)增引物組；一第二dna富集反應(yīng)組件，包括第二擴(kuò)增引物組；一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成；一barcode1～16反應(yīng)組件，包括不對稱連接探針組和通用引物，具體包括連在一起的十六個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的不對稱連接探針和通用引物；一陽性質(zhì)控品；和一陰性質(zhì)控品。本發(fā)明的有益效果是：1、本發(fā)明的構(gòu)建方法針對brca1和brca2基因全外顯子序列進(jìn)行單管，快速完成文庫的構(gòu)建，整個(gè)文庫構(gòu)建過程僅需要2～3小時(shí)，手動(dòng)時(shí)間僅僅需要15～30分鐘即可，結(jié)合高通量測序平臺可以十分有效的解決目前對于臨床上腫瘤疾病中在少量的臨床樣本基礎(chǔ)上需要對基因全外顯子檢測這一難點(diǎn)，且成本低廉。2、本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)文庫構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測的應(yīng)用，該核酸檢測可應(yīng)用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。3、本發(fā)明的構(gòu)建方法對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自外周血的樣品所獲得的dna依然適用，基于其的檢測方法依然具有與新鮮組織樣品dna同樣的擴(kuò)增和檢測能力。附圖說明圖1為本發(fā)明的實(shí)施例構(gòu)建的核酸文庫進(jìn)行高通量測序總數(shù)據(jù)圖。圖2為本發(fā)明的實(shí)施例檢測brca1/2基因突變的檢測均一性結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明的實(shí)施例檢測brca1/2基因突變的檢測突變結(jié)果之一。圖4為本發(fā)明實(shí)施例檢測brca1/2基因突變的檢測突變結(jié)果之二。具體實(shí)施方式以下通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明和描述。下述實(shí)施例中的hotstar-taq酶、t4dna連接酶、dna末端修飾酶、ringcapbuffer、mgcl2和dntps均購自中國大連寶生物公司。實(shí)施例1一種用于高通量測序檢測的腫瘤brca1/2基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類brca1/2基因全部外顯子區(qū)域突變，具體外顯子突變的信息如下表1：表1具體包括如下步驟：一種用于高通量測序檢測的腫瘤brca1/2基因變異文庫的構(gòu)建方法，覆蓋人類brca1/2基因全部外顯子區(qū)域突變，具體包括如下步驟：(1)針對目的基因brca1/2設(shè)計(jì)第一基本擴(kuò)增引物組和第二基本擴(kuò)增引物組，該第一基本擴(kuò)增引物組和第二基本擴(kuò)增引物組的所有正向引物和反向引物的5’端均設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該第一基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃，該第二基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；具體的，所述第一擴(kuò)增引物組包括ba2-001-f、ba2-001-r、ba1-001-f、ba1-001-r、ba2-002-f、ba2-002-r、ba1-002-f、ba1-002-r、ba2-003-f、ba2-003-r、ba2-004-f、ba2-004-r、ba1-003-f、ba1-00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r、ion-bc11-rf、ion-bc11-rr、ion-bc12-ff、ion-bc12-fr、ion-bc12-rf、ion-bc12-rr、ion-bc13-ff、ion-bc13-fr、ion-bc13-rf、ion-bc13-rr、ion-bc14-ff、ion-bc14-fr、ion-bc14-rf、ion-bc14-rr、ion-bc15-ff、ion-bc15-fr、ion-bc15-rf、ion-bc15-rr、ion-bc16-ff、ion-bc16-fr、ion-bc16-rf和ion-bc16-rr，其序列依次如seqid391～seqid454所示，上述bc1～16分別表示十六種不同的標(biāo)簽序列；所述通用引物為c-primer，其序列如seqid455所示；(3)將模板、上述第一基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第一pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第一擴(kuò)增產(chǎn)物；將模板、上述第二基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的第二pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得第二擴(kuò)增引物；(4)將第一擴(kuò)增產(chǎn)物、第二擴(kuò)增產(chǎn)物、不對稱連接探針組、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得所述用于高通量測序的腫瘤brca1/2基因變異文庫；上述ringcap-taq酶由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成；(5)通過iontorrentpgm高通量測序儀進(jìn)行文庫上機(jī)檢測，獲得目標(biāo)序列信息，通過vc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)信息比對分析，得到樣本突變狀態(tài)。