本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種共表達(dá)三酶的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建，以及該工程菌在生產(chǎn)α-羥基羧酸中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
α-羥基羧酸(α-羥酸，2-羥酸，α-hydroxy-carboxylicacid，2-hydroxy-carboxylicacid)在自然界廣泛存在，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是羧基側(cè)c位有一個羥基。光學(xué)純α-羥基羧酸是重要的精細(xì)化工中間體和手性藥物前體。
通常可以把α-酮基羧酸(α-ketocarboxylicacids)用作底物，進(jìn)行化學(xué)手性加氫合成α-羥基羧酸，或者酶法合成(中國專利201410818165.x)α-羥基羧酸，但α-酮基羧酸及手性催化劑價格昂貴，產(chǎn)業(yè)化較難。
也有通過酯酶水解α-羥基羧酸酯的方法制備光學(xué)純α-羥基羧酸(中國專利200910049768.7)，但酯酶手性選擇性差，而且最高只有50％的收率。
另有通過野生菌直接轉(zhuǎn)化l-氨基酸生成α-羥基羧酸，但與基因工程菌相比，效率較低(中國專利201610853578.0)。
中國專利201610080101.3公開了一種通過多酶作用處理外消旋α-羥羧酸生成光學(xué)純2-羥酸的方法，但化學(xué)合成的外消旋α-羥基羧酸成本較高。
早在1988年roth等人提出了先以化學(xué)法處理l-二羥苯丙氨酸(l-多巴)得到對應(yīng)的α-酮基羧酸，再酶法合成(s)-3,4-二羥基苯基乳酸的方法(enzymaticsynthesisof(s)-(-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)lacticacid,arch.pharm.(weinheim)321,179-180(1988))。wo專利wo2002033110公開了一種通過廉價l-氨基酸為底物，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-羥基羧酸的方法，該方法首先用氨基酸氧化酶(或表達(dá)氨基酸氧化酶的大腸桿菌全細(xì)胞)脫掉氨基酸的α-氨基生成對應(yīng)的α-酮酸，然后將菌體去除(也可不去除)，再加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)，羥基羧酸脫氫酶，甲酸脫氫酶等反應(yīng)一定時間后生成α-羥基羧酸。該方法中nad價格昂貴，而且反應(yīng)一定時間后會分解失效，另外羥酸脫氫酶和甲酸脫氫酶都是由不同的菌種培養(yǎng)得到，極大地增加了反應(yīng)成本。
wolfgang等綜述了氧化-還原串聯(lián)反應(yīng)，全細(xì)胞(一鍋法)實(shí)現(xiàn)對底物經(jīng)濟(jì)有效的轉(zhuǎn)化(recentbiocatalyticoxidation–reductioncascades,currentopinioninchemicalbiology2011,15:249–256)。當(dāng)前多酶串聯(lián)的全細(xì)胞催化簡單前體生成高副加值產(chǎn)物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用(constructingbiocatalyticcascades:invitroandinvivoapproachestodenovomulti-enzymepathways,acscatal.,2017,7(1),710–724)。例如蘇氨酸脫氨酶-羥酸脫氫酶-甲酶脫氫酶共表達(dá)系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)化l-蘇氨酸生成2-羥基丁酸，蘇氨酸脫氨酶也稱為蘇氨酸脫水酶具有高度的底物專一性，此酶會脫掉蘇氨酸的3-羥基和2-氨基，催化蘇氨酸脫水分解生成氨和α-酮丁酸(efficientbiosynthesisof(r)-or(s)-2-hydroxybutyratefroml-threoninethroughasyntheticbiologyapproach,acscatal.,2016,358(18),2923–2928)。rantwijka綜述了通過羥基腈裂解酶-腈轉(zhuǎn)換酶-酰胺水解酶串聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)(s)-α-羥基羧酸和(s)-α-羥基羧酸酰胺(enzymaticcascadesynthesisof(s)-2-hydroxycarboxylicamidesandacids:cascadereactionsemployingahydroxynitrilelyase,nitrile-convertingenzymesandanamidase,journalofmolecularcatalysisb:enzymatic,2015，114,25-30)，但這類方法的底物較為昂貴。
基于目前各種方法的缺陷，本發(fā)明構(gòu)建了一種多酶共表達(dá)的大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了對l-α-氨基酸的全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化，催化過程過程中保持化合物上其它基團(tuán)不發(fā)生改變，僅α-氨基轉(zhuǎn)化成α-羥基，實(shí)現(xiàn)了對應(yīng)的光學(xué)純α-羥基羧酸的生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能低成本生產(chǎn)α-羥基羧酸的大腸桿菌重組菌。同時本發(fā)明要解決該菌株的構(gòu)建和應(yīng)用的技術(shù)問題。
