本發(fā)明涉及一種氧化酶的制備方法，特備是一種抗生素替代品氧化酶的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料中抗生素的使用已經(jīng)成為畜牧業(yè)可持續(xù)、健康發(fā)展的關(guān)鍵問題。抗生素在畜牧領(lǐng)域的濫用，直接導(dǎo)致了耐藥性、毒副作用、環(huán)境污染等問題，已經(jīng)引起了世界各國的高度重視，更為嚴(yán)重的是抗生素在動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留，對(duì)人類食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。隨著社會(huì)不的斷進(jìn)步，人們對(duì)食品和環(huán)境質(zhì)量的要求越來越高，近幾年來的大量研究證明，在畜禽飼料中長期且大量使用抗生素作為飼料添加劑存在著許多弊端，然而我國是一個(gè)發(fā)展中國家，生產(chǎn)力發(fā)展水平不高，因此很快完全禁止在畜禽飼料中使用抗生素目前來說是不現(xiàn)實(shí)的，抗生素替代品已經(jīng)成為行業(yè)發(fā)展研究的的重要關(guān)注點(diǎn)，開發(fā)綠色、高效、無污染的飼料添加劑已經(jīng)成為未來畜牧業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。酶制劑可作為抗生素替代方案的一個(gè)產(chǎn)品，已經(jīng)被業(yè)界廣泛關(guān)注。在飼料中添加酶制劑，可以直接補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足、促進(jìn)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化，也可以間接提高機(jī)體免疫力、減少糞便排放、降低環(huán)境污染等。但傳統(tǒng)酶制劑主要是直接補(bǔ)充體內(nèi)營養(yǎng)性消化酶不足，間接去除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)或者增加動(dòng)物內(nèi)原酶的分泌，不能直接作為抗生素替代品添加到飼料中殺滅細(xì)菌、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物的抗病能力和免疫能力。

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,god)是一種需氧脫氫酶，其系統(tǒng)名稱為β－d－葡萄糖氧化還原酶(ec1.1.3.4)。葡萄糖氧化酶通常與過氧化氫酶組成一個(gè)氧化還原酶系統(tǒng)。葡萄糖氧化酶在分子氧的存在下，專一地氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫，同時(shí)消耗氧氣，而過氧化氫則分解生成水。葡萄糖氧化酶因其天然、無毒副作用而作為食品工業(yè)中一種重要的工業(yè)用酶，廣泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脫氧、面粉改良、防止食品褐變等方面。

葡萄糖氧化酶的作用產(chǎn)物為有機(jī)酸和過氧化氫，應(yīng)用于飼料行業(yè)，能夠替代部分抗生素或降低抗生素使用量，具有脫氧、殺菌的作用；能夠提高機(jī)體的免疫力并可促進(jìn)機(jī)體生長，不會(huì)產(chǎn)生菌體抗藥性或藥物殘留。作為一種新型飼料酶制劑，god的生理功能主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：god在進(jìn)入動(dòng)物胃腸道后以葡萄糖作為酶解底物，生成葡萄糖酸和過氧化氫，其中葡萄糖酸內(nèi)酯可以自發(fā)水解成葡萄糖酸，具有酸化劑相似的作用；過氧化氫具有廣譜殺菌作用，可以起到抑制大腸桿菌、沙門氏菌等致病微生物生長繁殖的作用；god催化葡萄糖生成的葡萄糖酸可在腸道內(nèi)發(fā)揮酸化劑和微生態(tài)制劑的雙重作用，可使胃內(nèi)食糜ph值降低，從而創(chuàng)造酸性環(huán)境，激活胃蛋白酶，有利于蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等營養(yǎng)成分的消化吸收，促進(jìn)益生菌的增殖；而有益菌大量增殖會(huì)形成微生態(tài)競爭優(yōu)勢，增強(qiáng)其他消化酶的生物活性，改善腸道菌群，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而提高飼料轉(zhuǎn)化效率；god在腸道消耗腸道內(nèi)的氧氣，造成厭氧環(huán)境，對(duì)預(yù)防和解除霉菌毒素中毒有很好的效果，可以促進(jìn)動(dòng)物消化道健康，提高動(dòng)物對(duì)飼糧的消化利用；處于應(yīng)激或病理狀態(tài)的動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生大量自由基，當(dāng)自由基超過機(jī)體自身的清除能力時(shí)就會(huì)破壞腸道上皮細(xì)胞。添加了god的畜禽飼料可以清除這些自由基，因?yàn)間od具有氧化還原作用，能保護(hù)腸道上皮細(xì)胞的完整性，阻止大量病原菌的入侵，提高免疫力，促進(jìn)動(dòng)物健康快速生長；god可消耗飼料中的氧氣，氧氣的消耗不僅抑制了微生物的生長，還減少了飼料營養(yǎng)的損失，同時(shí)能防止飼料中的油脂酸敗變質(zhì)，起到防霉劑和抗氧化劑的雙重作用，從而改善飼料品質(zhì)，延長飼料保質(zhì)期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述提出的問題，本發(fā)明提供了一種抗生素替代品氧化酶的制備方法，葡萄糖氧化酶作為一種新型的綠色、環(huán)保高效的飼料添加劑用于飼料中可減少抗生素的使用或者部分替代抗生素，廣泛使用將為我們的綠色養(yǎng)殖的領(lǐng)域，其技術(shù)方案如下：