上述模板所來自的樣品適用范圍包括手術(shù)切除的新鮮病理組織，甲醛固定石蠟包埋病例組織，石蠟切片，全血，血漿，血清，胸腔積液等標(biāo)本。新鮮病理組織，取綠豆大小，約1g重，使用qiagen公司組織dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。蠟塊樣品切成5～8μm切片，取5片，或已經(jīng)制成的5～8μm切片取5片，經(jīng)過二甲苯脫蠟后，使用qiagen公司石蠟包埋dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。全血、血漿、血清以及胸腔積液樣品，使用qiagen公司組織dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取全血200μl，血漿、血清以及胸腔積液不少于800μl。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph8.0)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測提取質(zhì)量，并確定濃度，用tris-hcl溶液(10mmol/l,ph8.0)調(diào)整dna濃度到100ng/μl或2ng/μl作為pcr擴(kuò)增的模板。基于上述構(gòu)建方法的試劑盒包括：一第一dna富集反應(yīng)組件，包括第一擴(kuò)增引物組，該第一擴(kuò)增引物組包括brca-primer-mix1至brca-primer-mix10，每人份的第一dna富集反應(yīng)組件的brca-primer-mix1至brca-primer-mix10的配方如下表所示：brca-primer-mix1配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba2-001-f500.062ba2-001-r500.073ba1-001-f500.074ba1-001-r500.085ba2-002-f500.086ba2-002-r500.087ba1-002-f500.088ba1-002-r500.089ba2-003-f500.0810ba2-003-r500.0811ba2-004-f500.0812ba2-004-r500.0813ba1-003-f500.0714ba1-003-r500.0815ba1-004-f500.0816ba1-004-r500.0817ba1-005-f500.0818ba1-005-r500.0819ba1-006-f500.0820ba1-006-r500.08合計(jì)1.49brca-primer-mix2配制配方表：brca-primer-mix3配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba2-009-f500.082ba2-009-r500.063ba1-013-f500.094ba1-013-r500.065ba2-010-f500.066ba2-010-r500.057ba2-011-f500.068ba2-011-r500.089ba2-012-f500.0810ba2-012-r500.0711ba2-013-f500.0712ba2-013-r500.0513ba2-014-f500.0614ba2-014-r500.0615ba2-015-f500.0916ba2-015-r500.0817ba2-016-f500.0818ba2-016-r500.0819ba2-017-f500.0620ba2-017-r500.08合計(jì)1.40brca-primer-mix4配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba2-018-f500.072ba2-018-r500.063ba2-019-f500.084ba2-019-r500.065ba2-020-f500.056ba2-020-r500.057ba2-021-f500.058ba2-021-r500.089ba2-022-f500.0810ba2-022-r500.0711ba2-023-f500.0712ba2-023-r500.0613ba2-024-f500.0614ba2-024-r500.0615ba2-025-f500.0916ba2-025-r500.0717ba2-026-f500.0918ba2-026-r500.0819ba2-027-f500.0620ba2-027-r500.08合計(jì)1.37brca-primer-mix5配制配方表：brca-primer-mix6配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba2-038-f500.052ba2-038-r500.093ba2-039-f500.084ba2-039-r500.065ba2-040-f500.076ba2-040-r500.057ba2-041-f500.098ba2-041-r500.089ba2-042-f500.0610ba2-042-r500.0711ba2-043-f500.0612ba2-043-r500.0613ba2-044-f500.0614ba2-044-r500.0615ba2-045-f500.0916ba2-045-r500.0817ba2-046-f500.0718ba2-046-r500.0719ba2-047-f500.0820ba2-047-r500.06合計(jì)1.39brca-primer-mix7配制配方表：brca-primer-mix8配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba2-058-f500.062ba2-058-r500.083