上述大腸桿菌的功能核心在于可以同時表達(dá)3種酶，分別為l-氨基酸氧化酶、α-羥基羧酸脫氫酶和可將nad(p)還成nad(p)h的酶。其原理為：在工程菌全細(xì)胞內(nèi)，l-氨基酸氧化酶將l-α-氨基酸氧化成對應(yīng)的α-酮酸；另外兩種酶構(gòu)成nad輔酶循環(huán)再生體系，由α-羥基羧酸脫氫酶將α-酮酸還原成α-羥基羧酸。實(shí)現(xiàn)了全細(xì)胞三酶串聯(lián)一步法將l-α-氨基酸轉(zhuǎn)化成光學(xué)純α-羥基羧酸。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
1.本發(fā)明所涉及的菌株及質(zhì)粒
購自美國菌種保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc8041、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931、proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc8019、komagataellaphaffiiatcc76273、bacillussubtilisatcc13952和pseudomonasabietaniphilaatcc700689。購自德國微生物菌種保藏中心dsmz的bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、providenciarettgeridsm1131和ignatzschinerialarvaedsm13226。購自qiagen公司的pqlinkn質(zhì)粒和escherichiacolim15。
2.酶的選擇
(1)l-氨基酸氧化酶的選擇
l-氨基酸氧化酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、哺乳動物細(xì)胞、蛇毒、昆蟲毒素及藻類中(l-aminoacidoxidaseasbiocatalyst:adreamtoofar？appl.microbiol.biotechnol.2013,97:9323-41)。l-氨基酸氧化酶將α氨基和cα上的氫轉(zhuǎn)移到fad上，絕大部份利用分子氧直接氧化還原型fad，再生氧化型fad，同時生成過氧化氫。例如poljanac等采用東部菱背響尾蛇毒l-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羥基苯丙酮酸，然后再加乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶生成成3,4-二羥基苯乳酸，在此過程中另外必須添加過氧化氫酶以消除過氧化氫的毒性(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzed,chem.biochem.eng.q.2005,19(4)351–358)。另外還有一類l-氨基酸氧化酶與細(xì)胞膜上電子傳遞鏈相關(guān)，電子經(jīng)過呼吸鏈傳遞給細(xì)胞色素氧化酶，使分子氧還原為水，從而不生成過氧化氫，這種酶類主要存在于變形桿菌屬(proteussp.)、普羅威登菌屬(providenciasp.)、摩根菌屬(morganellasp.)等細(xì)菌中(crystalstructureofamembrane-boundl-aminoaciddeaminasefromproteusvulgaris.j.struct.biol.2016,195:306-15)。本發(fā)明選擇了5種不產(chǎn)過氧化氫的l-氧基酸氧化酶，從proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc8019、providenciarettgeridsm1131、ignatzschinerialarvaedsm13226中分別克隆得到l-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、mmaao、praao、ilaao，其核苷酸序列分別如seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11所示，這些酶都具有底物廣泛和活性強(qiáng)的特點(diǎn)。
(2)α-羥基羧酸脫氫酶的選擇
根據(jù)最適底物的情況，α-羥基羧酸脫氫酶包含有乳酸脫氫酶、α-羥酸異己酸脫氫酶、扁桃酸脫氫酶、乙醛酸還原酶等，這些酶能廣泛作用于多種底物生成α-羥基羧酸，通常根據(jù)其最適作用的底物來命名。本發(fā)明從中選擇光學(xué)性強(qiáng)且對多種α-酮酸均有強(qiáng)活性的酶，用于各類光學(xué)純的α-羥基羧酸生產(chǎn)。從lactobacillusplantarumatcc8041、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931中分別克隆得到d型α-羥基羧酸脫氫酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其核苷酸序列分別如seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3所示。從bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931中分別克隆得到l型α-羥基羧酸脫氫酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其核苷酸序列分別如seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6所示。
(3)可還原nad(p)的酶的選擇