一種抗生素替代品氧化酶的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）葡萄糖氧化酶天然產(chǎn)菌株的基因的選育：

利用微生物菌種選育技術(shù)和菌種定向選育技術(shù)，選育出葡萄糖氧化酶基因來源的野生型菌株，并在在ypd平板上進(jìn)行篩選，取孢子制成孢子懸液，利用微生物菌種選育技術(shù)獲得一株葡萄糖氧化酶突變株god－an1312；

（2）誘變基因的克隆：

將上述步驟（1）中篩選獲得的葡萄糖氧化酶突變株god－an1312的dna為模板，pcr擴(kuò)增獲取葡萄糖氧化酶基因，得到的重組表達(dá)載體命名為gegod-ppic9k；

（3）含葡萄糖氧化酶基因工程菌構(gòu)建：

將上述步驟（2）中重組表達(dá)載體gegod-ppic9k采用bglⅱ進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115，電轉(zhuǎn)化后涂布于含g418的ypd平板上進(jìn)行篩選，篩選獲得葡萄糖氧化酶發(fā)酵水平最高的工程菌gegod-ppic9k-gs115；

（4）葡萄糖氧化酶工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及后處理：

采用篩選獲得的葡萄糖氧化酶重組菌株gegod-ppic9k-gs115進(jìn)行高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜進(jìn)行后處理，復(fù)配載體進(jìn)行噴霧干燥制得葡萄糖氧化酶成品。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）中發(fā)酵酶活可達(dá)到1500u/ml左右的發(fā)酵水平。

進(jìn)一步的，所述步驟（2）中得到的重組表達(dá)載體gegod-ppic9k基因全長1755bp，編碼584個(gè)氨基酸。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）中葡萄糖氧化酶突變株god－an1312具有耐溫、ph范圍寬、高活性的性能。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）中發(fā)酵周期為7天。

進(jìn)一步的，所述步驟（1）中微生物菌種選育技術(shù)包括等離子體（artp）、紫外線、硫酸二乙酯（des）進(jìn)行單獨(dú)及復(fù)合誘變處理其中的任意一種進(jìn)行單獨(dú)或復(fù)合誘變處理，篩選獲得一株葡萄糖氧化酶突變株。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：