ba2-059-f500.094ba2-059-r500.065ba1-014-f500.076ba1-014-r500.087ba1-015-f500.078ba1-015-r500.089ba1-016-f500.0710ba1-016-r500.0811ba1-017-f500.0912ba1-017-r500.0613ba1-018-f500.0914ba1-018-r500.0815ba1-019-f500.0916ba1-019-r500.0817ba1-020-f500.0718ba1-020-r500.0719ba1-021-f500.0720ba1-021-r500.07合計(jì)1.51brca-primer-mix9配制配方表：brca-primer-mix10配制配方表：序號名稱濃度(μm)體積(μl)1ba1-032-f500.092ba1-032-r500.083ba1-033-f500.084ba1-033-r500.085ba1-034-f500.086ba1-034-r500.077ba1-035-f500.068ba1-035-r500.079ba1-036-f500.0710ba1-036-r500.0811ba2-060-f500.0812ba2-060-r500.0613ba2-061-f500.0814ba2-061-r500.0815ba1-037-f500.0916ba1-037-r500.06172-ba2-062-f500.08182-ba2-062-r500.06192-ba1-038-f500.06202-ba1-038-r500.06合計(jì)1.47一第二dna富集反應(yīng)組件，包括第二擴(kuò)增引物組，該第二擴(kuò)增引物組包括brca-primer-mix11至brca-primer-mix20，每人份的第二dna富集反應(yīng)組件的brca-primer-mix11至brca-primer-mix20的配方如下表所示：brca-primer-mix11配制配方表brca-primer-mix12配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba1-041-f500.0822-ba1-041-r500.0832-ba1-042-f500.0842-ba1-042-r500.0852-ba1-043-f500.0862-ba1-043-r500.0772-ba1-044-f500.0682-ba1-044-r500.0792-ba1-045-f500.07102-ba1-045-r500.08112-ba1-046-f500.06122-ba1-046-r500.06132-ba2-071-f500.08142-ba2-071-r500.08152-ba2-072-f500.09162-ba2-072-r500.06172-ba2-073-f500.08182-ba2-073-r500.06192-ba2-074-f500.06202-ba2-074-r500.07合計(jì)1.45brca-primer-mix13配制配方表brca-primer-mix14配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba2-083-f500.0822-ba2-083-r500.0832-ba2-084-f500.0942-ba2-084-r500.0952-ba2-085-f500.0962-ba2-085-r500.0772-ba2-086-f500.0982-ba2-086-r500.0792-ba2-087-f500.07102-ba2-087-r500.06112-ba2-088-f500.06122-ba2-088-r500.06132-ba2-089-f500.08142-ba2-089-r500.08152-ba2-090-f500.08162-ba2-090-r500.06172-ba2-091-f500.08182-ba2-091-r500.06192-ba2-092-f500.06202-ba2-092-r500.07合計(jì)1.48brca-primer-mix15配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba2-093-f500.0822-ba2-093-r500.0832-ba2-094-f500.0942-ba2-094-r500.0952-ba2-095-f500.0962-ba2-095-r500.0772-ba2-096-f500.0982-ba2-096-r500.0792-ba2-097-f500.07102-ba2-097-r500.06112-ba2-098-f500.06122-ba2-098-r500.06132-ba2-099-f500.08142-ba2-099-r500.08152-ba2-100-f500.08162-ba2-100-r500.06172-ba2-101-f500.08182-ba2-101-r500.06192-ba2-102-f500.06202-ba2-102-r500.07合計(jì)1.48brca-primer-mix16配制配方表brca-primer-mix17配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba2-113-f500.0922-ba2-113-r500.0832-ba2-114-f500.0642-ba2-114-r500.0752-ba2-115-f500.0862-ba2-115-r500.0872-ba2-116-f500.0982-ba2-116-r500.0692-ba2-117-f500.08102-ba2-117-r500.06112-ba2-118-f500.06122-ba2-118-r500.07132-ba2-119-f500.07142-ba2-119-r500.07152-ba2-120-f500.07162-ba2-120-r500.07172-ba2-121-f500.07182-ba2-121-r500.07192-ba1-049