在生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，α-羥基羧酸脫氫酶需要以nadh和/或nadph為輔酶，本發(fā)明從komagataellaphaffiiatcc76273中得到甲酸脫氫酶基因kpfdh(核苷酸序列如seqidno:12所示)、從bacillussubtilisatcc13952得到葡萄糖脫氫酶基因bsgdh(核苷酸序列如seqidno:13所示)、從pseudomonasabietaniphilaatcc700689中得到亞磷酸脫氫酶基因papdh(核苷酸序列如seqidno:14所示)。
3.三酶共表達(dá)體系的構(gòu)建
將以上選擇的l-氨基酸氧化酶、(d/l)-α-羥基羧酸脫氫酶、可還原nad(p)的酶中每類任選一個酶，進(jìn)行三酶組合共表達(dá)。目前大腸桿菌多基因共表達(dá)的有多種方法(大腸桿菌多基因共表達(dá)策略，中國生物工程雜志，2012，32(4):117-122)，本發(fā)明采用lic(ligationindependentcloning)銜接子來實(shí)現(xiàn)多個基因的定位連接的方法，將三個基因放入addgene的pqlinkn質(zhì)粒?；虿僮鞲鶕?jù)相關(guān)協(xié)議完成(vectorsforco-expressionofanunrestrictednumberofproteins.nucleicacidsresearch.2007；35(6):e43)，首先將以上所有的酶單獨(dú)連接到pqlinkn質(zhì)粒上，然后通過link克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)多基因連接。
得到三基因共表達(dá)重組質(zhì)粒后，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌escherichiacolim15，利用氨芐青霉素(ampicillin)平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，即得到重組大腸桿菌。
4.全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)光學(xué)純α-羥基羧酸
細(xì)胞的準(zhǔn)備：根據(jù)經(jīng)典的重組大腸桿菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)方案，將重組大腸桿菌按體積比為2％的量轉(zhuǎn)接到lb發(fā)酵培養(yǎng)基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，當(dāng)細(xì)胞od600達(dá)到0.6-0.8后，加入終濃度為0.4mm的iptg，在20℃誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)8h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，20℃、8000rpm、20分鐘離心收集細(xì)胞。
全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系為：根據(jù)不同底物的溶解性，底物濃度控制在0.1-10g/l，并根據(jù)構(gòu)建的不同質(zhì)粒的性質(zhì)加入供氫體濃度為1-10g/l，調(diào)節(jié)ph在4.0-8.0之間,新鮮濕菌體量為10-200g/l。然后于15-40℃，轉(zhuǎn)化0.5-24小時。轉(zhuǎn)化結(jié)束后液相色譜測定產(chǎn)量及旋光性。當(dāng)構(gòu)建的三酶共表達(dá)質(zhì)粒中含有葡萄糖脫氫酶時，供氫體為葡萄糖。當(dāng)構(gòu)建的三酶共表達(dá)質(zhì)粒中含有甲酸脫氫酶時，供氫體為甲酸鈉。當(dāng)構(gòu)建的三酶共表達(dá)質(zhì)粒中含有亞磷酸脫氫酶時，供氫體為亞磷酸。
全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中的底物為下列之一：l-色氨酸、l-苯丙氨酸、l-酪氨酸、l-多巴、l-丙氨酸、l-纈氨酸、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-谷氨酸、l-甲硫氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-半胱氨酸、l-天門冬氨酸、l-精氨酸、l-賴氨酸、l-谷氨酰胺、l-天冬酰胺、l-組氨酸。
這些底物經(jīng)相應(yīng)的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，可對應(yīng)生成光學(xué)純的r或s型α-羥基羧酸，分別為：吲哚-3-乳酸(indole-3-lacticacid)，3-苯基乳酸(phenyllacticacid)，4-羥基苯乳酸(4-hydroxyphenyllacticacid)，3,4-二羥基苯基乳酸(3,4-dihydroxyphenyllacticacid)，乳酸(lacticacid)，2-羥基異戊酸(2-hydroxyisovalerate)，2-羥基-3-甲基戊酸(2-hydroxy-3-methylpentanoicacid)，2-羥基-4-甲基戊酸(2-hydroxy-4-methylpentanoicacid)，2-羥基戊二酸(2-hydroxypentanedioicacid)，2-羥基-4-甲硫基丁酸(2-hydroxy-4-(methylsulfanyl)butanoicacid)，2,3-二羥基丙酸(2,3-dihydroxypropanoicacid)，2,3-二羥基丁酸(2,3-dihydroxybutanoicacid)，2-羥基-3-巰基丙酸(2-hydroxy-3-sulfanylpropanoicacid)，2-羥基丁二酸(2-hydroxybutanedioicacid)，5-胍基-2-羥基戊酸(5-carbamimidamido-2-hydroxypentanoicacid)，6-氨基-2-羥基己酸(6-amino-2-hydroxyhexanoicacid)，5-氨基-2-羥基-5-氧代戊酸(5-amino-2-hydroxy-5-oxopentanoicacid)，4-氨基-2-羥基-4-氧代丁酸(4-amino-2-hydroxy-4-oxobutanoicacid)，2-羥基-3-(1h-咪唑-4-基)丙酸(2-hydroxy-3-(1h-imidazol-4-yl)propanoicacid)。
