本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測花生過敏原arah6基因的lamp引物組合物、檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

食物過敏是機體免疫系統(tǒng)對某些食物產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)，相應(yīng)的免疫球蛋白會和這些食物結(jié)合，釋放出很多化學(xué)物質(zhì)，引起過敏癥狀(如惡心、嘔吐、濕疹等)，嚴(yán)重者會導(dǎo)致過敏性休克發(fā)生。世界糧農(nóng)組織1995年報告，90％以上的食物過敏是由花生、大豆、牛奶、雞蛋、魚、貝類產(chǎn)品、堅果類等引起。據(jù)報道，花生是重要的食物過敏原，占食物過敏的10％～47％，其可引起過敏性腸炎、過敏性胃炎等過敏性疾病，嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)生過敏休克和過敏性死亡。美國和歐盟等都要求在相應(yīng)的商品上標(biāo)明是否含有花生，以避免過敏患者誤食而引起癥狀。因此對于商品是否含有花生過敏原的抽檢，找到一種快速、簡單的檢測方法顯得尤為重要。

花生(peanut)在我國產(chǎn)量豐富、食用廣泛，是我國上世紀(jì)90年代食物結(jié)構(gòu)改革與發(fā)展綱要中提出的重點開發(fā)利用植物蛋白之一。但隨著食用量的增加，引起過敏發(fā)病的幾率不斷上升。目前國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認(rèn)可的花生過敏原有arah1、arah2、arah3、arah4、arah5、arah6、arah7、arah8、arah9、arah10、arah11等11種。arah6是花生中的過敏原之一，屬于2s白蛋白家族。arah2和arah6同為2s清蛋白家族成員，兩者的氨基酸序列有59％相似，尤其是中間部分和c末端的蛋白序列更為相似。近年來，研究花生過敏原arah6蛋白在過敏反應(yīng)中的作用顯得尤為重要。

不言而喻，對檢測食品中是否含有花生過敏原具有十分重要的意義。目前，檢測花生過敏原主要有以下兩種檢測方法：

1)檢測花生過敏原蛋白成分，如酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、質(zhì)譜法(maldi—tof/ms)、westernblotting檢測等方法；

2)檢測過敏原基因殘留，如pcr檢測技術(shù)，焦磷酸測序技術(shù)等，其中pcr檢測方法是最主要、最準(zhǔn)確的方法，但這類方法操作過程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；所使用的儀器比較昂貴，檢測也很耗時。另外電泳常用的eb染料為強致癌物質(zhì)，有較強毒性，且難以實行現(xiàn)場檢測。

因此，找到一種快速、簡單、安全的檢測花生過敏原的檢測方法顯得極為必要。

環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification，以下簡稱lamp法)是由notomi等建立的一種快速高效、特異性強的核酸等溫擴增技術(shù)，其具有快速簡單、操作方便、靈敏度高、容易普及、安全可靠等優(yōu)點，目前該技術(shù)尚未使用于檢測花生過敏原。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測花生過敏原arah6基因的lamp引物組合物，并提供一種含有上述lamp引物組合物的檢測試劑盒及使用該lamp引物組合物的檢測方法，本發(fā)明所述的檢測方法具有特異性強、響應(yīng)速度快、靈敏度高、結(jié)果判定簡單、操作簡便、價格低廉、應(yīng)用范圍廣等特點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于檢測花生過敏原arah6基因的lamp引物組合物，其包括兩條外引物(f3、b3)和兩條內(nèi)引(fip、bip)，這4條引物的核苷酸序列如下所示：

正向外引物f3(seqidno：1)：atcttcattgatcatatagcaca；

反向外引物b3(seqidno：2)：ggcttagtatgtgaggtacg；

正向內(nèi)引物fip(seqidno：3)：

atgcaaatactccaagattcccatttaattactacagcaaagcctga；

反向內(nèi)引物bip(seqidno：4)：

gcatgaaaatgtaacgtggaagctaaagggaatggagggtgg。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有上述lamp引物組合物的用于檢測花生過敏原arah6基因的試劑盒。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述試劑盒，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，該試劑盒還包括lamp工作液、熒光指示劑和bstdna聚合酶。