-f500.06202-ba1-049-r500.08合計(jì)1.44brca-primer-mix18配制配方表brca-primer-mix19配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba1-060-f500.0922-ba1-060-r500.0832-ba1-061-f500.0642-ba1-061-r500.0852-ba1-062-f500.0862-ba1-062-r500.0872-ba1-063-f500.0982-ba1-063-r500.0692-ba1-064-f500.08102-ba1-064-r500.07112-ba1-065-f500.07122-ba1-065-r500.07132-ba1-066-f500.08142-ba1-066-r500.06152-ba1-067-f500.08162-ba1-067-r500.07172-ba1-068-f500.08182-ba1-068-r500.08192-ba1-069-f500.06202-ba1-069-r500.08合計(jì)1.50brca-primer-mix20配制配方表序號名稱濃度(μm)體積(μl)12-ba1-070-f500.0922-ba1-070-r500.0832-ba1-071-f500.0642-ba1-071-r500.0852-ba1-072-f500.0862-ba1-072-r500.0872-ba1-073-f500.0982-ba1-073-r500.0692-ba1-074-f500.08102-ba1-074-r500.0711te-0.73合計(jì)1.50一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成，比例0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，優(yōu)選比例1:1:1；一barcode1～16反應(yīng)組件，包括不對稱連接探針組和通用引物，具體包括連在一起的十六個(gè)反應(yīng)孔，每個(gè)反應(yīng)孔分別裝有對應(yīng)的標(biāo)簽序列的不對稱連接探針和通用引物，每人份的barcode1～16反應(yīng)組件的配方如下表所示：一陰性質(zhì)控品，無核酸水；和一陽性質(zhì)控品(陽性突變序列合成質(zhì)粒)，濃度為2ng/μl。將上述試劑盒用前述的構(gòu)建方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以brca1和brca2基因nm_000059:exon3:c.71_96del:p.l24fs突變?yōu)槔齺矸治霰景l(fā)明的檢測腫瘤brca1和brca2基因全外顯子突變的方法。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系3株和突變質(zhì)粒序列，分別為brca-m1(帶c.71_96del:p.l24fs突變)、h460(brca1/2基因野生型)、293t(brca1/2基因野生型)、sw480(brca1/2基因野生型)；100份乳腺癌家族遺傳史的全血樣品、20份臨床乳腺癌樣品(包括新鮮組織、石蠟切片、胸腔積液、全血)：所述第一和第二pcr反應(yīng)體系的模板量(待測樣品、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品)為5μl，ringcap-taq酶(具體由hotstar-taq酶、t4dna連接酶和dna末端修飾酶以1:1:1的比例組成，物料濃度：5u/μl/每種)的加入量為0.25μl，其余組分如下表所示：第一pcr反應(yīng)體系第二pcr反應(yīng)體系pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：上述第一和第二pcr反應(yīng)體系所得的第一和第二擴(kuò)增產(chǎn)物的純化具體如下：取出agencourtampurexp試劑置于室溫，同時(shí)要打散磁珠，同時(shí)配制新鮮的70％的乙醇(230μl無水乙醇+100μl無核酸酶水)，必須是新鮮配制的。第一輪純化步驟(1)向每個(gè)樣品反應(yīng)管25μl產(chǎn)物中分別加入12.5μl(0.5x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；(2)室溫孵育5分鐘；(3)放置在磁力架上面，孵育5分鐘，一直到溶液澄清；(4)小心地吸取上清液置于新的離心管，不要擾動(dòng)磁珠；注意：上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物不要丟棄。第二輪純化步驟(1)向上述吸取的上清液25μl中加入30μl(1.2x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；(2)室溫孵育5分鐘；(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動(dòng)磁珠；注意：磁珠上含有擴(kuò)增文庫不要丟棄。(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動(dòng)5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；(5)重復(fù)上述步驟4，進(jìn)行第二次洗滌；(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μlte(ph8.0)緩沖液充分浸潤磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來混勻)；注意：上清液含有擴(kuò)增文庫不要丟棄。將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物。取出20μl上清。