5.樣品的檢測分析
定量分析：轉(zhuǎn)化液采用perkinelmerseries200高效液相色譜儀檢測分析，配示差折光檢測器。色譜條件為：流動相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用漢邦megresc18色譜柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱溫30℃、進(jìn)樣量20μl。
手性分析：perkinelmerseries200高效液相色譜儀檢測分析，配示差折光檢測器，chiralcelod-h手性柱(4.6×250mm)，流動相體積比為正己烷:異丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速為0.5ml/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μl。
α-羥基羧酸的光學(xué)純度通過對映體過量值(％e.e)來評價。
當(dāng)生產(chǎn)(r)-α-羥基羧酸時，
對映體過量值％e.e＝[(sr-ss)/(sr+ss)]×100％
當(dāng)生產(chǎn)(s)-α-羥基羧酸時,
對映體過量值％e.e＝[(ss-sr)/(sr+ss)]×100％
式中ss為轉(zhuǎn)化液中(s)-對映體的峰面積，sr為轉(zhuǎn)化液中(r)-對映體的液相色譜峰面積。
本發(fā)明的有益效果是構(gòu)建了一種新型的三酶共表達(dá)大腸桿菌工程菌，該菌可應(yīng)用于光學(xué)純的α-羥基羧酸的生產(chǎn)。本發(fā)明選擇的l-氨基酸氧化酶和(d/l)-α-羥基羧酸脫氫酶均具有底物專一性差，光學(xué)專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此同一株工程菌在改變不同底物的情況下可生產(chǎn)出多種產(chǎn)物，該生產(chǎn)過程簡單且原料易得，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。應(yīng)當(dāng)說明的是，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1
三基因共表達(dá)體系的構(gòu)建。
(1)引物設(shè)計
設(shè)計引物，引物序列如表1所示
表1擴(kuò)增基因所用的引物
(2)pcr擴(kuò)增
按照生產(chǎn)商提供的使用說明書，用genomicdnapurificationkit(takara)抽提處于對數(shù)生長期的菌株的基因組dna，用表1中的引物從各自對應(yīng)的菌株中進(jìn)行pcr擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：primestarhsdnapolymerase(2.55u/μl)0.5μl、10×primestarbuffer10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、模板dna1μl、up引物(20μm)1μl、down引物(20μm)1μl、ddh2o補(bǔ)足到50μl。擴(kuò)增程序為：94℃，10min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min，共30個循環(huán)；72℃，10min。pcr產(chǎn)物送華大基因測序確證。
從lactobacillusplantarumatcc8041、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931分別得到d-α-羥基羧酸脫氫酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd；從bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931分別得到l-α-羥基羧酸脫氫酶基因bcldhl、lfldhl、wcldhl；從proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc8019、providenciarettgeridsm1131、ignatzschinerialarvaedsm13226分別得到l-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、mmaao、praao、ilaao；從komagataellaphaffiiatcc7627、bacillussubtilisatcc13952、pseudomonasabietaniphilaatcc70068分別得到可還原nad(p)的酶基因kpfdh、bsgdh、papdh。
(3)pqlinkn單功能基因質(zhì)粒構(gòu)建
酶切體系為：10×cutbuffer5μl，dna10μl，限性內(nèi)切酶1和限制性內(nèi)切酶2各1μl，無菌水33μl。將pqlinkn質(zhì)粒和步驟(2)中的pcr產(chǎn)物于37℃水浴下雙酶切1h。
由于各基因的限制性內(nèi)切酶位置的不同，有如下4種情況。