葡萄糖氧化酶作為一種新型的綠色、環(huán)保高效的飼料添加劑用于飼料中可減少抗生素的使用或者部分替代抗生素，葡糖糖氧化酶的廣泛使用將為我們的綠色養(yǎng)殖的新方案。采用篩選獲得的葡萄糖氧化酶重組菌株gegod-ppic9k-gs115進(jìn)行高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜進(jìn)行后處理，復(fù)配載體進(jìn)行噴霧干燥制得葡萄糖氧化酶成品，發(fā)酵酶活可達(dá)到1500u/ml左右的發(fā)酵水平，與國內(nèi)外目前技術(shù)相比，本項(xiàng)目的葡萄糖氧化酶通過高效表達(dá)后發(fā)酵水平大幅度提高，同時(shí)酶活保留時(shí)間長，在85℃的條件下沒貨率達(dá)80%以上，在酸性條件下ph值為3.5-6.5，酶活保留率在85%以上；利用其酶活高、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，葡萄糖氧化酶替代抗生素在飼料中應(yīng)用使得飼用葡萄糖氧化酶具有很大的市場空間，符合綠色養(yǎng)殖的標(biāo)準(zhǔn)，具有很高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

附圖說明

圖1為葡萄糖氧化酶發(fā)酵時(shí)間與酶活曲線圖。

圖2為葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)溫度曲線圖。

圖3為葡萄糖氧化酶耐溫性能曲線圖。

圖4為葡萄糖氧化酶抗胃蛋白酶、胰蛋白酶消化的性能曲線。

圖5為葡萄糖氧化酶室溫貯存穩(wěn)定性能曲線。

圖6為葡萄糖氧化酶最適反應(yīng)ph曲線圖。

圖7為離子對(duì)葡萄糖氧化酶抑制或激活示意圖。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步揭示本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式：

一種抗生素替代品氧化酶的制備方法，采用分子生物學(xué)手段結(jié)合誘變技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有的工程菌gegod-ppic9k-gs115中葡萄糖氧化酶基因來源的野生型菌株在ypd平板上進(jìn)行篩選，通過微生物菌種選育技術(shù)，包括等離子體（artp）、紫外線、硫酸二乙酯（des）進(jìn)行單獨(dú)及復(fù)合誘變處理，以及菌種定向選育技術(shù)等，選育出一株黑曲霉突變株，獲得經(jīng)表達(dá)產(chǎn)生的酶具有耐溫、ph范圍寬、活性高等特點(diǎn)的新的基因。

優(yōu)選地，采用工程菌gegod-ppic9k-gs115的質(zhì)粒及宿主細(xì)胞，以選育的野生型菌株的dna為模板，pcr擴(kuò)增獲得葡萄糖氧化酶基因，構(gòu)建一株高性能葡萄糖氧化酶的基因工程菌，使其具有易培養(yǎng)、能高效表達(dá)和分泌葡萄糖氧化酶，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

優(yōu)選地，利用所構(gòu)建及篩選獲得的產(chǎn)酶菌種，研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)和影響酶活力的相關(guān)因素，優(yōu)化發(fā)酵工藝及條件，建立葡萄糖氧化酶工業(yè)化高密度液體發(fā)酵生產(chǎn)工藝；

優(yōu)選地，研究浸提、陶瓷膜除菌、超濾濃縮或噴霧干燥法等方法對(duì)酶的提取收率、酶活的影響，確定最適的提取方法及工藝技術(shù)參數(shù)，建立完善的后提取生產(chǎn)工藝；采取鹽析、離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等方法分離純酶，研究酶的最適溫度、ph、抑制劑、促進(jìn)劑、穩(wěn)定性等特性；根據(jù)酶學(xué)特性，研究酶制劑配方及制備技術(shù)和工藝，提高酶制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性，提高酶活的保持率。

優(yōu)選地，選育酶活在1500u/g葡萄糖氧化酶高產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)液體發(fā)酵酶活達(dá)到1500u/g以上，發(fā)酵周期140小時(shí)以內(nèi)。