上述純化所得的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物制備用于高通量測序的腫瘤brca1/2基因變異文庫的pcr反應(yīng)的模板量為5μl，ringcap-taq酶(具體由hotstar-taq酶、t4dna連接酶和dna末端修飾酶組成，物料濃度：5u/μl/每種)的加入量為0.25μl，其余組分如下表所示：序號物料物料濃度用量(μl)1ringcapbuffer10×2.52mgcl225mm43dntps10mm24barcode1～16反應(yīng)組件50μm25h2o純化水9.5總體積20pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：分別按純化第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物方法進(jìn)行純化，制得用于高通量測序的腫瘤brca1/2基因變異文庫。上述用于高通量測序的腫瘤brca1/2基因變異文庫的檢測具體如下：如圖1所示，本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫序列可被目前高通量測序系統(tǒng)識別并進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)文庫構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測的應(yīng)用，該核酸檢測可應(yīng)用于目前多種高通量測序平臺、基因芯片平臺、雜交檢測平臺。且如圖2至圖4所示，本發(fā)明的構(gòu)建方法對于來自甲醛固定石蠟包埋的樣品和來自外周血的樣品所獲得的dna依然適用，基于其的檢測方法依然具有與新鮮組織樣品dna同樣的擴(kuò)增和檢測能力。前述100份全血樣品以及細(xì)胞系h460(brca1/2基因野生型)、293t(brca1/2基因野生型)、sw480(brca1/2基因野生型)，突變質(zhì)粒(帶c.71_96del:p.l24fs突變)經(jīng)本發(fā)明的體系檢測，只有突變質(zhì)粒dna有檢測到突變序列，其他樣品無突變序列，進(jìn)一步證明了該方法的特異性。靈敏度分析：將突變型質(zhì)粒dna從100ng/μl連續(xù)10倍梯度稀釋，分別為100ng/μl，10ng/μl，1ng/μl，100pg/μl，10pg/μl，1pg/μl。每次反應(yīng)加入5μldna。結(jié)果表明本發(fā)明的文庫構(gòu)建方法的靈敏度高，50拷貝dna基因組即可檢出。選擇性能力分析：固定每次pcr反應(yīng)總dna用量，100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。先將突變質(zhì)粒的dna和野生型細(xì)胞系dna濃度都調(diào)整為20ng/μl和2ng/μl。這樣每個(gè)反應(yīng)加5μl模板即為100ng/反應(yīng)和10ng/反應(yīng)。按下述方法配置模擬dna模板。a:50％即為100ng/μl突變細(xì)胞dna。b:30％取a液60μl后混入40μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。c:20％取a液40μl后混入60μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。d:15％取b液50μl后混入50μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。e:10％取c液50μl后混入50μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。f:5％取e液50μl后混入50μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。g:1％取f液20μl后混入80μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。h:0.5％取g液50μl后混入50μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。i:0.1％取h液20μl后混入80μl100ng/μl野生型細(xì)胞dna，震蕩混均。結(jié)果表明本發(fā)明的腫瘤brca1/2基因全外顯子突變檢測方法的選擇性檢測能力為在10ng總dna中可以檢出50拷貝的突變dna，檢測能力為1％。重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入突變質(zhì)粒dna10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進(jìn)行高通量測序檢測，10次結(jié)果一致，符合率100％。收集手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本，全血標(biāo)本標(biāo)本共50例，其中20組織樣品，30例全血。其中男性28例，女性22例。年齡為36-71歲，平均年齡為55歲。對于腫瘤brca1/2基因，本發(fā)明檢測結(jié)果與dna測序結(jié)果完全一致：50例樣品中有4例發(fā)生brca1基因突變，2例發(fā)生brca1基因突變，44例正常肺組織對照均為野生型。由上可知，本發(fā)明腫瘤brca1和brca2基因文庫構(gòu)建反應(yīng)就可以同時(shí)檢測腫瘤brca1和brca2基因全外顯子突變位點(diǎn)，文庫構(gòu)建時(shí)間僅需3小時(shí)，因此本發(fā)明省時(shí)省力，準(zhǔn)確性高，可滿足突變的快速診斷。而且，高通量測序法和傳統(tǒng)測序方法結(jié)果的符合率為100％，高通量測序法靈敏度和選擇性檢測能力高于傳統(tǒng)測序方法，10ng樣品dna中含1％的突變dna即可檢出。以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12