pqlinkn、lpldhd、lfldhl、bcldhl、pmaao、papdh、kpfdh用ecorⅰ和hindⅲ雙酶切。
pqlinkn、efmdhd、wcldhl用ecorⅰ和bsrgⅰ雙酶切。
pqlinkn、lfldhd、cmaao、mmaao、ilaao用hindⅲ和bsrgⅰ雙酶切。
pqlinkn、bsgdh、praao用hindⅲ和sphi雙酶切。
然后分別回收上述4種情況下的酶切產(chǎn)物，并于16℃水浴下連接12-16h。連接體系為：10×dnaligasebuffer2.5μl，dna片段8μl，載體dna2μl，t4dnaligase1μl，無菌水11.5μl共25μl。隨后在連接體系中加入100μldh5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。立即冰浴2min。加入1ml不含抗生素的lb培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。最后將菌體均勻涂布在含氨芐青霉素的lb平板上，培養(yǎng)24h，然后提取質(zhì)粒，雙酶切驗證其正確性，同時進(jìn)行dna測序以保證其準(zhǔn)確性，最后保存正確轉(zhuǎn)化子，得到如下質(zhì)粒：
含有d-α-羥基羧酸脫氫酶基因的pqlinkn-lpldhd、pqlinkn-efmdhd、pqlinkn-lfldhd；含有l(wèi)-α-羥基羧酸脫氫酶基因的pqlinkn-lfldhl、pqlinkn-bcldhl、pqlinkn-wcldhl。以下將這些質(zhì)粒稱為pqlinkn-a質(zhì)粒，a代表一種羥基羧酸脫氫酶基因。
含有可還原nad(p)的酶基因的pqlinkn-kpfdh、pqlinkn-bsgdh、pqlinkn-papdh。以下將這些質(zhì)粒稱為pqlinkn-b質(zhì)粒，b代表一種可還原nad(p)的酶基因。
含有l(wèi)-氨基酸氧化酶基因的pqlinkn-pmaao、pqlinkn-cmaao、pqlinkn-praao、pqlinkn-mmaao、pqlinkn-ilaao。以下將這些質(zhì)粒稱為pqlinkn-c質(zhì)粒，c代表一種l-氨基酸氧化酶基因。
(4)氨基酸氧化酶、α-羥基羧酸脫氫酶基因、可還原nad(p)酶基因，三基因pqlinkn共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
pqlink-a質(zhì)粒中任選一個用swai，于25℃進(jìn)行酶切(10×cutbuffer3μl，質(zhì)粒4μl，swai1μl,無菌水22μl)，pqlink-b質(zhì)粒中任選一個用paci，于37℃進(jìn)行酶切(10×cutbuffer3μl，質(zhì)粒4μl，paci1μl，無菌水22μl)，酶切之后分別回收得到含a基因和b基因的片段。分別用licqualifiedt4dna聚合酶對回收的片段進(jìn)行處理，處理pqlink-a質(zhì)粒緩沖液成分為50mmtris-hcl，ph8.0，10mmmgcl2，5μg/mlbsa，5mmdtt，2.5mmdgtp，處理pqlink-b質(zhì)粒緩沖液成分為50mmtris-hcl，ph8.0，10mmmgcl2，5μg/mlbsa，5mmdtt，2.5mmdctp。于25℃水浴30min，然后在65℃水浴20min進(jìn)行l(wèi)icqualifiedt4dna聚合酶的熱滅活。分別取經(jīng)t4dna聚合酶處理過的基因a和基因b各5μl進(jìn)行混合。在65℃條件下水浴5min，然后在25℃的條件水浴30min進(jìn)行低溫退火。加入2μledta(25mm/l)，得到連接質(zhì)粒。隨后在連接體系中加入100μl大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)菌，輕混勻，冰浴30min。放入預(yù)熱的42℃水浴中，放置90s進(jìn)行熱休克處理。立即冰浴2min。加入1ml不含抗生素的lb培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1h使菌體復(fù)蘇。最后將菌體均勻涂布在含氨芐青霉的lb平板上，培養(yǎng)24h，然后提取質(zhì)粒，雙酶切驗證其正確性，同時進(jìn)行dna測序以保證其準(zhǔn)確性，保存正確轉(zhuǎn)化子，得到質(zhì)粒pqlinkn-a-b。
最后pqlinkn-c質(zhì)粒用pqlinkn-a的處理方法進(jìn)行處理，pqlinkn-a-b用pqlinkn-b的處理方法進(jìn)行處理，重復(fù)上述過程，得到pqlinkn-c-a-b質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌m15感受態(tài)中，保存?zhèn)溆谩?/p>
本實(shí)施例最終構(gòu)建了如下12株工程菌：大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lpldhd-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-lpldhd-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-wcldhl-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-wcldhl-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-praao-lfldhd-papdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-ilaao-wcldhl-papdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-mmaao-efmdhd-kpfdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-mmaao-bcldhl-kpfdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lfldhd-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lfldhl-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-bcldhl-bsgdh、大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-efmdhd-bsgdh。