優(yōu)選地，所述lamp工作液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20。

優(yōu)選地，所述熒光指示劑選自sybrgreen、evergreen、picogreen、syto系列中的至少一種；更優(yōu)選為sybrgreen，更具體的說為sybrgreenⅰ。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括顯色劑。

優(yōu)選地，所述顯色劑選自hnb、calcein、甲酚紅、酚紅、間甲酚紫、溴甲酚紫、中性紅、萘酚酞和百里酚藍(lán)；更優(yōu)選為中性紅(neured染料)。

優(yōu)選地，該試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為含有花生過敏原基因的樣品稀釋液，所述陰性對照為不含花生過敏原基因的去離子水。

優(yōu)選地，該試劑盒的檢測限為0.4ng/μl。

在本發(fā)明一實施例中，一種用于檢測花生過敏原arah6基因的試劑盒包含以下組分：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)熒光指示劑：sybrgreen?。?/p>

3)引物液：seqidno：1～seqidno：4所示的引物，4條引物濃度都為100μm；

4)bstdna聚合酶：濃度為8u/μl；

5)顯色劑：neured染料(500um)；

6)對照：陽性對照為含有花生過敏原基因的樣品稀釋液，陰性對照為不含花生過敏原基因的去離子水。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種非診斷和治療目的的用于檢測花生過敏原arah6基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1)采用ctab法提取純化待測樣品的dna；

步驟2)用上述lamp引物組合物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)；

步驟3)結(jié)果判斷：根據(jù)是否出現(xiàn)“s”型擴增曲線判斷擴增結(jié)果，和/或根據(jù)反應(yīng)體系是否出現(xiàn)顏色變化判斷擴增結(jié)果。

優(yōu)選地，所述步驟2)的具體操作過程如下：在pcr八聯(lián)管中配制反應(yīng)混合體系：lamp工作液16.7μl，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，顯色劑neured染料1μl，樣品dna5μl，用含有花生過敏原arah6基因替代待檢dna設(shè)置陽性對照，用不含花生過敏原基因的去離子水替代待檢dna作為陰性對照。將配制好的體系均勻并離心，使pcr八聯(lián)管中沒有氣泡為止，于60～65℃反應(yīng)45～90min，同時采集熒光信號，并在95℃保持5min，最后降到室溫25℃即可；更優(yōu)選地，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件為63℃60min。

優(yōu)選地，上述步驟2)可采用熒光指示劑sybrgreenⅰ替換顯色劑neured染料，也可同時加入熒光指示劑sybrgreenⅰ和顯色劑neured染料。

可理解的是，在滿足恒溫擴增反應(yīng)的條件下，上述反應(yīng)混合體系中各試劑的濃度及用量均可進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，但采用上述體積及濃度的試劑，其擴增效果最佳，檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。

本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(lamp法)，根據(jù)靶基因設(shè)計的四條引物能特異性識別靶基因序列上的六個特異的區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)dna區(qū)啟動互補鏈合成，結(jié)果生成含有若干倍莖長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)。采用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的dna聚合酶(bstdna聚合酶)，在60～65℃對核酸進(jìn)行擴增反應(yīng)，反應(yīng)需在恒溫條件下進(jìn)行(如63℃)，反應(yīng)時間一般為60min左右，在45～90min的短時間內(nèi)擴增效率可以達(dá)到10⁹～10¹⁰個拷貝。加入模板dna，在63℃反應(yīng)60min后，在95℃保溫5min，終止反應(yīng)，降溫至室溫25℃。該反應(yīng)會產(chǎn)生大量白色沉淀，是由于在反應(yīng)發(fā)生有核酸大量合成時，從dntp析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中mg²⁺離子結(jié)合，生成了白色的焦磷酸鎂沉淀。