采用上述技術(shù)方案，提升酶制劑研發(fā)、生產(chǎn)方面的技術(shù)水平，促進(jìn)酶制劑行業(yè)的發(fā)展，葡萄糖氧化酶作為一種新型的綠色、環(huán)保高效的飼料添加劑用于飼料中可減少抗生素的使用或者部分替代抗生素，葡萄糖氧化酶的作用產(chǎn)物為有機(jī)酸和過氧化氫，具有脫氧、殺菌的作用；能夠提高機(jī)體的免疫力并可促進(jìn)機(jī)體生長，不會(huì)產(chǎn)生菌體抗藥性或藥物殘留。促進(jìn)我國飼料業(yè)及養(yǎng)殖行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。葡萄糖氧化酶廣泛應(yīng)用于食品、飼料、制藥、臨床診斷等行業(yè)，本發(fā)明將為市場提供高水平，低價(jià)格的葡萄糖氧化酶產(chǎn)品，將極大地降低相關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)成本，推動(dòng)相關(guān)行業(yè)的發(fā)展。

實(shí)施例1：

（1）葡萄糖氧化酶天然生產(chǎn)菌株的誘變、培養(yǎng)

從自然界篩選獲得葡萄糖氧化酶生產(chǎn)菌株（黑曲霉，aspergillusniger），在pda平板上培養(yǎng)，取孢子制成孢子懸液，然后采用紫外線、硫酸二乙酯（des）進(jìn)行單獨(dú)或復(fù)合誘變處理，篩選獲得一株葡萄糖氧化酶突變株god－an1312；

（2）黑曲霉（god－an1312）葡萄糖氧化酶基因的克隆

采用rna提取試劑盒，提取黑曲霉（god－an1312）的總rna，合成第一鏈cdna。以cdna為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將pcr產(chǎn)物進(jìn)行ecori和noti雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的畢赤酵母表達(dá)載體ppic9k相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌topl0感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗生素g418篩選后，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒并進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，克隆得到的dna含有葡萄糖氧化酶完整的開放閱讀框。該葡萄糖氧化酶基因（gegod）全長1755bp，編碼584個(gè)氨基酸，得到的重組表達(dá)載體命名為gegod-ppic9k；

（3）含葡萄糖氧化酶基因gegod的畢赤酵母工程菌構(gòu)建

將上述重組表達(dá)載體gegod-ppic9k采用bglⅱ進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115，電轉(zhuǎn)化后涂布于含g418的ypd平板上進(jìn)行篩選，篩選獲得葡萄糖氧化酶發(fā)酵水平最高的工程菌gegod-ppic9k-gs115；

（4）葡萄糖氧化酶工程菌株的發(fā)酵培養(yǎng)及后處理

采用篩選獲得的葡萄糖氧化酶重組菌株gegod-ppic9k-gs115進(jìn)行高密度液體發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜進(jìn)行后處理，復(fù)配載體進(jìn)行噴霧干燥制得葡萄糖氧化酶成品。

（5）葡萄糖氧化酶性能指標(biāo)的研究

本發(fā)明產(chǎn)品液體發(fā)酵酶活達(dá)到1500u/g以上，發(fā)酵周期7天左右，發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵酶活如圖1所示；經(jīng)后提取工藝，獲得酶活2000u/g的產(chǎn)品，酶活回收率≥90%，葡萄糖氧化酶反應(yīng)溫度和相對(duì)酶活的關(guān)系如圖2所示；在耐熱性能：產(chǎn)品經(jīng)85℃處理1min，酶活保留率≥80%，如圖3所示；葡萄糖氧化酶具有優(yōu)良的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化能力，胃蛋白酶處理90min后，酶活性保留86.2%，用胰蛋白酶處理90min后，保留83.1%，葡萄糖氧化酶耐溫性處理時(shí)間和剩余酶活的關(guān)系如圖4所示；產(chǎn)品在室溫存放一年酶活保留90%以上，產(chǎn)品在室溫保留的條件下酶活指數(shù)如圖5所示；產(chǎn)品在酸性環(huán)境中（ph3.5-6.5）酶活保留率≥85%以上，酸性條件和酶活的關(guān)系如圖6所示；ca²⁺、mg²⁺、fe²⁺、zn²⁺對(duì)酶活有一定的激活作用，k⁺、mn²⁺、co²⁺、edta對(duì)酶活影響不大，fe³⁺、cu²⁺、sds則對(duì)酶活有一定程度的抑制作用，如圖7所示。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。