實(shí)施例2
實(shí)施例1中獲得的基因工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)。
挑取構(gòu)建好的基因工程菌單菌落接種于10mllb培養(yǎng)基中(含0.1g/l氨芐青霉素)，37℃培養(yǎng)12小時，2％的體積比接種于lb培養(yǎng)基中(1000ml搖瓶裝液200ml，含0.1g/l氨芐青霉素)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5hr，至細(xì)菌對數(shù)生長期(od600達(dá)0.6-0.8)，加iptg到濃度為0.4mm，20℃，200rmp條件下培養(yǎng)8h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，20℃、8000rpm、20分鐘離心收集細(xì)胞。根據(jù)轉(zhuǎn)化所需菌體量，可增加搖瓶數(shù)量以獲得充足的菌體。
實(shí)施例3
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lpldhd-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，考察不同底物分別與全細(xì)胞混合后的轉(zhuǎn)化情況，底物終濃度為0.5g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為7.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，各類底物的反應(yīng)情況如下表所示。
表2大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lpldhd-bsgdhcf對不同底物的轉(zhuǎn)化情況
實(shí)施例4
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-lpldhd-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，考察不同底物分別與全細(xì)胞混合后的轉(zhuǎn)化情況，底物終濃度為0.5g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為7.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，各類底物的反應(yīng)情況如下表所示。
表3大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-lpldhd-bsgdh對不同底物的轉(zhuǎn)化情況
實(shí)施例5
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-wcldhl-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，考察不同底物分別與全細(xì)胞混合后的轉(zhuǎn)化情況，底物終濃度為0.5g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為7.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，各類底物的反應(yīng)情況如下表所示。
表4大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-wcldhl-bsgdh對不同底物的轉(zhuǎn)化情況
實(shí)施例6
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-wcldhl-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，考察不同底物分別與全細(xì)胞混合后的轉(zhuǎn)化情況，底物終濃度為0.5g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為7.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，各類底物的反應(yīng)情況如下表所示。
表5大腸桿菌m15/pqlinkn-pmaao-wcldhl-bsgdh對不同底物的轉(zhuǎn)化情況
實(shí)施例7
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-praao-lfldhd-papdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-半胱氨酸濃度為0.1g/l，亞磷酸濃度為1g/l，調(diào)節(jié)ph為4.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度20℃，轉(zhuǎn)化12小時后測定結(jié)果，生成(2r)-2-羥基-3-巰基丙酸，濃度為51mg/l，％e.e.>99。