與pcr技術(shù)或其他技術(shù)相比，本發(fā)明具有特異性強、響應(yīng)速度快、靈敏度高、結(jié)果判定簡單、操作簡便、價格低廉、應(yīng)用范圍廣等特點，具體地來說，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1)特異性強：設(shè)計的4條引物對靶序列6個區(qū)域的識別保證了lamp擴增反應(yīng)的高特異性，可以從相差一個核苷酸的基因樣品中找出相應(yīng)的靶序列進(jìn)行等溫擴增。

2)響應(yīng)速度快：lamp技術(shù)能在60min內(nèi)完成高效率的基因擴增。

3)靈敏度高：lamp擴增的靈敏度是普通pcr擴增的10～100倍，所需模板數(shù)為10copies或者更少。

4)結(jié)果判定簡單：可根據(jù)熒光檢測儀上的熒光曲線判定結(jié)果，或者加入顯色劑，即可通過裸眼觀察反應(yīng)液的顏色變化來判定擴增結(jié)果，不需要經(jīng)過凝膠電泳檢測。

5)操作簡便，價格低廉：只需將反應(yīng)液配制好，在63℃恒溫水浴鍋中加熱60min左右即可判斷擴增與否。

6)應(yīng)用范圍廣：lamp擴增技術(shù)不僅可以用來檢測dna、rna，還可以通過聯(lián)合其他技術(shù)，如納米技術(shù)、核酸適配體技術(shù)，檢測microrna、蛋白質(zhì)以及金屬離子等。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一實施例中的花生特異性熒光檢測結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明一實施例中的不同產(chǎn)地花生熒光檢測結(jié)果圖；

圖3是本發(fā)明一實施例中的花生靈敏度熒光檢測結(jié)果圖(dna濃度分別為10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，單位ng/μl)；

圖4是本發(fā)明一實施例中的花生特異性比色檢測結(jié)果圖(1～8分別表示花生、開心果、大豆、杏仁、榛子、芝麻、核桃、芥末)；

圖5是本發(fā)明一實施例中的花生靈敏度比色檢測結(jié)果圖(1～6分別表示花生樣品濃度梯度：1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0，單位ng/μl)。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例一

本實施例為花生過敏原熒光檢測方法：

一、花生過敏原arah6基因的lamp檢測試劑盒，其包括lamp工作液、引物液、bstdna聚合酶、對照，具體如下：

1)lamp工作液：20mmtris-hcl(ph8.8，25℃)，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，8mmmgso4，0.1％tween-20；

2)熒光指示劑：sybrgreen??；

3)引物液：含有l(wèi)amp引物組合物，4條引物濃度都為100μm；4條引物為：

正向外引物f3：atcttcattgatcatatagcaca(seqidno：1)；

反向外引物b3：ggcttagtatgtgaggtacg(seqidno：2)；

正向內(nèi)引物fip：

atgcaaatactccaagattcccatttaattactacagcaaagcctga

(seqidno：3)；

反向內(nèi)引物bip：

gcatgaaaatgtaacgtggaagctaaagggaatggagggtgg

(seqidno：4)；

4)bstdna聚合酶：濃度為8u/μl；

5)對照：陽性對照為含有花生過敏原基因的樣品稀釋液，陰性對照為不含花生過敏原基因的去離子水。

二、利用上述試劑盒按以下方法對待測樣品進(jìn)行檢測：

1)采用ctab法提取純化待測樣品的dna；

a)取150mg花生或其他樣品放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反復(fù)加入3～4次，磨碎成粉末為止；