實(shí)施例8
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-ilaao-wcldhl-papdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-半胱氨酸濃度為0.1g/l，亞磷酸濃度為1g/l，調(diào)節(jié)ph為4.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度20℃，轉(zhuǎn)化12小時后測定結(jié)果，生成(2s)-2-羥基-3-巰基丙酸，濃度為77mg/l，％e.e.>99。
實(shí)施例9
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-mmaao-efmdhd-kpfdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-苯氨酸濃度為10g/l，甲酸鈉濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為8.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為10g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，生成(r)-3-苯基乳酸，濃度為9.8g/l，％e.e.>99。
實(shí)施例10
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-mmaao-bcldhl-kpfdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-苯氨酸濃度為10g/l，甲酸鈉濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為8.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為10g(濕重)，溫度30℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，生成(s)-3-苯基乳酸，濃度為9.6g/l，％e.e.>99。
實(shí)施例11
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lfldhd-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-多巴為1g/l，葡萄糖濃度為1g/l，調(diào)節(jié)ph為6.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為1g(濕重)，溫度25℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，生成(r)-3,4-二羥基苯基乳酸，濃度為280mg/l，％e.e.>99。
實(shí)施例12
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-lfldhl-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-苯氨酸濃度為1g/l，葡萄糖濃度為5g/l，調(diào)節(jié)ph為7.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為15g(濕重)，溫度35℃，轉(zhuǎn)化24小時后測定結(jié)果，生成(s)-3-苯基乳酸，濃度為920mg/l，％e.e.>99。
實(shí)施例13
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-bcldhl-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-苯氨酸濃度為1g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為4.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為10g(濕重)，溫度15℃，轉(zhuǎn)化8小時后測定結(jié)果，生成(s)-3-苯基乳酸，濃度為220mg/l，％e.e.>99。
實(shí)施例14
根據(jù)實(shí)施例2所述誘導(dǎo)表達(dá)方法，將重組大腸桿菌m15/pqlinkn-cmaao-efmdhd-bsgdh誘導(dǎo)表達(dá)完成后收集菌體，于100ml反應(yīng)體積中，l-亮氨酸終濃度為1g/l，葡萄糖濃度為10g/l，調(diào)節(jié)ph為6.0，添加新鮮全細(xì)胞重量為20g(濕重)，溫度40℃，轉(zhuǎn)化0.5小時后測定結(jié)果，生成(2r)-2-羥基-4-甲基戊酸，濃度為181mg/l，％e.e.>99。
以上所述的l-氨基酸氧化酶、(d/l)-α-羥基羧酸脫氫酶、可還原nad(p)的酶及其共表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建、菌體的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法和全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則和精神之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均就包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>江南大學(xué)
西北大學(xué)
<120>一種工程菌及其應(yīng)用
<130>2017.8.1
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