b)將上述粉末置于1.5ml離心管中，加入600ulctab，15ul蛋白酶k，在65℃條件下溫育30min；

c)加入500ultris飽和酚：氯仿：異戊醇(體積比25：24：1)混合液，強烈振蕩，12000r/min離心15min；

d)加入等體積的氯仿：異戊醇(體積比24：1)，上下顛倒混勻；12000r/min常溫離心15min；

e)吸取上清液加入等體積異丙醇，強烈振蕩后12000r/min離心10min，棄上清液；

f)將沉淀用70％乙醇反復(fù)洗滌2～3次，吸棄；

g)用60ulte緩沖液溶解dna沉淀(加入te緩沖液的量視dna沉淀多少而定)；

h)用dna/rna蛋白分析儀檢測其純度。

2)等溫擴增檢測：在pcr八聯(lián)管中配制反應(yīng)混合體系：lamp工作液17.7μl(包含熒光指示劑sybrgreeni1μl)，引物液1.3μl，bstdna酶1μl，樣品dna5μl，用含有花生過敏原arah6基因替代待檢dna設(shè)置陽性對照，用不含花生過敏原基因的去離子水替代待檢dna作為陰性對照。將配制好的體系均勻并離心，使pcr八聯(lián)管中沒有氣泡為止，于60～65℃反應(yīng)60min，同時采集熒光信號，并在95℃保持5min，最后降到室溫25℃即可。

3)結(jié)果判斷：根據(jù)是否出現(xiàn)“s”型擴增曲線判斷擴增結(jié)果。

如圖1所示，本實施例中花生特異性熒光檢測，陽性樣品出現(xiàn)“s”型擴增曲線，即為花生(圖1中黑色曲線)，其他陰性對照沒有擴增曲線，分別為開心果、杏仁、榛子、芝麻、大豆、核桃、水。

實施例二

本實施例采用實施一的檢測方法對不同產(chǎn)地花生進(jìn)行熒光檢測，其檢測結(jié)果如圖2所示。

通過對不同產(chǎn)地花生樣品(購買自宿州、慶陽、通州、正陽)進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)4個不同產(chǎn)地的花生樣品均有擴增信號(圖2)，其他陰性對照沒有擴增信號(陰性對照為大豆、開心果、杏仁、榛子、芝麻、核桃、芥末、水)。

實施例三

本實施例采用實施一的檢測方法對不同濃度的dna樣本進(jìn)行檢測，以對花生靈敏度進(jìn)行分析，dna濃度分別為10，1，1×10^-1，1×10^-2，1×10^-3，1×10^-4，1×10^-5，單位ng/μl，其熒光檢測結(jié)果圖如圖3所示。

根據(jù)圖3所示的花生靈敏度熒光檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10ng/μl和1ng/μl有擴增信號(圖3)，而其他濃度沒有擴增信號，可進(jìn)一步探索1ng/μl至0.1ng/μl區(qū)間的擴增信號，以進(jìn)一步確定檢測靈敏度。

實施例四

本實施例中試劑盒采用顯色劑neured染料替代實施例一中的熒光指示劑sybrgreenⅰ，其余均與實施例一相同。

本實施例中花生過敏原arah6基因特異性比色檢測，其結(jié)果如圖4所示，陽性樣品出現(xiàn)粉紅色(圖4中1所示)，其他樣品均是淡棕色，為陰性樣品(圖4中2～8所示，分別為開心果、大豆、杏仁、榛子、芝麻、核桃、芥末)。

本實施例還進(jìn)行花生過敏原arah6基因靈敏度比色檢測，其結(jié)果如圖5所示，出現(xiàn)粉紅色的樣品濃度依次為1.0、0.8、0.6、0.4ng/μl(即圖5中1～4)，其他淡棕色樣品濃度為0.2、0ng/μl(即圖5中5～6)，也即檢測限為0.4ng/μl。

雖然實施例一和實施例四為分別單獨采用熒光指示劑或顯色劑，但可理解的是，也可在同一反應(yīng)體系中同時加入熒光指示劑和顯色劑。

由上述實施例可知，本發(fā)明所述的檢測方法具有快捷迅速、操作簡單、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，適用于實時現(xiàn)場檢測。

以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海速創(chuàng)診斷產(chǎn)品有限公司；復(fù)旦大學(xué)；上海大學(xué)

<120>一種用于檢測花生過敏原arah6基因的lamp引物組合物及其試劑盒

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